Спосіб визначення вмісту метаболітів оксиду азоту у сироватці крові

Спосіб визначення вмісту метаболітів оксиду азоту в сироватці крові за допомогою спектрофотометричного методу, який відрізняється тим, що як розчинник стандартів та досліджуваних проб застосовують воду дистильовану, як реагент використовують N-1-нафтилетилендіамін, реакцію проводять при температурі +4°С, а оптичну щільність аналітів вимірюють при довжині хвилі 536нм. (19) (21) u200910081 (22) 05.10.2009 (24) 10.03.2010 (46) 10.03.2010, Бюл.№ 5, 2010 р. (72) КОЗАР ВАЛЕНТИНА ВІКТОРІВНА, КУДРЯ МАРІЯ ЯКІВНА, УСТЕНКО НОННА ВАСИЛІВНА, НІКІШИНА ЛЮДМИЛА ЄВГЕНІЇВНА, КРАВЧЕНКО СВІТЛАНА ВІКТОРІВНА (73) ДЕРЖАВНА УСТАНОВА "ІНСТИТУТ ПРОБЛЕМ ЕНДОКРИННОЇ ПАТОЛОГІЇ ІМ. В.Я. ДАНИ 3 Технічний результат - підвищення точності кількісної оцінки вмісту метаболітів оксиду азоту в сироватці крові. У розробленому способі у суміші для відновлення нітратів до нітритів не застосовують барій сірчанокислий, що зменшує час проведення реакції; після виконання усіх етапів реакції для визначення загальних метаболітів оксиду азоту немає жорстких обмежень у часі, що дозволяє провести вимірювання оптичної щільності не чітко через 30 хвилин, а навіть через декілька годин; оптичну щільність розчинів вимірюють при довжині хвилі, при якій згідно із знятого спектру розчину спостерігали максимальне поглинання; після визначення оптичної щільності проб концентрацію аналітів розраховують по стандартним розчинам, використовуючи коефіцієнт регресії [9]. Запропонований спосіб здійснюється таким чином. Досліджувану сироватку попередньо звільняють від глобулінів та альбумінів, для чого до 0,5мл сироватки додають спочатку 0,5мл 6% розчину ZnSO4, ставлять на холод на 10 хвилин, потім додають 0,5мл 0,5N розчину NaOH і знову ставлять на холод на 15 хвилин, помішуючи через кожні 5 хвилин. Після цього пробу центрифугують 20 хвилин при 4000об/хв. Надосадову рідину (супернатант) відбирають у чисту хімічну пробірку, усі проби повинні бути закриті пробками у зв'язку з тим, що метаболіти азоту є летючими сполуками. Для визначення вмісту метаболітів оксиду азоту (суми нітрит-іонів та відновлених до нітритів нітрат-іонів) в суху чисту пробірку вносять 30мг суміші, яка містить цинкового пилу (2г), сульфату марганцю (10г), лимонної кислоти (75г), сульфанілової кислоти (4г), N-1-нафтилетилендіаміну (2г), додають 0,5мл супернатанту, потім додають 0,5мл води дистильованої, закривають пробками. Струшують пробірки 2 хвилини, потім ставлять на 10 хвилин на холод (+4°С). Після цього проби витримують при кімнатній температурі 15-20 хвилин і вимірюють оптичну щільність (Y) на спектрофотометрі за довжини хвилі 536нм проти води дистильованої. Паралельно вимірюють за тих же умов оптичну щільність градуювального розчину, утвореного додаванням тих же реактивів до розчину калію азотнокислого (KNO3) з вмістом NO3- від 0 до 150мкмоль/л. Розраховують параметри рівняння регресії: Y=A+ВХ, де Y - оптична щільність градуювальних розчинів, X - концентрація градуювальних розчинів, мкмоль/л, А - вільний член, В - коефіцієнт регресії. Вміст метаболітів оксиду азоту у пробі, що досліджують, розраховують за рівнянням: X1=(Y1-A)/В де Y1 - оптична щільність досліджуваної проби, В - коефіцієнт регресії, розрахований за результатами градуювальних розчинів, А - вільний член, розрахований за результатами градуювальних розчинів. 48291 4 Суть корисної моделі ілюструється прикладом її конкретного застосування. Вміст метаболітів оксиду азоту визначали у сироватці крові інтактних половозрілих самиць-щурів. Значення показників знаходилися у межах від 12,5мкмоль/л до 31,9мкмоль/л. Наші дані співпадають з даними інших авторів. Так, наприклад, в роботі [10] було показано, що в контрольній групі пацієнтів в середньому вміст метаболітів азоту складав 23,4±1,6мкмоль/л. За даними авторів [11] у сироватці контрольної групи здорових людей рівень нітратів + нітритів знаходився у межах 14,4±3,6мкмоль/л. Таким чином, використання запропонованого способу для кількісної оцінки метаболітів оксиду азоту у сироватці крові є адекватним біологічним тестом. Література: 1. Suzuki Н., Menegazzi М., Carcereri de Prati A., Mariotto S., Armato U. Nitric oxide in the liver: physiopathological roles // Adv. Neuroimmunol. 1995. - Vol.5, N.4. - P.379-410. 2. Mitaka C, Yokoyama K, Imai T. Nitric oxide production is more prominent in off-pump than in onpump coronary artery bypass surgery // Anaesth Intensive Care. - 2007. - V.35, N4. - P.505-509. 3. Koch A., Zacharowski K, Boehm O, Stevens M, Lipfert P, von Giesen HJ, Wolf A, Freynhagen R. Nitric oxide and pro-inflammatory cytokines correlate with pain intensity in chronic pain patients // Inflamm Res. - 2007. - V.56, N1. - P.32-37. 4. Пат.98095152 UA, МПК А 31600 (1998.09), G01N33/52 (1998.09). Спосіб кількісного визначення нітрит-аніону в біологічній рідині / Коцюруба А.В., Семикопна Т.В., Вікторов О.П., Мітченко О.І., Буханевич О.М., Гула Н.М. (UA); заяви. Український науково-дослідний інститут кардіології ім. М.Д. Стражеско. 5. Метод определения нитрита/нитрата (NOx) в сыворотке крови / П.П. Голиков, Н.Ю. Николаева // Биомедицинская химия: Научно-практический журнал / НИИ биомедицинской химии РАМН (Москва). - 2004. - Том 50, N 1. - С.79-85. 6. Пат. 2309412 RU, МПК G01N33/84 (2006.01), G01N33/68 (2006.01). Способ оценки степени тяжести гестоза / Орлов А.В., Крукиер И.И., Погорелова Т.Н., Друккер Н.А., Афонина Т.A. (RU); заявитель ФГУ "Ростовский НИИ акушерства и педиатрии РОСЗДРАВА (RU). №2006101754/15; заявл. 2006.01.23; опубл. 2007.10.27. - Режим доступа: http://www.ntpo.com/patents_medicine/. 7. Методика определения нитратов и нитритов в кормах, овощах, бахчевых культурах, крови, патологическом материале, молоке и молочных продуктах / Утв. главным управлением ветеринарии Госагропрома СССР 18 июня 1986 г. - М., 1986. 7с. 8. Г. Шарло. Методы аналитической химии / М.: Химия, 1969. - 1204с. 9. Фотометрический метод определения нитратов и нитритов в биологических жидкостях: инструкция по применению / МЗ Республики Беларусь, 19 марта 2001 г., peг. № 91-0008. - Витебск, 2001. - 9с. 5 48291 10. Невзорова В.А., Захарчук Н.В., Плотникова И.В. Блокаторы медленных кальциевых каналов в предупреждении цереброваскулярных катастроф // Неврология. - 2007. - Т.9, №8. - С.14-17. Комп’ютерна верстка А. Рябко 6 11. Inan N., Yilmaz G., Surer H., Coskun O., Ucler S., Cavdar L., Inan L.E. Is there a role for nitric oxide activity in cervicogenic headache? // Funct Neurol. -2007. - Vol.22, N.3. - P.155-157. Підписне Тираж 26 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601