Спосіб визначення та вимірювання вмісту теплового білка тау в сироватці крові

Спосіб визначення та вимірювання вмісту теплового білка тау в сироватці крові шляхом імунофлюоресцентного методу, який відрізняється тим, що здійснюють імунофлюоресцентну реакцію з використанням первинних моноклональних мишачих анти-тау антитіл та вторинних моноклональних антитіл IgG (g) FITC кон'югованих. (19) (21) u200903613 (22) 13.04.2009 (24) 12.10.2009 (46) 12.10.2009, Бюл.№ 19, 2009 р. (72) ЛЕКОМЦЕВА ЄВГЕНІЯ ВОЛОДИМИРІВНА, ГОРБАЧ ТЕТЯНА ВІКТОРІВНА (73) ДЕРЖАВНА УСТАНОВА "ІНСТИТУТ НЕВРОЛОГІЇ, ПСИХІАТРІЇ ТА НАРКОЛОГІЇ АМН УКРАЇНИ" 3 навчий процес водночас кількох людей, необхідність виконання процедур раптово після відкриття наборів та неможливість зберігання дослідного матеріалу тривалий час), досить низька специфічність методу, наявність у складі методики небезпечних для здоров'я реактивів та відсутність візуалізації отриманих даних. У зв'язку з вищевикладеним, в основу корисної моделі поставлено задачу вдосконалення способу визначення та вимірювання вмісту теплового білку тау в сироватці крові імунофлюоресцентним методом з використанням первинних й вторинних моноклональних антитіл, що забезпечить покращення специфічності, чіткості та однозначності способу визначення та вимірювання вмісту тау білку в сироватці крові. Задача, яку покладено в основу корисної моделі, вирішується тим, що у відомому способі діагностиці в сироватці крові вивчається вміст патологічного тау білку в імунофлюоресцентної реакції з використанням первинних й вторинних моноклональних мишачих антитіл. Імуногістохімічний метод, який покладено в основу методу імунофлюоресцентного фарбування протеїну, дає змогу виявити субклітинний компонент за допомогою імунологічної флюоресцентної реакції. Цей метод відзначається надзвичайно високою специфічністю та чутливістю, та основане на конкурентному зв'язуванні моноклональних антитіл, які є специфічними до різних епітопів IgG (g) та IgM дослідних високо-глобулярних молекул тау протеїну. У нової методиці вперше застосовані як первинні, так й вторинні моноклональних мишачі антитіла, які вибірково зв'язуються з фосфорированной та нефосфорированою ізоформами тау білку з молекулярною вагою в межах 55-62kDa. За умов двохгодинного впливу моноклональних антитіл, які інкубують послідовно у термостаті з сироваткою, було продемонстровано вірогідне вище та точніше збільшення рівню тау білку у дослідному матеріалі на відміну від даних, отриманих при вимірюванні рутинним методом ІФА. До того ж, імунофлюоресцентний метод дає змогу не тільки лічити кількісні дані рівню тау білку, а також візуалізувати, обчислити та вивчити особливості функціонального розподілу його оптичної щільності та отримати електронні мікрофотографії. Таким чином, застосування корисної моделі в клініці надасть можливість за допомогою імунофлюоресцентного дослідження з використанням первинних й вторинних моноклональних антитіл точного та швидкого визначення рівню теплового білку тау в сироватці крові, що призводить до ранньої й чіткої діагностики аксонального пошкодження головного мозку, відображаючи тяжкість перебігу неврологічного захворювання, що, в свою чергу, призводить до своєчасного патогенетичного лікування. Спосіб діагностики виконують таким чином. У пацієнта одержують кров, відстоюють її при кімнатній температурі протягом години і заморожують при -20 - -30°С. Зразки, отримані від хворих, та стандарти, отримані від контрольної групи, інкубують з першими моноклональними мишачими Anti-t (Tau, clon 2) антитілами (Mouse Ascites Fluid; 44565 4 SIGMA, США) протягом 2 годин у термостаті при температурі +37°С. Після. інкубації зміст відмивається концентратом буферного фосфатносольового розчину, далі зразки й стандарти інкубують з вторинними антитілами, що мічені флюоресцентом специфічним до g ланок IgG (g-chain specific; affinity isolated antigen specific antibodies) протягом години при температурі +22°С. Після другої інкубації зміст знову відмивається концентратом буферного фосфатно-сольового розчину з твином для вилучення не зв’яжу вальних комплексів антитіл до тау білку. Для визначення концентрації тау протеїну в імунофлюоресцентної реакції використовують вимірювання флюоресцентного свічення, що проводиться з використанням імунофлюоресцентного мікроскопу «Olympus» BX41 (Японія) при збільшенні, х600: де коефіцієнт поглинанню (Seizuss) - 135. Далі формують базу даних з показників, вимірюваних методом ІФА (1 група) і порівнюють з нею показники, вимірювані імунофлюоресцентним методом (2 група). Розрахунок оптичної щільності (D) проводиться в умовних одиницях справлено з використанням десятичного логарифму (D = Log10Ftau/F0). Приклад В ході дослідження було обстежено 2 дослідницькі групи, де у хворих 1 групи, вміст тау білку в сироватці крові було визначено стандартним методом ІФА (модифікація elisa) згідно доданим інструкціям, та у хворих 2 дослідницької групи, вимірювання рівню тау протеїну в сироватці крові було зроблено новим імунофлюоресцентним методом з використанням первинних й вторинних моноклональних мишиних антитіл (Sigma, США). 1 дослідницьку групу (n = 23) було сформовано з 15 хворих на демієлінізуючу аутоімунну поліневропатію (1а підгрупа пацієнтів з запальною хворобою) та 8 хворих на бічний аміотрофічний склероз (16 підгрупа пацієнтів з нейродегенеративним захворюванням); середній вік обстежених хворих 1 групи складав 39,04±10,7 років (від 28 до 49 років); 2 дослідницьку групу (n = 23) було складено з тих самих хворих. Контрольна група складалася з 15 здорових осіб у віці від 22 до 32 років, середній вік якої складав 24,5±6,92, років, де тау було вимірюване двічі: методом ІФА та імунофлюоресцентним методом. Було показано, що як хворі 1 групи, так і хворі 2 групи мали високий рівень патологічного тау протеїну в сироватці крові порівняно зі здоровим контролем (р > 0,05). Показники даних рівню тау білку у хворих на демієлінізуючу аутоімунну поліневропатію та з нейродегенеративним захворюванням вимірюванні різними методами наведені у діаграмі (Фіг.1). На Фіг.1 зображена діаграма, що відображає вміст фосфорірованої та нефосфорірованої ізоформ тау білку з молекулярною вагою у межах 5562kDa в сироватці крові контролю (1), вимірюване ІФА та імунофлюоресцентним методом; «2» - хворі на демієлінізуючу аутоімунну поліневропатію, де тау було вимірюване ІФА та імунофлюоресцентним методом і «3» - хворі з нейродегенеративним захворюванням, де тау також було вимірюване різними методами. 5 44565 Особи контрольної групи практично не мали в сироватці крові тау протеїну (негативний контроль). Вміст тау білку у хворих 1 групи порівняно з даними вмісту тау у хворих 2 групи суттєво не від 6 різнявся: але хворі 2 групи, що були обстежені імунофлюоресцентним методом, мають вірогідне вище та точніше (34 %) вміст тау білку порівняно з даними 1 групи (табл.). Таблиця Показники теплового білку тау в сироватці крові хворих 1 та 2 дослідницької груп, що було вимірюване рутинним методом ІФА та імунофлюоресцентним методами з використанням первинних й вторинних моноклональних антитіл Метод визначення теплового білку тау метод ІФА (1 група, n = 23) імунофлюоресцентний метод (2 група, n = 23) метод ІФА (контроль, n = 15) імунофлюоресцентний метод (контроль, n = 15) Стандартне відхиленСереднє значення від середнього знаня показника чення 1,01 0,3 1,12 0,001* 0,04 0,01* Примітка * (р