Спосіб отримання протикорового імуноглобуліну

Спосіб отримання протикорового імуноглобуліну шляхом етанолового фракціонування на холоді донорської плазми крові методом фільтрації, освітлення та стерилізації, який відрізняється тим, що здійснюють повторну концентрацію та стерилізацію для подальшого збільшення природних протикорових антитіл у титрах 1:960-1:1440. (19) (21) u200910042 (22) 02.10.2009 (24) 25.03.2010 (46) 25.03.2010, Бюл.№ 6, 2010 р. (72) СТЕПАНЧУК ВАЛЕНТИН АНДРІЙОВИЧ, РУБАН ВІКТОР ІВАНОВИЧ, МАРИЧЕВ ІГОР ЛЕОНІДОВИЧ (73) ДЕРЖАВНА УСТАНОВА "ІНСТИТУТ ГЕМАТОЛОГІЇ ТА ТРАНСФУЗІОЛОГІЇ АМН УКРАЇНИ" 3 ратурі - 65°С протягом 2-3міс, після чого з кожного пулу (3-5л.) або 500-600г осаду відбирають пробу 3-5мл (1-2г), визначають рівень антитіл до вірусу кору і при наявності антитіл у межах 1:80-1:125 та вище, приступають до виділення препарату протикорового імуноглобуліну. Антитіла до вірусу кору визначають методом імуноферментного аналізу (ІФА), використовуючи комерційні тест-системи фірми «ORGANON TECHNICA» (Нідерланди) або «SANAFI PASTER» (Франція), а РНК вірусу кору визначають за допомогою полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР) тест-системами фірми «Radium» (Російська Федерація). Приклад: 3-5л (або 500-600г) донорської етанолової плазми постійно змішують на магнітній мішалці в п'ятикратному об'ємі з 0,9%-м охолодженим хлоридом натрію. Отриману суміш залишають на ніч (12-14год.) при температурі холодильника +4°С, рН суміші 5,6-6,0. Наступного дня суміш центрифугують 30хв. при 2000-2500об/хв. на холоді. Осад видаляють, а в отриманому елюаті (надосаді) визначають кількість протеїну, який складає 0,180,22г білка в 1мл. Об'єм отриманого надосаду, в залежності від сировини, складає 250-300мл. Отриманий розчин розливають у 250мл стерильні флакони по 150мл, заморожують та кладуть у холодильну камеру при температурі - 4°С для стабілізації протягом 24-36год. Після чого здійснюють ліофілізацію препарату згідно з технологією про 48598 4 ведення ліофілізації імунобіологічних препаратів крові. Отриманий ліофілізований препарат, у вигляді білого порошку, закривають резиновими корками та завальцовують металевими ковпачками. При необхідності з отриманого порошку готують рідку лікарську форму протикорового імуноглобуліну 10%-ї концентрації за протеїном з активністю антитіл проти вірусу кору не менше 75МО/мл, до якого додають стабілізатор - 2% глюкозу і зберігають у темному місці протягом 6-7 діб при температурі +15, +18°С, фільтрують та розливають в ампули по 3-5мл, які зберігають при температурі побутового холодильника до застосування. Титри специфічних антитіл кожної серії виробленого протикорового імуноглобуліну визначають методом імуноферментного аналізу (ІФА), які складають від 1:960-1:1440, що в 2-3 рази більше, ніж у рідкому нормальному імуноглобуліні людини. Протикоровий імуноглобулін був отриманий згідно з «Настановою з якості по складанню аналітично-нормативної документації на імуноглобулін людини нормальний рідкий», затвердженої наказом МОЗ України 02.06.2005р. №247 (Настанова 42-3002-003-2005) [5]. Таким чином, отриманий специфічний алогенний протикоровий імуноглобулін відповідає необхідним вимогам до препаратів крові і може бути використаний як лікувально-профілактичний препарат серед широких верств населення (таблиця 1). Таблиця 1 № 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. Результати досліджень отриНормальний імуноглобулін людини маного протикорового імуногрідкий лобуліну Отримана прозора або злегка Прозора або злегка опалесцююча, опалесцююча, безбарвна або безбарвна або жовта рідина. У прожовта рідина. У процесі зберіОпис цесі зберігання можлива поява негання можлива поява незначзначного осаду, що зникає при струного осаду, що зникає при шуванні. струшуванні. А. При електрофоретичному дослідженні основні компоненти білкових фракцій повинні бути ідентичні за А. Отримані білкові фракції електрофоретичною рухомістю осідентичні. Автентичність (ідентифікація) новним білковим фракціям. Б. В препараті виявлені лише Б. В препараті повинні виявлятись білки крові людини. тільки білки крові людини. Білки тваринного походження повинні бути відсутні. Оптична густина повинна перевищуПрозорість Отримана 0,170 вати 0,165 Оптична густина не повинна переКольоровість 0,46 вищувати 0,5 Препарат має відповідати вимогам Механічні включення Відсутні РД42У-001-93 (відсутні) pH Від 5,0 до 7,2 7,0 Білок Від 0,09 до ОДІ білка в 1мл 0,10 в 1мл Склад білків. Імуноглобуліну не менше 95% від 97% Електрофоретична однорідність загального білка Найменування показників 5 48598 6 Продовження таблиці 1 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16. 17. На імунофореграмі повинна виявляlg G дуга 97,3% тись інтенсивна дуга преципітації lg lg А - 1,03% Фракційний склад та не більше 4-х додаткових дуг (lg lg M - 1,05% A, lg M) та двох інших імунологічно lg E - 0,40% неактивним фракціям (lg E, lg D). lg D - 0,22 Гліцин 1,5-3% 2,5% Вміст фракцій: полімери та агрегати Отримано: молімери та агреМолекулярні параметри - не менше 10%; гати - 12%, мономери та дімери - не більше 85% мономери та дімери -84% Стерильність Повинен бути стерильним Стерильний Пірогенність Повинен бути апірогенним Апірогенний Аномальна токсичність Нетоксичний Нетоксичний Не повинен містити поверхневого Специфічна безпечність антигену до вірусу гепатиту В та Тест негативний антитіл до вірусу ВІЛ 1/2 У препараті повинно бути не менше Визначення антитіл до вірусу Титр 1:960-1:1440 1:480 антитіл до вірусу кору в титрі кору (75-112,5МО/мл) 37,5МО на мл Зберігання При температурі від +2 до 8°С Від +2 до 6°С Інформаційні джерела: 1. Авт. свид. №1128913, МПК 5 А61В10/00. Способ получения гамоглобулина. / Фролов А.Ф., Степанчук В.А. и др.; Ин-т эпидемиологии и микробиологии МЗ Украины. Заявл. 12.01.83, опуб. 15.12.84. Бюл. №46. Перереестр, патент України №2045 А від 30.11.93. 2. Патент України №22426 А. Спосіб одержання антидифтерійного імуноглобуліну / Степанчук В.А., Федоровська О.О. та ін.; Ін-т гематології та трансфузіології МОЗ Україна. Заявл. 6.06.94, опубл. 5.12.95. 3. Патент України №11155, МПК С07К 16/08, А61К 39/395, А61К 39/205. Спосіб одержання антирабічного імуноглобуліну. / Степанчук В.А., Федоровська О.О. та ін.; Ін-т гематології та трансфу Комп’ютерна верстка М. Ломалова зіології МОЗ України. Заявл. 5.06.98, опубл. 1.11.99. 4. Деклараційний патент України №67984 А, МПК А61 B10/00,G01 №33/531; А 61 К 35/16, А 61 К 35/76 Спосіб отримання специфічного імуноглобуліну проти вірусних інфекцій «Поліімуноглобулін людський донорський» / Степанчук В.А.; Волковська Л.В., Процан О.І., Кнестяпін В.Н., Маричев І.Л.; заяви, і правовл. Український лікувальнодіагностичний центр. - №2003087256; завл. 01.08.03, опубл. 15.07.04. Бюл. №7. 5. Настанова з якості по складанню аналітично-нормативної документації на імуноглобулін людини нормальний рідкий. Затв. Наказом МОЗ України 02.06.2005р. №247. Підписне Тираж 26 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601