Спосіб збагачення магнетично очищених сd34 позитивних стовбурових гемопоетичних клітин

Спосіб збагачення магнетично очищених CD34 позитивних стовбурових гемопоетичних клітин, який полягає у стимуляції проліферативної активності магнетично очищених CD34 позитивних стовбурових гемопоетичних клітин, який відрізняється тим, що використовують сироватку кордової крові для підвищення ефективності колонієутворення магнетично очищених CD34 позитивних стовбурових гемопоетичних клітин для застосування у трансплантації. (19) (21) u200910399 (22) 14.10.2009 (24) 25.03.2010 (46) 25.03.2010, Бюл.№ 6, 2010 р. (72) КЛИМЕНКО СЕРГІЙ ВІКТОРОВИЧ, МІШАРІНА ЖАННА АНАТОЛІЇВНА, БАЛАН ВАЛЕНТИНА ВОЛОДИМИРІВНА, БЕБЕШКО ВОЛОДИМИР ГРИГОРОВИЧ (73) ДЕРЖАВНА УСТАНОВА "НАУКОВИЙ ЦЕНТР РАДІАЦІЙНОЇ МЕДИЦИНИ АКАДЕМІЇ МЕДИЧНИХ НАУК УКРАЇНИ" 3 стовбурових гемопоетичних клітин. Прискорення приживлення трансплантату магнетично очищених CD34 позитивних стовбурових гемопоетичних клітин можливе за умов підвищення його проліферативної активності. Поставлена задача запропонованого способу розв'язується шляхом додавання сироватки кордової крові до очищених CD34 позитивних стовбурових гемопоетичних клітин, заготовлених для проведення трансплантації. Біологічно активні речовини, що містяться в сироватці кордової крові стимулюють очищені CD34 позитивні стовбурові гемопоетичні клітини до проліферації, внаслідок чого відбувається підвищення ефективності колонієутворення цих клітин. Очікуваний клінічний ефект від використання суміші очищених CD34 позитивних стовбурових гемопоетичних клітин та одногрупної, за системою АВ0, сироватки кордової крові реалізуватиметься скороченням строків приживлення трансплантату, прискоренням імунологічного відновлення пацієнта та зниженням частоти інфекційних ускладнень аутологічної трансплантації. Проведене нами дослідження підтвердило із високою статистичною значущістю, що сироватка кордової крові, додана до суміші селекціонованих CD34 позитивних стовбурових гемопоетичних клітин стимулює їх проліферативну активність та підвищує ефективність колонієутворення. Забір пуповинної крові здійснювали під час пологів у здорових жінок віком від 21 до 32 років у сухі стерильні пробірки. Кров центрифугували при 1500об. впродовж 10 хвилин, відбирали сироватку, заморожували та зберігали при температурі -20°С для подальшого використання. Після курсу хіміотерапії хворим на онкогематологічну патологію проводилася мобілізація стовбурових гемопоетичних клітин за допомогою колонієстимулюючого фактору та лейкоцитаферез. Клітинну суміш кріоконсервували за вмісту DMSO 10% в рідкому азоті при тем 48629 4 пературі -196°С згідно загальновизнаної методики. Після швидкого розморожування та відмивання клітинної суміші від DMSO у 0,5% розчині альбуміну людини в PBS/EDTA буфері (Myltinyi Biotec, Німеччина), проводили позитивну селекцію CD34+ клітин за використання анти CD34 антитіл (клон АС 101) з магнітною міткою та інструменту CliniMACS згідно інструкцій виробника (Myltinyi Biotec). Селекція здійснювалась в автоматичному режимі під контролем мікропроцесору. Фракція CD34 позитивних клітин об'ємом 45мл вивільнялася в окремий мішок. Вміст CD34 позитивних клітин в кінцевій суміші за даними імунофенотипування перевищував 50%. Для підтвердження ефективності способу, що пропонується, порівнювали результати культивування магнетично очищених CD34 позитивних клітин та магнетично очищених CD34 позитивних клітин з додаванням сироватки кордової крові із розрахунку 1мл сироватки на 6 4x10 клітин. Культуральні дослідження проводили в стерильних чашках Петрі (d-35мм), в які вносили живильне середовище RPMI-1640, 20% фетальну телячу сироватку (Serva, США), рекомбінантний гранулоцитарно-макрофагальний фактор у концентрації 30нг/мл (Sigma, США), 3,3% агар (Merk, Німеччина), антибіотики (пеніцилін і стрептоміцин по 50од/мл, Фармак, Україна), суміш магнетично очищених CD34 позитивних клітин (щільність посі6 ву 1x10 на 1мл) та, паралельно, те саме, але з додаванням до суміші магнетично очищених CD34 позитивних клітин того ж самого хворого сироватки 6 кордової крові (щільність посіву 1x10 на 1мл). Культивування проводили в умовах абсолютної вологості при 5% концентрації СО2 і температурі 37°С протягом 14 днів. У таблиці 1 наведені значення ефективності колонієутворення готових до аутологічної трансплантації магнетично очищених CD34 позитивних клітин, та магнетично очищених CD34 позитивних клітин збагачених сироваткою кордової крові. Таблиця 1 Результати культивування магнетично очищених CD34 позитивних клітин без та зі збагаченням сироваткою кордової крові Ефективність колонієутворення Ефективність колонієутворення збагаЗразок CD34 пози- Діагноз хворо- CD34 позитивних клітин, кількість чених CD34 позитивних клітин, кількість 6 тивних клітин го колоній/1х10 експлантованих колоній/1x10 експлантованих клітин клітин Зразок 1 Лімфома 20,1 50,4 Зразок 2 Лімфома 26,7 53,8 Зразок 3 Лімфома 23,5 56,5 Зразок 4 Лімфома 30,2 60,3 Зразок 5 Лімфома 35,8 71,4 Зразок 6 Лімфома 32,5 67,9 Середнє значення 28,1±5,8 60,1±8,2* Примітка: * - p