Спосіб прогнозування запліднення ооцитів при лікуванні безплідності в програмі запліднення in vitro

Спосіб прогнозування запліднення ооцитів при лікуванні безплідності в програмі запліднення in vitro, що включає реєстрацію підвищення інтенсивності процесів перешеного окислення ЛІПІДІВ у Винахід відноситься до медицини, а саме до акушерства та гінекологи і може бути використаний в прогнозуванні ефективності запліднення ооцитів при лікуванні безплідності в програмі запліднення in vitro Відома велика КІЛЬКІСТЬ патологічних станів, при яких єдиним ефективним методом лікування безплідності є програма запліднення in vitro В даний час ця технологія отримала широке розповсюдження в усьому СВІТІ Ефективність лікування безплідності методом запліднення in vitro досягає в середньому 20 - 30% у розрахунку на одну спробу (Лечение бесплодия методом экстракорпорального оплодотворения / В И Грищенко, В И Пиняев, М П Петрушко, Л И Луцкая, И В Терпячая // Актуальные вопросы репродуктологии и криомедицины, — X , 1998 С 135- 138, Dale В, Elder К , In vitro fertilization // Cambridge university press — 1997 — P 102-107) З огляду на високу медичну і соціальну вагомість проблеми безплідності, актуальним є пошук причин невдач метода запліднення in vitro із метою підвищення ефективності лікування Не викликає сумніву, що морфологічна і функціональна ПОВНОЦІННІСТЬ ооцитів, отриманих у результаті індукції овуляції і використаних для подальшого запліднення in vitro, є чинником, необхідним для успішного лікування безплідності в програмі запліднення in vitro Фолікулярна рідина є природним середовищем, у якому відбувається ріст і дозрівання ооциту Склад фолікулярної ріди фолікулярній рідині, що знижує частоту запліднення ооцитів in vitro, який відрізняється тим, що здатність ооцитів до запліднення прогнозують по активності процесів перекисного окислення ЛІПІДІВ, оцінюючи концентрації малонового діальдепду (МДА) та дієнових кон'югатів (ДК), і при значеннях МДА 3,14 ± 0,12 нМоль/л, а ДК 11,2 ± 0,37 мкМоль/л прогнозують 0 - 33,3% запліднення ооцитів, при значеннях концентрації МДА 2,04 ±0,12 нМоль/л, а ДК 8,76 ± 0,59 мкМоль/л прогнозують 33,4 - 66,6%, при значеннях концентрації МДА 1,97 ± 0,09 нМоль/л, а ДК 8,41 ± 0,59 мкМоль/л прогнозують 66,7 -100% запліднення ооцитів ни не є постійним Динамічні біохімічні зміни, що відбуваються в ФР, здійснюють регуляцію і синхронізацію процесів дозрівання ооциту, овуляції, активації моторики маткових труб Склад фолікулярної рідини може служити біохімічним дзеркалом і відображати не тільки морфологічний, але і функціональний стан ооциту, його здатність до запліднення і розвитку повноцінного ембріона, або служити інструментом для прогнозування ефективності лікування безплідності Так, наприклад, відомий спосіб оцінки якості та ефективності процесів овуляції, дозрівання ооцитів, взаємодії гамет по активності перекисного окислювання ЛІПІДІВ в фолікулярній рідині (Takami M , Preston S L , Toyloy V А , Behrman Н R Antioxidants reversibly inhibit the spontaneous resumption of meiosis//Am J Physiol —1999 —V 276 — P 84 -88) Відомо також, що процеси перекисного окислювання ЛІПІДІВ потенційно небезпечні і відіграють ведучу роль у розвитку багатьох патологічних станів (Sadam G R, Nadkarm G D Role of tissue antioxidant defence in thyroid cancers // Cancer Lett — 1996 —V 109 — P 231 -235) Існують дані, що оксидативний стрес негативно впливає на розвиток ембріонів людини in vitro (Guerm P, El Mouatassim S , Menezo Y Oxidative stress and protection against reactive oxygen species in the preimplantation embryo and its surroundings // Hum Reprod Update —2001 — №7 — P 175-189) Встановлено, що реактивні кисневі сполуки со 00 48932 безпосередньо або побічно беруть участь у процесі дозрівання ооцитів, і їх синтез є важливим регулюючим фактором Пригнічення процесів перекисного окислювання ЛІПІДІВ у фолікулярній рідині блокує спонтанне поновлення мейотичного ділення ооцитів, а неконтрольоване підвищення інтенсивності процесів перекисного окислювання ЛІПІДІВ у фолікулярній рідині негативно впливає на ооцит, зменшуючи його здатність до запліднення in vitro, і погіршує морфологію ембріонів у програмі запліднення in vitro Вищезгаданий спосіб оцінки здатності ооцитів до запліднення in vitro, у якому інструментом служить інтенсивність процесів перекисного окислення ЛІПІДІВ, є найбільш близьким по технологічній суті і результату, який може бути досягнутим до того, що заявляється, тому його обрано в якості прототипу Основним недоліком відомих аналогів, в тому числі і прототипу, є те, що вони відмічають тенденції та властивості процесів перекисного окислення ЛІПІДІВ, що протікають в фолікулярній рідині в програмі запліднення in vitro, даючи їм якісну оцінку, але неспроможні точно спрогнозувати здатність ооцитів до запліднення із-за відсутності кількісної оцінки активності процесів перекисного окислення ЛІПІДІВ У зв'язку з вищевикладеним, в основу винаходу покладено задачу підвищення точності прогнозування запліднення ооцитів при лікуванні безплідності в програмі запліднення in vitro шляхом кількісної оцінки інтенсивності або активності процесів перекисного окислення ЛІПІДІВ в фолікулярній рідині Задача, яку покладено в основу винаходу, вирішується тим, що у відомому способі, що включає реєстрацію підвищення інтенсивності процесів перекисного окислювання ЛІПІДІВ у фолікулярній рідині, згідно з винаходом, запліднення ооцитів m vitro прогнозують по активності процесів перекисного окислювання ЛІПІДІВ, ОЦІНЮЮЧИ концентрації малонового діальдегіду (МДА) та дієнових кон'югатів (ДК) і при значеннях МДА - 3,14 ± 0,12нМоль/л, а ДК - 11,2 ± 0,37мкМоль/л прогнозують 0 - 33,3% запліднення ооцитів, при значеннях концентрації МДА - 2,04 ± 0,12нМоль/л, а ДК - 8,76 ± 0,59мкМоль/л прогнозують 33,4 - 66,6%, при значеннях концентрації МДА - 1,97 ± 0,09нМоль/л, а ДК 8,41 ± 0,59мкМоль/л прогнозують 66,7 - 100% запліднення ооцитів Можливість підвищення точності прогнозу була одержана завдяки КІЛЬКІСНІЙ ОЦІНЦІ активності процесів перекисного окислення ЛІПІДІВ у фолікулярній рідині МДА і ДК були обрані нами для оцінки інтенсивності процесів перекисного окислення ЛІПІДІВ в зразках фолікулярної рідини, яку досліджували тому, що ДК є ранніми продуктами перекисного окислення ЛІПІДІВ, тоді як МДА - кінцевий продукт, їхні виміри дозволяють комплексно оцінити перекисні процеси в матеріалі, що досліджується Спосіб виконують наступним чином Перед початком лікування всі безплідні подружні пари обстежують за загальноприйнятою методикою Серед спеціальних методів дослідження в обов'язковому порядку здійснюють ди намічне ультразвукове сканування органів малого тазу Дослідження проводять за допомогою вапнального секторального датчика з частотою сканування 7Мгц При індукції овуляції використовують загальноприйняті протоколи з наборами препаратів ФСГ (Metrodm, "Serono") і аналогів гонадотропш - рилізінг гормону (Suprefact, "Hoechst") Через 34 - 35 годин після введення тригерної дози ЧХГ (Profasi, "Serono") під ультразвуковим контролем здійснюють пункцію фолікулів і аспірацію ооцитів Відразу ж після пункції виявлені ооцити переносять з фолікулярної рідини у чисте середовище для культивування, У зразках фолікулярної рідини оцінюють процеси перекисного окислення ЛІПІДІВ, та прогнозують здатність ооцитів до запліднення m vitro Для оцінки інтенсивності процесів перекисного окислення ЛІПІДІВ у фолікулярній рідині використовують методи, що виявляють продукти перекисного окислення у досліджуваному середовищі, а саме, метод виміру концентрації продуктів, що реагують з тюбарбітуровою кислотою Продуктом, взаємодіючим із тюбарбітуровою кислотою, є МДА або його ПОХІДНІ Визначення МДА здійснюють за методом В Б Гаврилова та співавт Концентрацію МДА розраховують ВІДПОВІДНО ДО методики М С Гончаренко та співавторів Також використовують метод КІЛЬКІСНОГО визначення ДК за методом В Е Каган При значеннях МДА - 3,14 ± 0,12нМоль/л, а ДК - 11,2 ± 0,37мкМоль/л прогнозують 0 - 33,3% запліднення ооцитів, при значеннях концентрації МДА - 2,04 ± 0,12нМоль/л, а ДК - 8,76 ± 0,59мкМоль/л прогнозують 33,4 - 66,6%, при значеннях концентрації МДА - 1,97 ± 0,09нМоль/л, а ДК 8,41 ± 0,59мкМоль/л прогнозують 66,7 - 100% запліднення ооцитів Вищевказані значення концентрації МДА та ДК були одержані експериментальним шляхом Були сформовані КЛІНІЧНІ групи з різним відсотком запліднення ооцитів in vitro Результати визначення МДА і ДК у виділених групах представлено в таблиці Таблиця МДА КЛІНІЧНІ групи 1 група 66,7 - 100% запліднення (п = ЗО) 2 група 33,4 - 66,6% запліднення (п = ЗО) 3 група 0 - 33,3% запліднення (п = ЗО) ДК нМоль/л М ± м мкМоль/л М ± м 1,97 ±0,09 8,41 ±0,59 2,04 ±0,12 8,76 ± 0,59 3,14 ± 0,12 11, 2 ±0,37 Зазначені дані свідчили про значне підвищення маркерів оксидативного стресу у фолікулярній 48932 рідині, одержаної в групах з низьким відсотком запліднення ооцитів in vitro Достовірність розходжень оцінювали з використанням критеріїв Фішера-Ст'юдента Досліджені групи статистично не відрізнялися за віком пацієнток, КІЛЬКІСТЮ отриманих ооцитів і морфофункцюнальними властивостями еякуляту партнерів Статистичне достовірних розходжень між 1-й і 2-й групою за концентрацією МДА не було виявлено (Р > 0,05) Розходження за рівнем ДК між першою і другою групами були достовірними (Р < 0,05) Між першою і третьою групами розходження були достовірними як за рівнем ДК (Р < 0,05), так і МДА (Р< 0,01) Таким чином було встановлено, що концентрація продуктів перекисного окислення ЛІПІДІВ у фолікулярній рідині впливає на функціональні властивості ооцитів, що виражається в зниженні їх здатності до запліднення Даний спосіб ілюструють слідуючи приклади 1 Хвора Л , 27 років, (історія хвороби № 79) звернулася для лікування безплідності Термін хвороби - 5 років Із анамнезу відомо, що 7 та 5 років тому хвора була оперована з приводу позаматкової вагітності Обі маткові труби видалені В результаті обстеження протипоказань до лікування безплідності із застосуванням програми запліднення in vitro не було виявлено При індукції овуляції був використаний загальноприйняті протокол з використанням препаратів Metrodm, "Serono" і Suprefact, "Hoechst" Через 35 годин після введення тригерної дози Prof as і, "Serono", під ультразвуковим контролем була зроблена пункція фолікулів і аспірація ооцитів Спермограма мужа - без відхилень від норми Було отримано 6 зрілих ооцитів При біохімічному дослідженні в фолікулярній рідині рівень МДА -1,8нМоль/л, ДК - 8,0мкМоль/л Прогнозовано 66,7 -100% запліднення In vitro запліднилось 6 ооцитів (100% запліднення), розвилося 6 ембріонів, 4 з яких були перенесені в порожнину матки Через 2 тижні біохімічно встановлена вагітність 2 Хвора А , 28 років, (історія хвороби № 27) звернулася для лікування безплідності Термін хвороби - 4 роки Із анамнезу відомо, що 4 роки тому хвора була оперована з приводу позаматкової вагітності Права маткова труба видалена При рентгенологічнім дослідженні було встановлено, що ліва маткова труба блокована в ампулярному ВІДДІЛІ В результаті обстеження протипоказань до лікування безплідності із застосуванням програми запліднення in vitro не було виявлено При індукції овуляції був використаний загальноприйняті протокол з використанням препаратів Metrodm, "Serono" і Suprefact, "Hoechst' Через 35 годин після введення тригерної дози Profasi, "Serono", під ультразвуковим контролем була зроблена пункція фолікулів і аспірація ооцитів Спермограма мужа без відхилень від норми Було отримано 14 зрілих ооцитів та 2 ооцити з ознаками дегенерації При біохімічному дослідженні в фолікулярній рідині рівень МДА 2,9нМоль/л, ДК -11,0мкМоль/л Прогнозовано 0 - 33,3% запліднення In vitro запліднилось 5 ооцитів (31,3% запліднення), розвилося 5 ембріонів, 3 з яких були перенесені в порожнину матки Вагітність не настала Таким чином, спосіб що заявляється з високою достовірністю дозволяє прогнозувати здатність ооцитів до запліднення in vitro ДП «Український інститут промислової власності» (Укрпатент) вул Сім'ї Хохлових, 15, м Київ, 04119, Україна ( 0 4 4 ) 4 5 6 - 2 0 - 90 ТОВ "Міжнародний науковий комітет" вул Артема, 77, м Київ, 04050, Україна (044)216-32-71