Спосіб лікування черепно-мозкової травми за допомогою внутрішньошлуночкового введення катіонних ліпосом, які несуть плазмідний вектор з геном апое2

Спосіб лікування черепно-мозкової травми за допомогою внутрішньошлуночкового введення катіонних ліпосом, які несуть плазмідний вектор з геном апоЕ2, що є методом генної терапії, який відрізняється тим, що в цереброспінальну рідину шлуночків головного мозку вводять комплекс катіонних ліпосом та плазмідного вектора, який містить ген апоЕ2 під контролем цитомегаловірусного промотора. (19) (21) u200909601 (22) 18.09.2009 (24) 26.04.2010 (46) 26.04.2010, Бюл.№ 8, 2010 р. (72) БІЛОШИЦЬКИЙ ВАДИМ ВАСИЛЬОВИЧ, ПЕДАЧЕНКО ЄВГЕНІЙ ГЕОРГІЙОВИЧ, СЕМЕНОВА ВІРА МИХАЙЛІВНА, ГРИДІНА НІНА ЯКІВНА, ЦИБА ЛЮДМИЛА ОЛЕКСІЇВНА (73) ІНСТИТУТ НЕЙРОХІРУРГІЇ ІМ. А.П. РОМОДАНОВА АМН УКРАЇНИ 3 строченої загибелі септальних холінергічних нейронів. Спосіб Zou L.L., Huang L., Hayes R.L. et al. передбачає нейропротекцію переважно холінергічної системи головного мозку, тоді як ЧМТ викликає пошкодження й інших популяцій нервових клітин. Цей спосіб не містить також оцінки кореляції позитивних структурних і біохімічних змін зі змінами неврологічного й когнітивного статусу, тому залишається невідомим чи сприяють підвищення рівня ФРН у ЦНС і посилене виживання холінергічних нейронів після травми відновленню порушених функцій та поліпшенню наслідків травми. Задачею запропонованої корисної моделі є створення способу лікування черепно-мозкової травми за допомогою внутрішньошлуночкового введення катіонних ліпосом, які несуть плазмідний вектор з геном апоЕ2, який забезпечував би протекторний вплив на судинну систему й паренхіму головного мозку, гальмуючи розвиток його вторинних ушкоджень при черепно-мозковій травмі, і попереджав розвиток функціональних, зокрема неврологічних і когнітивних, наслідків травми. Це уможливить поліпшення ефективності лікування ЧМТ у експерименті та дасть перспективу розробки нових, більш ефективних способів лікування цієї патології з використанням методик генної терапії. Поставлена задача розв'язується завдяки тому, що в способі лікування черепно-мозкової травми за допомогою внутрішньошлуночкового введення катіонних ліпосом, які несуть плазмідний вектор з геном апоЕ2, в цереброспінальну рідину шлуночків головного мозку вводять комплекс катіонних ліпосом та плазмідного вектору, який містить ген апоЕ2 під контролем цитомегаловірусного промотора. Спосіб відтворюють наступним чином. кДНК гену апоЕ2 клонують у плазмідний вектор, який має цитомегаловірусний промотор та сигнал поліаденілування SV40, що дозволяє експресувати клоновані в ньому послідовності в еукаріотичних клітинах. Препарат катіонних ліпосом та плазмідної ДНК готується за 15 хвилин до внутрішньошлуночкової інфузії шляхом змішування їх водних розчинів при кімнатній температурі. Використовується препарат катіонних ліпідів DOTAP Methosulfate. Співвідношення ліпіди/ДНК, яке забезпечує найбільш ефективну трансфекцію, при застосуванні цього препарату складає 5:1. Для доставки препарату в головний мозок щурів після завдання їм ЧМТ використовуються осмотичні помпи ALZET, які заповнюються препаратом катіонних ліпосом, що містить плазмідний вектор з геном апоЕ2, безпосередньо перед установкою канюлі від помпи в боковий шлуночок. Застосовується модель помпи 2001D, яка забезпечує безперервну інфузію зі швидкістю 8мкл/год. упродовж 25 годин. Усього в боковий шлуночок мозку вводиться 25мкг плазмідної ДНК. Усі хірургічні процедури виконуються під загальною анестезією. Голову тварини фіксують у стереотаксичному апараті. Виконується поздовжній розріз скальпу завдовжки 2см з відкриттям bregma (точки перетину коронарного й сагітального швів черепа) та lambda (точки перетину сагітального й 49174 4 ламбдоподібного швів), або використовується розріз, зроблений при моделюванні ЧМТ. У підшкірному просторі спини щура, починаючи від нижнього краю розрізу, і далі через міжлопатковий простір, корнцангом формується кишеня для осмотичної помпи. У точці проекції переднього рогу бокового шлуночку за допомогою бормашини круглою фрезою на кістку склепіння черепа накладається фрезевий отвір. Використовуються такі стереотаксичні координати переднього рогу бокового шлуночку: позаду від bregma - 0,8мм, латерально 1,5мм, дорзовентрально - 4,8мм. Канюля завдовжки 5мм встановлюється через фрезевий отвір і фіксується до поверхні черепа зубним цементом. Осмотична помпа занурюється в підшкірну кишеню. Рана зашивається атравматичним швом. Пропонований спосіб застосовано в дослідженні з оцінки ефективності генної терапії при експериментальній ЧМТ в щурів. ЧМТ моделювалась падінням вантажу вагою 450г з висоти 1,5м (тяжка ЧМТ). Відразу після травми у боковий шлуночок головного мозку щурів основної групи виконувалась інфузія катіонних ліпосом, що містили плазмідний вектор pCMV SPORT6, у який під контроль цитомегаловірусного промотору вбудовувалась кДНК гену апо£2 (5 тварин). Контролем слугували інтактні щури (5 тварин) та тварини, яким виконувались усі хірургічні процедури крім інфузії препарату, що досліджувався (5 тварин). Неврологічний статус (ступінь порушення рухової функції) досліджували наступним чином. У день початку експерименту, до завдання травми, а також з 1-го до 7-го дня після травми оцінювали за 5-бальною уніфікованою [5] шкалою (від 0 - тяжкого ураження до 4 - нормальної сили чи рухової функції) наступні показники: 1) згинання лівої передньої лапки при підніманні тварини за хвіст; 2) згинання правої передньої лапки при підніманні тварини за хвіст; 3) згинання лівої задньої лапки, коли передні кінцівки перебувають на рівній поверхні, а задні піднімаються тягою хвіст; 4) згинання правої задньої лапки, коли передні кінцівки перебувають на рівній поверхні, а задні піднімаються тягою хвіст; 5) спроможність протистояти боковому поштовхові вліво; 6) спроможність протистояти боковому поштовхові вправо; 7) здатність стояти на похилій поверхні в лівій позиції; 8) здатність стояти на похилій поверхні в правій позиції; 9) здатність стояти на похилій поверхні в вертикальній позиції. У трьох останніх тестах максимальною оцінкою в 4 бали оцінюється здатність тварини стояти на площині, нахиленій під кутом у 40°, 3 бали - 37.5°, 2 бали - 35°, 1 бал - 32.5° та 0 балів