Спосіб лікування черепно-мозкової травми за допомогою ліпосомної трансфекції тканини головного мозку геном апое3

Спосіб лікування черепно-мозкової травми за допомогою ліпосомної трансфекції тканини головного мозку геном апоЕ3, що є методом генної терапії, який відрізняється тим, що в цереброспінальну рідину шлуночків головного мозку вводять комплекс катіонних ліпосом та плазмідного вектора, який містить ген апоЕ3 під контролем цитомегаловірусного промотора. (19) (21) u200909600 (22) 18.09.2009 (24) 26.04.2010 (46) 26.04.2010, Бюл.№ 8, 2010 р. (72) БІЛОШИЦЬКИЙ ВАДИМ ВАСИЛЬОВИЧ, ПЕДАЧЕНКО ЄВГЕНІЙ ГЕОРГІЙОВИЧ, МИХАЛЬСЬКИЙ СЕРГІЙ АНАТОЛІЙОВИЧ, КВІТНИЦЬКАРИЖОВА ТЕТЯНА ЮРІЇВНА, ГРИДІНА НІНА ЯКІВНА, ЦИБА ЛЮДМИЛА ОЛЕКСІЇВНА 3 матичного ударника на тверду мозкову оболонку. Ін'єкція вищезазначеного препарату в боковий шлуночок головного мозку виконувалась за допомогою стереотаксичної техніки. Описаний спосіб призводив до 9-12-кратного збільшення рівню ФРН у цереброспінальній рідині на 7-й та 12-й дні після введення препарату, що гальмувало процес відстроченої загибелі септальних холінергічних нейронів. Спосіб Zou L.L., Huang L., Hayes R.L. et al. передбачає нейропротекцію переважно холінергічної системи головного мозку, тоді як ЧМТ викликає пошкодження й інших популяцій нервових клітин. Цей спосіб не містить також оцінки кореляції позитивних структурних і біохімічних змін зі змінами неврологічного статусу, тому залишається невідомим чи сприяють підвищення рівня ФРН у ЦНС і посилене виживання холінергічних нейронів після травми відновленню порушених функцій та поліпшенню наслідків травми. Задачею запропонованої корисної моделі є створення способу лікування черепно-мозкової травми за допомогою ліпосомної трансфекції тканини головного мозку геном апоЕ3, який ефективно гальмував би формування вторинних ушкоджень головного мозку і попереджав розвиток функціональних, зокрема неврологічних і когнітивних, наслідків травми. Це уможливить поліпшення ефективності лікування ЧМТ у експерименті та дасть перспективу розробки нових, більш ефективних способів лікування цієї патології з використанням методик генної терапії. Поставлена задача розв'язується завдяки тому, що в способі лікування черепно-мозкової травми за допомогою ліпосомної трансфекції тканини головного мозку геном апоЕ3 в цереброспінальну рідину шлуночків головного мозку вводять комплекс катіонних ліпосом та плазмідного вектору, який містить ген апоЕ3 під контролем цитомегаловірусного промотора. Використання для лікування ЧМТ генної терапії, а саме ліпосомної трансфекції геном апоЕ3, дає можливість гальмувати формування вторинних ушкоджень головного мозку і попереджати розвиток функціональних, зокрема когнітивних, наслідків травми, а застосування доступних реактивів і устаткування робить пропонований спосіб відтворюваним і широкодоступним. Спосіб відтворюють наступним чином. кДНК гену апоЕ3 клонують у плазмідний вектор, який має цитомегаловірусний промотор та сигнал поліаденілування SV40, що дозволяє експресувати клоновані в ньому послідовності в еукаріотичних клітинах. Препарат катіонних ліпосом та плазмідної ДНК готується за 15 хвилин до внутрішньошлуночкової інфузії шляхом змішування їх водних розчинів при кімнатній температурі. Використовується препарат катіонних ліпідів DOTAP Methosulfate. Співвідношення ліпіди/ДНК, яке забезпечує найбільш ефективну трансфекцію, при застосуванні цього препарату складає 5:1. Для доставки препарату в головний мозок щурів після завдання їм ЧМТ використовуються осмотичні помпи ALZET, які заповнюються препаратом катіонних ліпосом, що містить плазмідний вектор з 49173 4 геном апоЕ3, безпосередньо перед установкою канюлі від помпи в боковий шлуночок. Застосовується модель помпи 2001D, яка забезпечує безперервну інфузію зі швидкістю 8мкл/год упродовж 25 годин. Усього в боковий шлуночок мозку вводиться 25мкг плазмідної ДНК. Усі хірургічні процедури виконуються під загальною анестезією. Голову тварини фіксують у стереотоксичному апараті. Виконується поздовжній розріз скальпу завдовжки 2см з відкриттям bregma (точки перетину коронарного й сагітального швів черепа) та lambda (точки перетину сагітального й ламбдоподібного швів), або використовується розріз, зроблений при моделюванні ЧМТ. У підшкірному просторі спини щура, починаючи від нижнього краю розрізу, і далі через міжлопатковий простір, корнцангом формується кишеня для осмотичної помпи. У точці проекції переднього рогу бокового шлуночку за допомогою бормашини круглою фрезою на кістку склепіння черепа накладається фрезевий отвір. Використовуються такі стереотаксичні координати переднього рогу бокового шлуночку: позаду від bregma - 0,8мм, латерально 1,5мм, дорзовентрально - 4,8мм. Канюля завдовжки 5мм встановлюється через фрезевий отвір і фіксується до поверхні черепа зубним цементом. Осмотична помпа занурюється в підшкірну кишеню. Рана зашивається атравматичним швом. Пропонований спосіб застосовано в дослідженні з оцінки ефективності генної терапії при експериментальній ЧМТ в щурів. ЧМТ моделювалась падінням вантажу вагою 450г з висоти 1,5м (тяжка ЧМТ). Відразу після травми у боковий шлуночок головного мозку щурів основної групи виконувалась інфузія катіонних ліпосом, що містили плазмідний вектор pCMV-SPORT6, у який під контроль цитомегаловірусного промотору вбудовувалась кДНК гену апоЕ3 (5 тварин). Контролем слугували інтактні щури (5 тварин) та тварини, яким виконувались усі хірургічні процедури крім інфузії препарату, що досліджувався (5 тварин). Порушення когнітивних функцій (просторової пам'яті та здатності до навчання) досліджували у водному лабіринті Мориса [3]. Для того, щоб наявний у перші дні після ЧМТ неврологічний дефіцит не впливав на здатність тварин плавати, дослідження виконували з 7-го до 10-го дня після травми. Упродовж 7-10 днів після травми виконували 16 тестів, у яких тварини вчаться знаходити приховану під поверхнею води платформу. Визначався показник «часу пошуку» - час (у секундах), витрачений твариною на досягнення платформи. Через 10 днів після ЧМТ щурів умертвляли. Мозок щурів вилучали для світлової та електронної мікроскопії, морфометрії (підрахунку кількості нейронів з урахуванням їхнього якісного складу, а також макро- й мікроглії на одиницю довжини - лінійної щільності (ЛЩ) нейронів і гліоцитів). Ефективність трансфекції в зразках тканини мозку підтверджувалась за допомогою методу RT-PCR. За даними RT-PCR, передбачувані продукти ПЦР розмірами 180 та 295 пар основ було виявлено в усіх зразках мозкової тканини щурів, які зазнали трансфекції геном апоЕ3. 5 49173 Через 10 днів після ЧМТ відмічено порушення цитоархітектоніки гіпокампу. Морфометричний аналіз показав зниження ЛЩ нейронів щурів у 1,4 рази. На цьому фоні відмічено зміни якісного складу їхньої популяції - збільшення кількості гіперхромних деструктивних форм (з 7,8% до 55,4%) за рахунок зниження незмінених (з 89,2% до 55,4%). ЛЩ макрогліоцитів збільшувалась на 41%, а мікрогліоцитів - у 4,5 рази. Було виявлено значні деструктивно-дистрофічні зміни в усіх клітинних елементах гіпокампу: набряк перікапілярних структур; пошкодження аксонів і мієліну (аж до його дезагрегації, порушення ламелярної структури, формування здуттів і випинань), порушення синаптичного апарату, а також дистрофічні зміни у вигляді значних накопичень ліпофусцину й залишкових тілець у нейронах і гліоцитах. При генній терапії відмічено зниження деструктивно-дистрофічних змін, викликаних ЧМТ. ЛЩ нейронів зменшувалась значно менше (на 24%) і покращувався якісний склад популяції (43,8% незмінених і 53,7% гіперхромних нейронів). ЛЩ макрогліоцитів збільшувалась на 23%, а ЛЩ мікрогліоцитів - у 3,7 рази. Структура аксонів і мієлінових оболонок у значній мірі нормалізувалась, знизилась кількість ліпофусцину й залишкових тілець у нейронах і перікапілярних ніжках астроцитів. Експериментальна ЧМТ викликала в тварин виразний дефіцит просторової пам'яті, значно погіршувала їхню здатність до навчання. У контрольній групі тварин з ЧМТ без лікування «час пошуку» зменшувався більш повільними темпами і в усі терміни дослідження достовірно перевищувало аналогічний показник інтактних тварин. В основній групі «час пошуку» був достовірно меншим порівняно з контролем на 7-у (78,2±2,27с і 86,4±2,32с відповідно), 8-у (49,0±1,41с і 74,2±2,27с), 9-у (12,8±1,02с і 46,2±2,03с) та 10-у (14,2±1,15с і 21,2±1,62с) добу, р