Спосіб підготовки біологічного об’єкта

Спосіб підготовки біологічного об'єкта, що включає його пошарове розрізування та профарбування зрізів, який відрізняється тим, що об'єкт попередньо розшаровують по 3 - 4 мм кожний зріз, який потім фарбують по Амадор, пускають в проводку, заливають у парафін, готують ГІСТОЛОГІЧНІ зрізи, які забарвлюють по Ніслю та гематоксилінеозином Винахід відноситься до медицини, а саме до морфометричних досліджень і може бути використаним в попередній ПІДГОТОВЦІ біологічного об'єкту В морфометричних дослідженнях важливим ланцюгом є попередня підготовка біологічного об'єкту, в тому числі його профарбування Для фарбування ГІСТОЛОГІЧНИХ препаратів застосовуються слідуючі види забарвлення Забарвлення гематоксилін-еозином виконують слідуючим чином приклеєні на предметних склах парафінові зрізи перед забарвленням звільняють від парафіну за допомогою ксилолу Препарат опускають в закриту склянку з ксилолом на 1-2 хвилини Після розчинення парафіну, ксилол ретельно змивають 96° спиртом і швидко переносять у воду (занурюючи зразу на дно чашки з водою) У воді залишають на 1-2 хвилини, до тих пір, поки він добре не відмиється 3 води препарати надходять в забарвлення На зріз наливають декілька крапель профільтрованого квасцьового гематоксилину (прямо з фільтра, використовуючи лійку), забарвлюють ЛАЛ-Ъ-Ъ хвилин, в залежності від якості та зрілості гематоксилину Притримують зріз на предметнім склі препарувальною голкою та зливають фарбу знову в робочу склянку, а препарат зі скла опускають в велику склянку з водою У воді промивають 3-5-10 хвилин, чекаючи посиніння зрізу Добре промитий та посинівший зріз витягають з води на предметне скло і наливають на нього декілька крапель розчину еозину Зливають еозин знову в робочу склянку, придержуючи зріз голкою Промивають у великій чашці з водопровідною водою УїЛ хвилину [Меркулов ГА Курс пато ги етологи ческой техники - Ленинград Медгиз, 1961, с 129-137] Забарвлення по Нислю виконують так забарвлюють при підігріванні над полум'ям спиртівки Підігрівання ведуть обережно до з'явлення перших пухирців на предметному склі Зрізи мусять бути сильно перефарбовані Після підігрівання парафінові зрізи розташовують у чашки Петрі зрізами вниз Далі полощуть у водопровідній воді 1-2 хвилини Слідуючим етапом є дифференціровка у чистому 96° спирті Дифференцюють під контролем мікроскопа, доки не виступлять деталі клітин Завершуючи обробку спиртом, зріз віджимають фільтрувальним папером, складеним у 3-4 шара, та просвітлюють ксилолом Після цього замикають в бальзам Найбільш використані барвники толуїдиновий синій, тюнин і крезиловий фіолетовий (крезилвюлет) у водних розчинах (на дистилированій воді), перші два в разведені 1 1000 і останій - 0,5% [Меркулов Г А Курс п ато ги етологи ческой техники Ленинград Медгиз, 1961, с 162 -165] Кожний з вищевикладених методів забарвлення не дає можливості встановити межі ядерних утворювань біологічних об'єктів Вісомий також спосіб забарвлення по L Amador виконують так кожній зріз занурюють в розчин №1, приготовлений з кристалічного фенолу, мідного купоросу і концентрованої соляної кислоти, на 1-2 хвилини, підігріваючи до температури 50 - 60°С Далі промивають у холодній воді та прекладають у розчин №2 холодний, який представляє 1% розчин хлорного заліза У цьому розчину матеріал тримають 2-3 хвилини, промивають і перекладають в розчин №3 також холодний, який представляє 1% розчин жовтої кров'яної солі або червоної кров'яної солі В цьому розчині матеріал ю ю 49545 держать до одержання потрібного забарвлення [Amador L Description of coordinates of the structures - Introduction to Stereotexis, Stuttgart, 1959, v I, p 1 6 - 2 8 ] Проте, ця методика може бути використана тільки для візуального визначення меж ядерних утворювань біологічних об'єктів Даний спосіб фарбування біологічного об'єкту є найбільш близьким до того, що заявляється, по технічній суті та результату, який може бути досягнутим, тому його обрано в якості прототипу У зв'язку з вищевикладеним в основу винаходу покладено задачу підвищення якості підготовки біологічного об'єкту шляхом підвищення інтенсифікації профарбування біологічного об'єкту Задача, яку покладено в основу винаходу вирішується тим, що у відомому способі підготовки біологічного об'єкту, що включає його пошарове розрізування та пофарбування зрізів, згідно з винаходом, об'єкт попередньо розшаровують по 3 4мм кожний зріз, які потім фарбують по Амадор, пускають в проводку, заливають у парафін, готують ГІСТОЛОГІЧНІ зрізи, які забарвлюють по Ніслюта гематоксилін-еозином Спосіб виконують наступним чином з фіксованого в 10% розчині формалину біологічного об'єкта виготовляють фронтальні зрізи товщиною 3 4мм Потім КОЖНИЙ зріз занурюють в розчин №1, який готують з кристалічного фенолу, мідного купоросу і концентрованої соляної кислоти, на 1-2 хвилини, підірпваючи до температури 50 - 60°С Далі зрізи промивають у холодній воді та перекладають у розчин №2 (холодний) - 1% розчин хлорного заліза У цьому розчині матеріал держать 2-3 хвилини, промивають і перекладають в розчин №3 (також холодний) - 1% розчин жовтої кров'яної солі В цьому розчині матеріал держать до одержання потрібного забарвлення, (забарвлення по L Amador) Далі пофарбовані в синій колір зрізи пускають в проводку, заливають в парафін по загальноприйнятій методиці Потім готують ГІСТОЛОГІЧНІ зрізи та забарвлюють їх по Ніслю та гематоксилінеозином Ефективність способу ілюструє слідуючий приклад фронтальні зрізи таламусу людини товщиною 3 - 4мм спочатку фарбують по Амадор, пускають в проводку, заливають в парафін, готують гістологічні зрізи, яки забарвлюють по Ніслю та гематоксилін-еозином Фотографії нейроно-гліально-капілярних співвідношень медіального ядра таламусу людини зправа зображують об'єкти, виготовлені по способу-прототипу, а зліва - того ж об'єкту, підготовленого за способом, що заявляється (див фігура) На фіг 1, 2, 3, 4 показані усі тканеві елементи таламусу людини - нейрони (1), гліальні клітини (2), капіляри (3) Однак, на фігурах 1 , 2 - підвищена інтенсивність забарвлення мозкової тканини, та представлені тканеві елементи безпосередньо в межах медіального ядра На фіг 3, 4 - низька інтенсивність забарвлення мозкової тканини, межі ядер таламусу не визначаються Для характеристики цитоанпоархітектоники таламусу людини підраховують в медіальному, вентролатеральному та передньому ядрах у кожнім з полей зору КІЛЬКІСТЬ нейронів, гліальних клітин та капілярів на визначеному відрізку, а також змірюють довжину цього відрізка Потім підраховують ЛІНІЙНІ показники лінійну ЩІЛЬНІСТЬ нейронів, гліальних клітин та капілярів Зображення, одержане на мікроскопі, за допомогою відеокамери упроваджують в комп'ютерну систему цифрового аналізу зображення, де за допомогою пакета прикладних програм в напівавтоматичному режимі проводиться його аналіз Планування та обробка результатів досліджень проводиться за допомогою методів математичної статистики і біометрії Запропонований нами спосіб попередньої підготовки біологічного об'єкту сприяє покращенню якості виготовлення ГІСТОЛОГІЧНИХ препаратів, підвищує інтенсивність їх профарбування, дає можливість підрахунку нейронів, гліальних клітин та капілярів безпосередньо в медіальному, вентролатеральному та передньому ядрах таламусу людини ФІГ.1 Фіг.2 Фіг.З Фіг.4 49545 ДП «Український інститут промислової власності» (Укрпатент) вул Сім'ї Хохлових, 15, м Київ, 04119, Україна ( 0 4 4 ) 4 5 6 - 2 0 - 90 ТОВ "Міжнародний науковий комітет" вул Артема, 77, м Київ, 04050, Україна (044)216-32-71