Спосіб визначення біоенергетичної характеристики клітинної реактивності

Спосіб визначення біоенергетичної характеристики клітинної реактивності, що включає реєстрацію і розподіл функціонально активних клітин за спектром люмінесцентного світіння, який відрізняється тим, що попередньо готують суспензію тест-клітин, визначають їх фагоцитарну активність, після чого досліджують люмінесценцію клітин фагоцитів із взятої проби та одночасно реєструють відсоткове співвідношення їх за кольором випромінюваного світла, зокрема зеленим, жовтим, оранжевим і червоним, а біоенергетичну характеристику клітинної реактивності оцінюють за інтегральним індексом ефективності клітинної біоенергетики IECB за допомогою формули: Корисна модель стосується медицини і біофізики, і може знайти застосування в клініколабораторній практиці для визначення функціональної спроможності клітин імунного захисту як в умовах фізіологічної норми, так і на фоні патологічного процесу, у тому числі під впливом чинників профілактично-лікувального спрямування. Відомий спосіб визначення біоенергетичної характеристики клітинної реактивності, що включає реєстрацію і розподіл функціонально активних клітин за спектром люмінесцентного світіння [1]. За відомим способом, у полі зору люмінесцентного мікроскопу досліджують ядровмісні клітини, зокрема, лейкоцити, макрофаги та інші і реєструють відсоткове співвідношення клітин, ядра яких висвічують зеленим, оранжевим і червоним світлом. Недоліком відомого способу є недостатня інформативність, що випливає з обмеження дослідження клітин лише за характером домінуючого спектру люмінесцентного випромінювання, залишаючи поза увагою прояви функціональної активності клітин - їх реактивності, наприклад, при відповіді на імунний подразник. До того ж, об'єднання в одну групу клітин, що флуоресціюють жовтим і оранжевим світлом, суттєво звужує діагностичну інформативність, оскільки не виявляє явище розходження ниток ядрової ДНК внаслідок інтоксикації інфектом або аналогічної дії іншого подразника. В основу корисної моделі поставлено завдання вдосконалити відомий спосіб, в якому шляхом введення додаткового технологічного етапу, спрямованого на відображення взаємозв'язку спектральної характеристики люмінесценції клітин із їх функціональною активністю – імунологічною реактивністю, досягають підвищення рівня інформативності а отже розширення сфери застосування. При вирішенні технічного завдання було взято до уваги те, що характер спектрального складу оптичного випромінювання ярових клітинних структур є відображенням руху вільних електронів збуджених світлом макромолекул нуклеїнових кислот, зокрема ДНК і РНК, що в свою чергу пов'язано із функціональною спроможністю клітин, тобто їх реактивністю [2, 3]. Важливим при цьому є те, що для кожного із станів ДНК ядер живих клітин, наприклад, лейко IECB PhA 1 : 3 G 2 Ye Or R 2 , (19) UA (11) 51275 (13) U де PhA - показник фагоцитарної активності, %; G - кількість "зелених" клітин у мікропрепараті, %; Ye - кількість "жовтих"клітин у мікропрепараті, %; Or - кількість "оранжевих"клітин у мікропрепараті, %; R - кількість "червоних" клітин у мікропрепараті, %. 3 51275 цитів, притаманним є висвічування у зеленій, жовтій, оранжевій і червоній спектральних ділянках. Так, розрив водневих зв'язків у процесі розплетення подвійної спіралі ДНК, що супроводжується ослабленням зеленого світіння ядерної субстанції, внаслідок сильної взаємодії між нуклеїновими основами відбувається посилення жовтої і оранжевої складових: за рахунок пари аденозин-тимін, а потім гуанін-цитизин - відповідно [4]. І хоч в організмі, як відомо, руйнація водневих зв'язків між спареними нуклеїновими основами в подвійній спіралі ДНК з наступною реасоціацією здійснюється постійно (оскільки підпорядкована виконанню біологічних функцій), та за умов in vitro ці процеси різко уповільнюються, завдяки чому картина люмінесценції в мікропрепараті точно відображає стан індукованої подразником метахроматичних перетворень у ДНК завдяки утворенню структур, що висвічують жовтим і оранжевим, які, власне, й відображають процеси реплікації ДНК. Саме тому з наведених позицій чітко проглядаються перспективи формування принципово нових діагностичних висновків, оскільки стає можливим глибше розкриття сутності інтимних процесів імунної перебудови піж впливом певних чинників як на рівні ізольованих клітин, так і цілісного організму. Виходячи з наведеного, у способі визначення біоенергетичної характеристики клітинної реактивності, що включає реєстрацію і розподіл функціонально активних клітин за спектром люмінесцентного світіння, відповідно до корисної моделі попередньо готують суспензію тест-клітин, визначають їх фагоцитарну активність, після чого досліджують люмінесценцію клітин-фагоцитів із цієї проби та одночасно реєструють відсоткове співвідношення їх за кольором випромінюваного ними світла, зокрема зеленим, жовтим, оранжевим і червоним, а біоенергетичну характеристику клітинної реактивності оцінюють за інтегральним індексом ефективності клітинної біоенергетики IECB за допомогою формули: 4 R - кількість «червоних» клітин у мікропрепараті, %. Спосіб здійснюють наступним чином. Готують робочу суспензію нативних клітинфагоцитів і здійснюють постановку реакцію фагоцитозу за відомою технологію, що включає етапи інкубації суміші клітин-фагоцитів з об'єктом фагоцитозу, наприклад, стандартизованим змивом мікробної тест-культури, виготовленням мазку на предметному склі, його фіксацією і фарбуванням та аналізом у полі зору мікроскопу з визначенням показника фагоцитарної активності (PhA) у вигляді відсотку активних фагоцитів до їх загальної кількості у мікропрепараті [5]. Окремо на предметне скло вміщують краплину робочої суспензії нативних клітин фагоцитів, вносять аналогічний об'єм водного розчину флуорохрому акридина оранжевого (АО) у розведенні 1:1000, покривають скельцем і досліджують у полі зору люмінесцентного мікроскопу. Користуючись формулою 1, визначають інтегральний індекс ефективності клітинної біоенергетики - IECB , який є відображенням затрати енергії клітини на здійснення нею умовної одиниці клітинної роботи у вигляді фагоцитозу. Оцінку ефективності клітинної біоенергетики здійснюють відповідно до критеріальних меж інтегрального індексу: при значеннях індексу 3 і більше ефективність визначають як високу, при значеннях індексу в межах від 2 до 2,99 - задовільну, в межах від 1 до 1,99 - понижену, а менше 1 - як низьку. Приклад 1. Тест-об'єктом клітин фагоцитів взяли 1мл робочої суспензії нативних лейкоцитів периферійної крові білої миші на 2% водному розчині натрію цитрату, внесли 0,1мл стандартизованої музейної культури стафілокока (штам 209) і інкубували при 37°С впродовж 1год. Далі у зафарбованому за Папенгеймом мазку визначили фагоцитарну активність. Вона становила 31%. Паралельно приготували на предметному склі мікропрепарат із нативних лейкоцитів робочої суспензії (0,05мл) , змішали їх із краплею водного розчину 1:10000 флуорохромного барвника АО і у полі зору люмінесцентного мікроскопу визначили відсотковий розподіл поліхромних клітин, тобто лейкоцитів, ядра яких висвічували відповідно зеленим G , (1) IECB PhA 1 : 3 G 2 Ye Or R 2 Де PhA - показник фагоцитарної активності, %; G - кількість «зелених» клітин у мікропрепараті, %; Ye - кількість «жовтих» клітин у мікропрепараті, %; Or - кількість «оранжевих» клітин у мікропрепараті, %; жовтим, Ye оранжевим Or і червоним R світлом. Отримані дані занесли до таблиці 1 і визначили інтегральний індекс ефективності клітинної біоенергетики - IECB . Таблиця 1 Вихідні показники PhA , % G,% Ye , % Or , % R,% Значення 26 88 4 6 2 Висновок IECB IECB 31 3 88 2 4 6 2,053 2 2 Ефективність клітинної біоенергетики задовільна 5 51275 Приклад 2. За запропонованим способом визначили ефективність клітинної біоенергетики макрофагів перитонеального ексудату білих мишей - інтактних, і на фоні попереднього введення антибіотика для відтворення імунного параліча [6]. Дослідним тваринам (6 особин) попередньо ввели внутрішньом'язово одноразово по 0,5 мл розчину пенциліну з розрахунку 1000 ОД/1 г маси. Після цього усім тваринам (6 дослідним і 5 контрольним) за 18 год до експерименту внутрішньоочеревинно ввели по 0,25 мл стерильного м'ясопептонного бульону з метою моделювання асептичного перитоніту. На наступну добу у кожної із тварин шприцем набирали перитональний ексудат, що містив перитональні клітини-фагоцити - макрофаги: з однією час 6 тиною проби ставили реакцію фагоцитозу, а з іншою - досліджували характер люмінесцентного світіння ядер макрофагів з наступним визначенням інтегрального індекса ефективності клітинної біоенергетики. При цьому загальний характер відсоткового розподілу макрофагальних клітин, ядра яких флуоресціювали зеленим G , жовтим, Ye оранжевим Or і червоним R світлом для зручності представлено проміжним показником у вигляді інтегрального люмінесцентного індексу ILI , визначеного за допомогою формули: (2) ILI : 3 G 2 Ye Or R 2 Результати дослідження наведені в табл. 2. Таблиця 2 Біоенергетична характеристика реактивності клітин-фагоцитів лабораторних тварин за умов експериментального асептичного перитоніту Групи спостереження n PhA,% ILI , % Контрольна Дослідна 5 6 26,9±3,2 4,3±0,9 12,2±3,1 18,5±3,5 Із наведених у табл. 2 даних видно, що ефективність клітинної біоенергетики значно вища у контрольних тварин (на 89,2%), порівняно із тваринами дослідної групи, що є відображенням порушень клітинного метаболізму внаслідок індукованого антибіотиком імунного паралічу, та свідченням високого рівня інформативності запропонованого способу. Отже, запропонований спосіб забезпечує вищий, ніж за способом-прототипом, рівень інформативності, і може знайти використання в клініколабораторній практиці для високоточної діагностики патологічних відхилень метаболічного гомеостазу на клітинному рівні. Комп’ютерна верстка Н. Лиcенко IECB абс. 2,147 0,232 % 100,0 10,8 Р