Спосіб визначення стану індивідуальної реактивності організму

Спосіб визначення стану індивідуальної реактивності організму шляхом доспідження ізольованих клітин крові, який відрізняється тим, що оцінюють адренореактивність тромбоцитів до- і після введення в організм блокатора циклооксигенази, наприклад аспірину, відтворюють криву доза-відповідь і у випадку її зсуву вліво на 10-30% у порівнянні з вихідними значеннями діагностують стан нормальної, вище 30% - підвищеної, а вправо більш, ніж на 10% - стан зниженої індивідуальної реактивності організму. Спосіб визначення стану індивідуальної реактивності організму мас відношення до галузі медицини та біології, зокрема, клінічної фізіології, і може бути яикористаний для оцінки індивідуальної реактивності організму по ізольованим клітинам крові в умовах поліклініки або стаціонару. Відомий спосб визначення стану «загальної* реактивності оріанізму [ І Васильєв В С , Васильева А Н Способ определения общей реактив • мости организма / Авторское свидетельство СССР №1274681. - М Кл А 61 В 10/00. - Бюл - 1986 - № 45], шляхом внутрішньошкірного введення niporeнапа « доз» 1-2,5 МПД і при розмірах еритеми від 4 до 10 мм діагностують нормальну загальну реактивність, при значеннях більш 10 мм - підвищену, а при значеннях менше 4 мм - знижену загальну реактивність організму Недопіком відомого способу € високий ступінь похибки і складність діагностики, яка пов'язана з тим, що для оцінки стану «загальної», а за сутністю - імунної, реактивності організму використовується такий непрямий метод, як вимірювання діаметра еритеми (термін «загальна» реактивність не кореми1*» використаний авторами, оскільки така дефініція відсутня в існуючих класифікаціях реактивності організму). Особливо наочно зазначений недолік виявляється у випадку, якщо ділянка шкіри, в якій є запалення (еритема), не має класичної форми кола Такий спосіб також не дозволяє враховувати резервні можливості реактивності організму, що виключає можливість її адекватної корекції, заради якої найчастіше проводиться таке дослідження. Найбільше близьким за технічною сутністю до способу, що заявляється, є спосіб виявлення реактивності імунної системи до дії стрес-чинників (2 Баєва Е В., Аресгова З Я Способ определения стресс-реактивности животных / Авторское свидетельство СССР №1716448 -М Кл. G 01 N 33/53. - Бюп - 1992. - № 8J шляхом вивчення ізольованих кл»тин крові зокрема, визначення рівня бласттрансформації лімфоцитів до' і після впливу стресчинників, » при зниженні цього показника до 30% після впливу стресора в порівнянні з пробою до його впливу визначають високу стрес-реактивність тварини, а при рівні бласттрансформації нижче 30% - низьку стрес-реактиеність Відомий спосіб забезпечує оцінку реактивності імунної системи організму на основі вивчення ступеня бласттрансформац'ї лімфоцитів in vitro до- і після впливу стресового чинника in vivo і мае ряд обмежень. Описаний підхід базується на факті перебудови метаболізму лімфоцитів під час активації симпато-адремалової системи за умов стресреакції і відбиває стан специфічної резистентності організму Недоліки способу полягають у тому, що, поперше, не враховується можливість модуляції хемосензитиеност» (чутливості) рецепторів, зокрема, з боку метаболітів арахідонової кислоти Останні розглядаються не тільки як важливий чинник, що лімітує стрес-реакції, але і як найважливіший регулятор міжклітинної взаємодії, що визначає ступінь індивідуально) реактивності організму. Випадання з аналізу цієї ланки відзначається на точності способу, так за запропонованим способом не CM W ю со в> 35321 діагностується нормальний рівень реактивності організму. По-друге, використання стрес-реакції в якості «обурюючого» чинника, спроможного змінити індивідуальну реактивність організму, накладає визначені обмеження на застосування цього способу серед людей, тим більше у хворих, оскільки важко дозувати силу впливу і контролювати плин побічних негативних реакцій (наприклад, виникнення вазоконстрикції). По-третє, спосіб має обмежені можливості діагностики, оскільки дозволяє оцінити тільки імунологічну реактивність, яка є одним з елементів індивідуальної реактивноегіорганізму. По-четверте, недоліками описаного способу с складність (багатоетапність) і тривалість постановки реакціТ бласттрансформації лімфоцитів. Так, за нашими даними, можливість визначення індивідуальної реактивності організму за описаним више способом не перевищує 50%. В основу винаходу поставлена задача визначення стану індивідуальної реактивності організму шляхом дослідження ізольованихклітин крові, оцінки адренореактивності тромбоцитів до- і після введення в організм блокатора циклооксигенази. наприклад аспірину, відтворення кривої доза-відповідь і у випадку її зсуву вліво на 10-30% у порівнянні з вихідними значеннями діагностують стан нормальної, вище 30% - підвищеної, а вправо більш, ніж на 10% - стан зниженої індивідуальної реактивності організму, що дає можливість оцінити ступінь модуляції хемосензитивності рецепторів клітин досліджуваного організму. Сутність способу, що заявляється, складається з дослідження ізольованих клітин крові, оцінки адренореактивності тромбоцитів до- і після введення в організм блокатора циклооксигенази, наприклад аспірину, відтворення кривої доза-відповідь і у вигадку її зсуву вліво на 10-30% у порівнянні з вихідними значеннями діагностують стан нормальної, вище 30% - підвищеної, а вправо більш, чим на 10% - стан зниженої індивідуальної реактивності організму. Новим у способі, що заявляється, є те, що досліджують адренореактивність тромбоцитів до- і після введення в організм блокатора циклооксигенази, наприклад аспірину, відтворюють криву доза-відповідь і у випадку її зсуву вліво на 10-30% у порівнянні з вихідними значеннями діагностують стан нормальної, вище 30% - підвищеної, а вправо більш, ніж на 10% • стан зниженої індивідуальної реактивності організму. Розробка способу, що заявляється, стала можливою завдяки таким науковим фактам. Поперше, найбільше точним критерієм оцінки функціонального стану клітин-цілей і, відповідно, стану індивідуальної реактивності організму, є дослідження їхнього рецепторного апарата за допомогою відповідних агоністів лбо антагоністів. Як показали наші дослідження, зміна значень кривої доза-відповідь до- і після.моделювання порушень реактивності організму (вимикання симпато-адреналової системи шляхом введення експериментальним тваринам гуанідина,гіперкальціємія,травматичний шок тощо), є інтегративним відбитком можливостей модуляції хемосензитивності рецепторів клітин досліджуваного організму. По-друге, уявляється можливим за допомогою аспірину (блокатор циклооксигенази - внутрішньоклітинного ферменту, що бере участь у метаболізмі арахідонової кислоти), оцінити ступінь модуляції хемосензитивності рецепторів клітин досліджуваного організму. Так, після одноразового введення щурам аспірину в стандартній дозі 10 мг/кг маси індивідуальна реактивність організму знижується на 20-30%. В основі такого явища лежить нівелювання модуляції хемосензитивності рецепторів різних клітин-цілей, про що може свідчити виявлене нами через 60 хв збільшення відношення циклічних аденозинмонофосфата і гуанозинмонофосфата (цАМФ/цГМФ) у клітинах крові (тромбоцитах, моноцитах і лімфоцитах) досліджуваних тварин. Через 6-24 годин абсолютний вміст цАМФ і цГМФ у тромбоцитах змінюється за різним ступенем, завдяки чому відношення цАМФ/цГМФ відновлюється до вихідного рівня. Новий рівень вторинних месенджерів є наслідком генетично детермінованої реалізації «структурного сліду» в організмі. Вторинні месенджери забезпечують реалізацію адаптаційних реакцій клітини, отже, визначають стан індивідуальної реактивності організму. Всяка штучна спроба змінити якісну або кількісну відповідь адаптаційної реакції організму супроводжується прагненням його регулюючих систем (гуморальної, нервової або імунної) відновити вихідний стан. При цьому in vivo є всі необхідні для цього умови (наявність функціонального зворотного зв'язку, субстратів окислення, О?, агоністів різних рецепторів тощо). Врахування функціональної відповіді ізольованих клітин не може бути значущим без урахування резервних можливостей регулюючих систем організму. Сполучення в межах способу етапів дослідження in vivo, що дозволяє оцінити наслідки вмикання резервної потужності регулюючих систем організму, з аналізом функціональної' відповіді клітин in vitro забезпечує оцінку ступеня модуляції хемосензитивності рецепторів клітин досліджуваного організму. Досягнення технічного результату даного способу засновано на оцінці in vitro адренореактивності тромбоцитів до- і після введення в організм блокатора циклооксигенази, що дозволяє запустити процес формування внутрішньоклітинного «структурного сліду». Наші дослідження показали, що, якщо на цьому фоні оцінювати розмір і напрямок зсуву значень кривої доза-відповідь тромбоцитів, то точність збігу результатів, отриманих in vitro, з клініко-лабораторними даними визначення стану індивідуальної реактивності організму підвищується до 90%. Реалізують спосіб таким чином. У хворого беруть венозну кров у силіконову пробірку з 3,8% лимоннокислим натрієм у пропорції 9:1. Збагачену тромбоцитами плазму (ЗТП) одержували шляхом центрифугування крові протягом 10 хв із швидкістю 1000 об/хв, тромбоцитарний осадок - центрифугуванням збагаченої тромбоцитами плазми протягом 15 хв із швидкістю 3000 об/хе. Отриманий осадок ресуспендували в плазмі, що бідна на тромбоцити, до концентрації 1x107 у 1 мол. Агрегацію та дезагрегацію тромбоцитів реєстрували модифікованим методом Bom 35321 et Howard шляхом вимірювання оптичної щільності світлового потоку, що проходить через суспензію клітин, на спектрофотометрі СФ-46 Перше (вихідне) дослідження проводять до введення в організм блокатора циклооксигенази - аспірину У 1-й серії тестів до клітин добавляють 0,1 мл фізіологічного розчину (1-й контроль), у 2-й серн в кожну пробу з суспензією тромбоцитів вводять по 0,1 мл ізадрина, кінцева концентрація якого ВІДПОВІДНО складає 10, 25 і 50 мкмоль/л Проби інкубують при 20°С протягом 8-9 хв, після чого визначають ступінь дезагрегації тромбоцитів у кожній пробі і за отриманими значеннями будують криву доза-ВІДПОВІДЬ Повторне аналогічне дослідження проводять через 6-24 годин після прийому аспірину в дозі 1 г на 70 кг маси Оцінюють дозозапежний напрямок зсуву і розмір зміни адрєнореактивності тромбоцитів, використовуючи побудовану криву доза-відповідь Якщо відбувається зсув значень кривої доза-відпо-, вщь вліво на 10-30% у порівнянні з вихідними значеннями, то діагностують стан нормальної, вище 30% - підвищеної, а вправо більш ніж на 10% стан зниженої індивідуальної реактивності організму Загоєння шкірної рани є класичним прикладом відбитка стану індивідуальної реактивності організму Цей процес обраний в якості об'єктивного критерію стану індивідуально* реактивності організму в конкретних прикладах реалізації способу, що заявляється Приклад 1. Хворий Н , 35 років, надійшов у хірургічне відділення з діагнозом гострий апендицит Висновок патоморфолопчного дослідження підтвердив КЛІНІЧНИЙ діагноз До оперативного втручання з венозної крові методом диференційованого центрифугування виділяли тромбоцити, у кожну пробу із суспензією тромбоцитів вводили по 0,1 мл ізадрина в кінцевій концентрації 10 25 і 50 мкмоль/л Проби інкубували при t=20°C протягом 8-9 хв після чого визначапи ступінь дезагрегаци тромбоцитів, що ВІДПОВІДНО склала 15% 3 1 % « 43% Виконана апендектомія У ранньому післяопераційному періоді до складу комплексної терапії був включений нестероідний протизапальний препарат аспірин (2 r/добу) з метою прогнозування загоєння рани, виходячи з визначення стану індивідуально) реактивності організму за запропонованим нами способом Через 24 години повторно проводили аналогічний тест із зростаючими концентраціями ізадрина Отримано такі результати при концентрації ізадрина 10 251 50 мкмоль/п сгупінь деээгрегації тромбоцитів склав ВІДПОВІДНО 27%, 4 1 % і 54% Ці дані свідчать, що крива доза ВІДПОВІДЬ зміщується вліво і розмір значень зсуву знаходиться в межах 10-12% - це відповідає стану нормальної індивідуально) реактивності організму t дозволяло прогнозувати нормальний плин репаративних процесів в області операційно» рани Прогноз збігався з КЛІНІЧНИМИ спостереженнями • плин післяопераційного періоду без ускладнень рана зажипа первинним натягом шви зняті на 7-й день після операції Приклад 2. Хворий П 27 років, надійшов у хірургічне відділення з діагнозом гострий апендицит який підтверджено наступним патоморфолопчним дос лідженням - флегмонозний апендицит До опера тивного втручання з венозної кроїм методом диференційованого центрифугування виділяли тром боцити у кожну пробу і суспензією тромбоцилв уводили по 0,1 мл ізадрина є кінцевій кон^ и граці) 10, 25 і 50 мкмоль/л Проби інкубували при t=20 C протягом 8-9 хв після чого визначапи ступ'нь де загрегацн тромбоцитів що ВІДПОВІДНО склала 18% 27% і 42% Виконана апендектомія У ранньому післяопераційному період» до складу комплексно» терапії був включений нестероідний протизапальний препарат - аспгрин (2 r/добу) із метою прогно зування загоєння рани виходячи з визначення стану індивідуальної реактивності органому за запропонованим нами способом ' Ієреї 24 години повторно проводили аналогічний тест із зростаючими концентраціями ізчдрина Отримано тякі результати при концентрації ізадрина 10, 75 і 50 мкмопь/п ступінь дезагрегацн тромбоцитів склав ВІДПОВІДНО 48% 63% і 76% Ці дані свідчать, що крива доза ВІДПОВІДЬ зміщується вліво і розмір значень зсуву знаходиться в межах 30-36% - це відповідає стану підвищеної індивідуальної реактивності організму і дозволяло прогнозувати відхилення від нормального ппину репаративних процесів в області операційної рани На 3 ю добу післяопераційного періоду в живол з'явився біль невизна ченою характеру а потім в області рани підвищилася температура тіла до 37 7°С між швами рани з явився серозно-кроо'янистий ексудат До 5-) доби боли в області рани зростали, з'явилися нудота і блювота під час ревпи рани виділилося до 80 мл гнійного ексудата Широке разведения країв рани дало можливість розкрити ГНІЙНІ кишені, некротизовані ділянки рани висічені оброблені антисептичними препаратами Рана гоїлася довгостроково місцево застосовували протеол'тичні ферменти, на 11-у добу накладені вторинні шви Приклад 3. Хворий С , 68 років надійшов у хірургічне відділення з діагнозом хронічний апендицит Дані патоморфолопчного дослідження підтвердили КЛІНІЧНИЙ діагноз До оперативного втручання з венозної крові методом диференційованого центрифугування виділяли тромбоцити у кожну пробу із суспензією тромбоцитів уводили по 0,1 мл ізадрина в кінцевій концентрації 10, 25 » 50 мкмопь/п Проби інкубували при t=20°C протягом 8-9 хв, піспя чого визначали ступінь дезагрегаци тромбоцитів що ВІДПОВІДНО склала 27% 46% і 65% Виконана апендектомія У ранньому післяопераційному періоді до складу комплексної терапії був включений нестеро)дний протизапальний препарат аспірин (2 г/добу) з метою прогнозування загоєння рани виходячи з оцінки загальної реактивності ор ганізму за запропонованим нами способом Через 24 години повторно проводили аналогічний тест із зростаючими концентраціями ізадрина Отримано такі результати при концентрації Ізадрика 10 25 ! 50 мкмоль/л ступінь дезагрегації тромбоцитів ск пав відповідно 22%, 37% і 55% ОСКІЛЬКИ крива до за-відповідь зміщується вправо, а розмір значень зсуву знаходиться в межах 5-10% то можна діагностувати стан зниженої індивідуальне! реактивності організму і прогнозувати затяжний плин репаративних процесів в області операційної рани Цей прогноз співпав із клінічними спостереження 35321 мм на 11 -у добу лісля операції в хворого посилиЛИСР болі в області рани, підвищилася температура тіла до 37.2-37.5"С. при огляд* операційної рани виявлена гіперемія і набряклість її країв, пальпаторно визначалося хворобливе ущільнення по ходу рани, що свідчило про утворення післяопераційного запального інфільтрату При ревізії операційної рани виявлено невелику кількість гнійного ексудату, шо зібрався в підшкірній основі Після обробки рани антисептичними препаратами були накладені вторинні шви Таким чином, приведені клінічні дані, що відбивають загоєння операційної рани, збігаються з прогнозом ефективності репаративних процесів у пацієнтів, побудованим на оцінці адренореактивності тромбоцитів, що свідчить про високу інформативність запропонованого способу визначення стану індивідуальної реактивності організму. Перевага способу, що заявляється, складається в тому, що він технічно простий, економіч ний, інформативний, скорочує час і матеріальні витрати на проведення досліджень і є об'єктивним способом визначення стану індивідуальної реактивності організму Перераховані переваги визначають перспективність застосування методу в клінічній практиці для індивідуалізації діагностики і лікування хворих Іспити способу, що заявляється, проведені на 45 пацієнтах, що знаходилися на лікуванні з приводу різних гострих І хронічних запальних захворювань. Джерела інформації, що прийняті до уваги: 1. Васильєв B.C., Васильєва А Н . Способ определения общей реактивности организма / Авторское свидетельство СССР N«1274681. - М. Кл. А 61 В 10/00. - Бюл. - 1986. - N» 45. 2. Баева Е В., Арестова 3-Я. Способ определения стресс-реактивности животных / Авторское свидетельство СССР №1716448. - М.Кл. Q 01 N33/53. -Бюл. 1992. - Ne 8. Тираж 50 екз. Відкрите акціонерне товариство «Патент» Україна, 88000. м Ужгород, вул. Гагаріна, 101 (03122) 3 - 72 - 89 (03122) 2 - 5 7 - 0 3