Спосіб визначення активності біологічно активної речовини

Спосіб визначення активності біологічно активної речовини (БАР), що передбачає дослідження впливу БАР на ріст соматичних клітин Drosophila melanogaster Meig., який відрізняється тим, що спочатку готують живильне середовище з дода 3 52573 рвлення ацетоорсеїном, після чого розраховують середні значення СПХ і за різницею між середніми значеннями СПХ у досліді та контролі судять про активність БАР. При вирощуванні личинок дрозофіли в умовах додавання у живильне середовище БАР з певними концентраціями відбуваються зміни рівня ендоредуплікації гігантських хромосом у клітинах личинкових тканин, зокрема, в слинних залозах, що проявляється у зміні їхнього ступеня політенії. В свою чергу СПХ характеризує рівень помноження геному у клітинному ядрі та є механізмом регулювання експресії генів і одним з показників інтенсивності метаболізму Про активність БАР судять за зміною середнього значення СПХ, яке розраховують за даними про відсоткове співвідношення ядер з різним СПХ, використовуючи цитоморфометричний метод [5]. Технічним результатом корисної моделі є досягнення високої інформативності запропонованого способу, що заснований на одному з базових цитогенетичних показників, а також можливість визначення оптимальних концентрацій окремих БАР та оцінки їхньої сумісної дії в умовах in vivo. Достовірність способу - 95%. Спосіб здійснюють таким чином. Спочатку готують живильне середовище з додаванням БАР у заданих (дослід) та нульовою (контроль) концентраціях. На приготованому живильному середовищі, у якості індикаторного організму, вирощують личинок дрозофіли. Наприкінці 3-ї стадії розвитку у личинок виділяють слинні залози та готують давлені ацетоорсеїнові препарати політенних хромосом, на яких досліджують СПХ. Наприкінці 3-ї личинкової стадії в слинних залозах 4 Drosophila melanogaster виявляються гігантські хромосоми зі ступенями політенії 256С, 512С, 1024С і 2048С (С - число елементарних хромосом). На цитологічних препаратах ці класи ядер характеризуються різною шириною хромосом. У районі диску 22А хромосоми 2L, що приблизно відповідає середній ширині хромосом, їхні поперечні розміри складають, відповідно, 1,6мкм, 2,3мкм, 3,2мкм і 4,6мкм. Чим більший ступінь політенії хромосом, тим інтенсивніше вони забарвлюються ацетоорсеїном. Спочатку визначають відсоткове співвідношення ядер з різним СПХ , після чого розраховують середнє значення СПХ для кожного варіанту досліду. Про активність БАР судять, виходячи з порівняння дослідних даних з контролем. За одержаними результатами досліджують активність БАР, порівнюють дію різних концентрацій БАР, сумісну дію двох чи декількох БАР, визначають оптимальну концентрацію БАР. Приклади використання способу, що заявляється. Приклад 1. Метою дослідження було визначити за допомогою запропонованого способу дію вітаміну В12 у різних концентраціях, що є нейростимулятором і застосовується, зокрема, у бджільництві. Личинки D. melanogaster розвивалися у стандартному цукрово-дріжджовому середовищі з додаванням препарату вітаміну В12 у концентраціях 0,01мкг/мл, 0,10мкг/мл та 1,00мкг/мл. Наприкінці 3-ї стадії у личинок виділяли слинні залози, готували давлені ацетоорсеїнові препарати, на яких визначали СПХ. Отримані дані про вплив вітаміну В12 на ступінь політенії хромосом в слинних залозах личинок дрозофіли приведені у таблиці 1. Таблиця 1 Стать ♀ ♂ Контроль 990,4±16,8 963,9±21,5 Середні значення СПХ, С при концентрації вітаміну В12, мкг/мл 0,01 0,10 1,00 1036,0±20,9 1049,3±20,9 1052,9±10,4 1000,5±18,0 1034,9±16,6 1018,4±12,5 Усього у даному експерименті було досліджено по 10-15 личинок у кожному з варіантів досліду. Таким чином, показана стимулююча дія вітаміну В12 в усіх досліджених концентраціях, оптимальною виявилася концентрація 0,10мкг/мл. Приклад 2. Метою дослідження було визначити за допомогою запропонованого способу дію гормону ек дистерону у різних концентраціях, що регулює линьки та метаморфоз комах. Застосовували концентрації гормону 0,001мкг/мл, 0,010мкг/мл, 0,100мкг/мл та 1,000мкг/мл. Отримані дані про вплив екдистерону на ступінь політенії хромосом в слинних залозах личинок дрозофіли приведені у таблиці 2. Таблиця 2 Стать ♀ ♂ Контроль 810,7±12,3 773,9±17,3 0,001 836,2±9,5 724,8±21,8 Середні значення СПХ, С при концентрації екдистерону, мкг/мл 0,010 0,100 903,3±15,3 876,5±14,3 862,4±12,2 800,2±17,4 Виявлено достовірне підвищення СПХ на 10,3% як у чоловічої, так і жіночої статі при концентрації екдистерону 0,010мкг/мл, а також збіль 1,000 672,6±28,2 690,6±22,6 шення цього показника на 7,5% при концентрації гормону 0,100мкг/мл у самок у порівнянні з контролем. При концентрації екдистерону 1,000мкг/мл 5 52573 спостерігали зниження середніх значень СПХ на 10,7% у самок і на 17,0% у самців. Таким чином, було встановлено як стимулюючу (0,010мкг/мл), так і пригнічуючу (1,000мкг/мл) концентрації препарату. Приклад 3. Метою дослідження було визначити за допомогою запропонованого способу сумісну дію екдистерону та вітаміну В12 у складі препарату ВЕСБ 6 (вітамінний, екдистеронновий стимулятор бджіл) [1]. Гормон і вітамін входять до складу препарату в рівних концентраціях. Досліджували дію препарату з концентраціями його компонентів 0,001мкг/мл, 0,010мкг/мл, 0,100мкг/мл та 1,000мкг/мл. Отримані дані про вплив препарату ВЕСБ, що містить екдистерон і вітамін В12, на ступінь політенії хромосом в слинних залозах личинок Drosophila melanogaster приведені у таблиці 3. Таблиця 3 Стать ♀ ♂ Контроль 864,1±20,8 851,2±28,4 Середні значення СПХ, С при концентрації екдистерону та вітаміну B12, мкг/мл 0,001 0,010 0,100 1,000 886,0±30,8 936,3±31,2 844,5±34,8 776,2±25,2 851,3±20,9 893,7±14,0 814,1±33,5 761,3±27,4 Отримані результати свідчать про те, що стимулююча дія препарату ВЕСБ, який містить екдистерон і вітамін B12, проявляється при концентрації компонентів 0,010мкг/мл; а при концентрації 1,000мкг/мл має місце пригнічуюча дія препарату. Джерела інформації: 1. Какпаков В.Т. Патент RU №2034504, А23К 1/18, опубл. 10.05.1995. 2. Ян де Вильде. Гормональная борьба с насекомыми // Наука и человечество. - М.: Знание. 1976. - С.147-153. 3. Шеховцова Т.Н. Биологические методы анализа // Соросовский Образовательный Журнал. - 2000. - №11. - С.17-21. Комп’ютерна верстка Л. Ціхановська 4. Какпаков В.Т., Шамшурин А.А., Спектор В.И., Мунтян Г.Е. Подавление роста длительно пересеваемых линий эмбриональных клеток дрозофилы под действием гормонов насекомых и циклического АМФ // Физиология и биохимия животных. - 1974. - №3. - С.67-71. 5. Страшнюк В.Ю., Непейвода С.Н., Шахбазов В.Г. Цитоморфометрическое исследование политенных хромосом Drosophila melanogaster Meig. в связи с эффектом гетерозиса, отбором по адаптивно важным признакам и полом // Генетика. 1995.- Т.31, №1. - С.24-29. Підписне Тираж 26 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601