Спосіб отримання біологічно активної речовини, біологічно активна речовина і водний екстракт плаценти свині

1. Спосіб отримання біологічно активної речовини, що включає механічне подрібнення і гомогенізацію плаценти свині, отримання водного екстракту гомогенізату і консервацію екстракту, який відрізняє ться тим, що водний екстракт гомогенізату отримують шля хом його розбавлення дистильованою водою в співвідношенні 0,8-1,2 масових частин води на 1 частину гомогенізату, водну суспензію гомогенізату знебарвлюють доданням до суспензії 0,006-0,007 масових частин лимонної кислоти, витримують протягом 70-110 хвилин при перемішуванні, потім відстоюють протягом 10-20 хвилин, декантирують, консервацію здійснюють шляхом додання до супернатанту ніпагіну, супернатант з консервантом витримують протягом 45-75 хвилин, після чого з декантированого супернатанту видаляють частки з розмірами більше 3 мкм шляхом фільтрації. C2 2 UA 1 3 83631 центи відбувається хімічне розщеплення пептидів, що містяться в екстракті, і появі в суміші продуктів їх розпаду у вигляді окремих амінокислот і не нативних пептидів, внаслідок чого біологічна активність продукту різко падає. Відомий також спосіб отримання плацентарного протеїну, що включає отримання гомогенату тканини плаценти свині, центрифугування, хроматографування, елюювання пов'язаного білка, осадження елюату і повторне центрифугування, при цьому з хроматографій використовують афінну хроматографію на сефарозі з іммобілізованим конго-червоним носієм, елюювання проводять 1,0 Μ розчином хлориду калію з доданням 5% гліцерину, осадження елюату здійснюють при 90%-ном насиченні сульфатом амонію, а після центрифугування осадок додатково піддають фракціюванню в 0,1 Μ амонійбікарбонатному буфері з подальшим збором фракцій, що містять цільовий продукт, і їх діалізом (патент РФ №2007417, МПК5 С07К 3/02, 1994). Цей спосіб дозволяє отримати специфічний плацентарний протеїн свині 2 (ППС-2), який є плаценто специфічним антигеном і може бути використаний як маклер для ранньої діагностики поросності свині, але не як біологічно активна речовина широкого спектра дії, що застосовується в косметології, фармації і медицині. Відомий спосіб отримання низькомолекулярної фракції з тканин плаценти свині заснований на отриманні низькомолекулярної фракції вагою не більше за 300-350 атомних одиниць за допомогою попереднього подрібнення тканини на кріомлині при температурі від мінус 80°С до мінус 120 °С з подальшим кріосублімаційним фракціюванням при температурі від мінус 10°С до мінус 20°С у вакуумних камерах при тиску 0,1 мм. рт. ст. і подальшої кріоконденсації на кріогенний панелі, що о холоджується рідким азотом (патент РФ № 2228759, MПK7 A61K35/50, 05.20.2004.). Недоліком цього способу є те, що продукт містить фракції, молекулярна маса яких не перевищує 300-350 атомних одиниць, оскільки більш важкі молекули неможливо витягнути методом низькотемпературної сублімації. Тобто в продукті відсутні біологічно активні речовини, наприклад, пептиді з молекулярною масою вище за 300-350 атомних одиниць, які, як відомо, володіють протизапальною дією, є регулювальниками обмінних процесів. Низька продуктивність способу і використання складних і кріогенних технологій, що дорого коштують, обумовлюють високу вартість кінцевого продукту, що також є серйозною перешкодою для промислового використання цього відомого способу. Відповідно, вказані вище недоліки відомого способу обмежують також можливості застосування біологічно активних плацентарних речовин в косметиці і фармакології. Задачею винаходу є створення нового способу отримання біологічно активної речовини з плаценти свині, який дозволить простим способом отримувати цінний продукт при невисокій вартості. 4 Іншою задачею винаходу є отримання біологічно активної речовини з новою по складу композицією нативних пептидів плаценти, що володіє високою біологічною активністю при відносно простій технології і невисокої вартості продукту. Третьою задачею винаходу є створення водного екстракту плаценти свині, при отриманні якого біологічно активна речовина з плаценти свині може бути використана безпосередньо без додаткової обробки або значної зміни складу. Поставлена задача вирішується тим, що в способі отримання біологічно активної речовини, що включає механічне подрібнення і гомогенізацію плаценти свині, отримання водного екстракту гомогенізату і консервацію екстракту, водний екстракт гомогенізату отримують шля хом його розбавлення дистильованою водою в співвідношенні 0,81,2 масових частин води на 1 частину гомогенізату, водну суспензію гомогенізату знебарвлюють доданням до суспензії 0,006-0,007 масових частин лимонної кислоти, витримують протягом 70-110 хвилин при перемішуванні, потім відстоюють протягом 10-20 хвилин, декантують, консервацію здійснюють шляхом додання до супернатанту нипагіну, супернатант з консервантом витримують протягом 45-75 хвилин, після чого з декантованого супернатанта видаляють частки з розмірами більше 3 мкм шляхом фільтрації. Переважно як консервант до супернатанту додають нипагін в кількості 0,1 - 0,3 ваг. % у вигляді 5% розчину нипагіну в пропіленгліколі. Поставлена задача також вирішується тим, що біологічно активна речовина, що отримана згідно з описаним вище способом, включає вільні амінокислоти, пептиди і низькомолекулярні органічні залишки при наступному співвідношенні компонентів, % сухої ваги: Вільні амінокислоти від 100 до 500 Д 21,6-26,6 Пептиди від 1000 до 2000 Д 35,3-43,1 Пептиди від 3000 до 5000 Д 16,5-20,1 Низькомолекулярні органічні залишки менше за 100 Д решта. Поставлена задача також вирішується тим, що водний екстракт плаценти свині, який містить водну фракцію пептидів і вільних амінокислот тканини плаценти свині, нипагін, пропіленгліколь і знебарвлюючу речовину, як допоміжні речовини, згідно з винаходом, містить описану вище біологічно активну речовину, яка включає водну фракцію пептидів і вільних амінокислот тканини плаценти свині, при наступному співвідношенні компонентів, (ваг. %): Біологічно активна речовина 0,1 -0,35 Нипагін 0,18-0,22 Знебарвлююча речовина 0,3 - 0,4 Пропіленгліколь 2,5-6,0 Вода решта. Переважно, як знебарвлюючу речовину водний екстракт містить лимонну кислоту. Більш детально винахід описаний за допомогою приведеного нижче прикладу. Приклад 5 83631 Розморожену і ретельно відмиту від крові тканину плаценти свині в кількості 10 кг очистили від слизу, подрібнили ножицями до часток розміром приблизно 50х50 мм і гомогенізували за допомогою електром'ясорубки. Отриманий гомогенізат залили 10 л охолодженої до 15° С дистильованою водою, ретельно перемісили до отримання однорідної суспензії і додали 70 г лимонної кислоти для знебарвлення суспензії. Для екстракції водорозчинних пептидів суспензію плаценти витримали в ємності протягом 1,5 годин при повільному перемішуванні, після чого дали відстоятися протягом 15 хвилин. Біологічно-активно речевину у вигляді супернатанту в кількості 10 л декантували і додали до нього 0,5 кг розчину, який містить 20 г нипагіну (як консерванту), що розчинений в 0,5 кг пропіленгліколю. Суспензію ретельно перемішали і витримали протягом 1 години. Отриманий водний екстракт плаценти відфільтровували за допомогою мембранних фільтрів типу "Миллипор" з діаметром пір 1-3 мкм. Отримали 10 л чистого пептидного екстракту плаценти. Водний екстракт розлили по ємностях і вмістили на зберігання в морозильну камеру з температурою мінус 28° С. Отриманий водний екстракт плаценти є прозорою, злегка жовтуватою, рідиною з характерним слабким запахом, має pH від 3.8 до 4.5. Сухий залишок складає не менше за 6 і не більше за 7%. Отриманий водний екстракт плаценти досліджували з допомогою гель-проникаючої високоефективної рідинної хроматографії (ГПВЕРХ). 6 За даними гель-хроматографії був визначений фракційний склад (по молекулярній масі) водного екстракту плаценти свині. Прилади і матеріали Для визначення фракційного складу водного екстракту плаценти використали рідинний хроматограф Woters "Alliense", з програмним забезпеченням Міленіум 32, версія 51. Умови аналізу: - колонка TSK SW 2000, розміром 7,5 х 600 мм; - рухли ва фаза: фосфатний буферний розчин з сульфатом натрію - ацетонітрил (90:10), дегазована будь-яким зручним способом. - швидкість рухливої фази 1мл/хв.; - об'єм проби 20 мкл. Приготування рухливо ї фази 32,21г натрію фосфорнокислого од нозаміщеного двохводного вміщують в мірну колбу місткістю 1 л, розчиняють в 500 мл води, доводять об'єм водою до мітки і перемішують (розчин А). 71,64г натрію фосфорнокислого двохзаміщеного дванадцативодного вміщують в мірну колбу місткістю 1л, розчиняють в 500 мл води, доводять об'єм водою до мітки і перемішують (розчин Б). 32,22г натрію сірчанокислого десятиводного вміщують в мірну колбу місткістю 1 л, розчиняють в 300 мл води, додають 312,5 мл розчину А і 187,5 мл розчину Б, перемішують, додають 100 мл ацетонітрилу, перемішують і доводять об'єм розчину водою до мітки. Результати аналізу представлені в таблиці. Таблиця Фракційний склад (по молекулярній масі) водного екстракту плаценти за даними гель-хроматографії (l=254 нм) Час витримки речовин на колонці (хвилини) 18.576 20.062 20.479 Площа під хроматограф, Площа під хроматопіком граф. піком (в %) 2075501 18.29 2332345 39.2 2116487 Орієнтовна молекулярна маса, (дальтон) 3000