Спосіб одержання антигену для діагностики лейкозу великої рогатої худоби в реакції імунодифузії (рід)

Спосіб одержання антигену для діагностики лейкозу великої рогатої худоби (ВРХ) в реакції імунодифузії (РІД), що включає культивування перещеплюваних клітин на суміші ростових середовищ, які містять сироватку ВРХ, освітлення культуральної рідини, осадження антигену, який відрізняється тим, що використовують вільну від γглобулінів сироватку крові ВРХ, культуральну рідину концентрують ультрафільтрацією на колонках з порожнистими волокнами, сконцентровану культуральну рідину освітлюють центрифугуванням. (19) (21) u201001799 (22) 19.02.2010 (24) 10.09.2010 (46) 10.09.2010, Бюл.№ 17, 2010 р. (72) СТЕГНІЙ БОРИС ТИМОФІЙОВИЧ, КОРОВІН ІГОР ВІКТОРОВИЧ, СТЕГНІЙ МАРИНА ЮРІЇВНА, ФІСЕНКО СВІТЛАНА АНАТОЛІЇВНА, ГОРБАТЕНКО СТАНІСЛАВ КІНДРАТОВИЧ, ДУНАЄВ ЮРІЙ КОСТЯНТИНОВИЧ, БАБАНІН МИКОЛА ІГОРОВИЧ (73) НАЦІОНАЛЬНИЙ НАУКОВИЙ ЦЕНТР "ІНСТИТУТ ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЇ І КЛІНІЧНОЇ ВЕТЕРИНАРНОЇ МЕДИЦИНИ" 3 Порівняльний аналіз з найближчим аналогом дозволяє зробити висновок, що використаня глобулінової сироватки дозволяє отримати високоактивний і специфічний антиген, ультрафільтрація на колонках з подими волокнами дозволяє уникнути втрат антигену, освітлення зконцентрованої культуральної рідини центрифугуванням дає змогу уникнути великої втрати вірусів, контроль контамінації сторонніми вірусами за допомогою ПЛР дозволяє виявляти контамінанти вірусної етіології, які не викликають цитопатогенну дію в культурах клітин, дозволяє багаторазово підвищити специфічність антигену. Спосіб виконують таким чином. Пересів культури клітин FLK-BLV здійснюють один раз на 7-10 діб з посівною концентрацією 50100тис. клітин/см3. В якості ростового середовища використовують середовища 199, Ігла і сироватку ВРХ, очищену від імуноглобулінів. Характер росту і формування моношару клітин та їх якість визначають шляхом перегляду культури під світловим мікроскопом. Контроль стерильності культури клітин FLKBLV та антигену вірусу лейкозу ВРХ здійснюють на тіогліколевому середовищі (ТГС) та контроль контамінації за допомогою ПЛР. Глікопротеїдний антиген ВЛ ВРХ отримують з вірус - культуральної рідини після її 2-3 разового заморожування-відтавання. Вірус-культуральну рідину спочатку концентрують у 50 - 100 разів на ультрафільтраційній установці з порожнистими волокнами з порогом затримання 10-200кД. Потім концентрат освітлюють центрифугуванням при 3000об/хв. впродовж 30хв. Після цього супернатант збирають, додають до нього 50% розчин ПЕГ6000 (з розрахунку 200см3 розчину на 1дм3 концентрату) і витримують 12-24 години за температури 4 С. Після відстоювання антиген осаджують центрифугуванням при 5000 об/хв. впродовж 30 40 хвилин. Надосад зливають і утилізують, а осад антигену ВЛ збирають і ресуспендують у рівному об'ємі забуференого фізіологічного розчину. Антиген піддають УЗ-дезінтеграції при 400 Вт, 22кГц, 100 А впродовж 10 хвилин. Клітинний детрит, що отримують при освітленні вірус-культуральної рідини збирають, розводять фізіологічним розчином у співвідношенні 1:1, розмішують до повного розчинення та піддають УЗ-дезінтеграції при 400Вт, 22кГц, 100А впродовж 10 хвилин. Дезінтегрований детрит освітлюють центрифугуванням при 3000об/хв. впродовж 30хв. Надосад осаджують 50%-вим розчином ПЕГ-6000 (з розрахунку 200см3 розчину на 1дм концентрату), витримують 12-24 години за температури 4 С. Після відстоювання антиген осаджують центрифугуванням при 5000 об/хв. впродовж 30-40 хвилин. Надосад зливають і утилізують, а осад збирають і ресуспендують у рівному об'ємі забуференого фізіологічного розчину. Приклад 1. 52744 4 50дм3 вірус-культуральної рідини спочатку концентрували методом ультрафільтрації, а тільки потім очищали від детриту центрифугуванням при 5000об/хв. У клітинному детриті, який одержували після низькошвидкісного центрифугування попередньо сконцентрованої вірус-культуральної рідини, специфічних білків ВЛ ВРХ в РІД не виявляли. При виготовленні антигену ВЛ для концентрування вірус-культуральної рідини згідно діючої технології використовували ультрафільтрацію на порожніх волокнах з порогом утримання 100кД. Враховуючи на те, що діагностичну цінність представляють поверхневі білки ВЛ gp 51, gp 30 та внутрішній р24 з молекулярною масою від 51 до 24 кД, для концентрування вірус-культуральної рідини були випробувані ультрафільтраційні модулі з порожніми волокнами на 15 кД і 50 кД (дослід). Було встановлено, що при отриманні антигену ВЛ за стандартною технологією, його кількість складала (335,0 ± 7,6 см3) з 50дм3 вірус-культуральної рідини з активністю в РІД 1:1,2 - 1:1,8, в той час дослідного антигену було отримано (450,0±17) см3 з активністю 1:2,0 - 1:3,0 (табл. 1).В таблиці представлені порівняльні дані і оцінки методів отримання антигену вірусу лейкозу ВРХ з культуральної рідини FLK-BLV, яку отримували на середовищі з нативною сироваткою. Таким чином, використання волокон з меншим порогом утримання дозволило на 34% збільшити вихід антигену ВЛ. Приклад 2. 3 50дм вірус-культуральної рідини накопичували при культивуванні клітин FLK-BLV на середовищі з 10% аглобулінової сироватки крові ВРХ. Було встановлено, що при використанні стандартної технології виготовлення антигену його кількість складала (90,0±5,7) см3 з 50дм3 вірускультуральної рідини з активністю в РІД 1:3,0 1:4,0, в той час при використанні нової технології (дослід) отримали антиген в кількості (155,0±18,9) 3 см з активністю 1:4,0 - 1:5,0 що на 72% більше (табл. 2). В таблиці наведені порівняльні дані оцінки методів отримання антигену вірусу лейкозу ВРХ з культуральної рідини FLK-BLV, яку отримували на середовищі з аглобуліновою сироваткою. За допомогою цього способу вдосконалено технологію одержання антигену ВЛ ВРХ, яка дозволяє у 1,3 - 1,7 рази збільшити його вихід з одиниці об'єму вірус-культуральної рідини, що підвищує ефективність виробництва. Таким чином спосіб одержання антигену для діагностики лейкозу великої рогатої худоби в реакції Імунодифузії (РІД) є економічним та ефективним, він дозволяє збільшувати вихід антигену ВЛ на 34% - 72. Він придатний для використання в промислових масштабах і дозволяє одержати більшу кількість активного, специфічного та стабільного препарату антигена ВЛВРХ. 5 52744 6 Таблиця 1 Спосіб одержання антигену для діагностики лейкозу великої рогатої худоби в реакції імунодифузії (РІД) Спосіб виготовлення антигену ВЛ Згідно з ТУ Концентрування вірусвміщуючої рідини, центрифугуванн я при 5000об/хв., осадження антигену ВЛ ПЕГ - 6000 Отримано Активність Кількість рідини на Активність Кількість детриту в 3 антигену ВЛ, концентрацію, дм АГ в РІД детриту, см3 см3 РІД 50 335,0±7,6 1:1,2 - 1:1,8 240,0±23,1 Нативний 50 450,0±17,3 1:2,0 - 1:3,0 90,0±15,2 0 Таблиця 2 Спосіб одержання антигену для діагностики лейкозу великої рогатої худоби в реакції імунодифузії (РІД) Спосіб виготовлення антигену ВЛ Згідно з ТУ Концентрування вірусвміщуючої рідини, центрифугування при 5000об/хв., осадження антигену ВЛ ПЕГ- 6000 Комп’ютерна верстка Л. Купенко Отримано Активність Кількість рідини на Активність Кількість детриту в 3 антигену ВЛ, 3 концентрацію, дм АГ в РІД детриту, см см3 РІД 50 90,0±5,7 1:3,0 - 1:4,0 240,0±23,1 Нативний 50 155,0±18,9 1:4,0 - 1:5,0 Підписне 90,0±15,2 Тираж 26 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 0