Спосіб одержання ліофілізованого антигену для діагностики лейкозу великої рогатої худоби в реакції імунодифузії (рід)

Спосіб одержання ліофілізованого антигену для діагностики лейкозу великої рогатої худоби в реакції імунодифузії (РІД), що включає культивування перещеплюваних клітин на суміші ростових середовищ, які містять сироватку ВРХ, освітлення культуральної рідини, осадження антигену, який відрізняється тим, що використовують вільну від γ-глобулінів сироватку крові ВРХ, культуральну рідину концентрують ультрафільтрацією на колонках з порожнистими волокнами, cконцентровану культуральну рідину освітлюють центрифугуванням та ліофілізують. (19) (21) u201001839 (22) 19.02.2010 (24) 10.09.2010 (46) 10.09.2010, Бюл.№ 17, 2010 р. (72) СТЕГНІЙ БОРИС ТИМОФІЙОВИЧ, КОРОВІН ІГОР ВІКТОРОВИЧ, СТЕГНІЙ МАРИНА ЮРІЇВНА, ФІСЕНКО СВІТЛАНА АНАТОЛІЇВНА, ГОРБАТЕНКО СТАНІСЛАВ КІНДРАТОВИЧ, ДУНАЄВ ЮРІЙ КОСТЯНТИНОВИЧ, БАБАНІН МИКОЛА ІГОРОВИЧ (73) НАЦІОНАЛЬНИЙ НАУКОВИЙ ЦЕНТР "ІНСТИТУТ ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЇ І КЛІНІЧНОЇ ВЕТЕРИНАРНОЇ МЕДИЦИНИ" 3 52745 4 ліофілізації, щоб забезпечити ефективність спосоу камеру ліофільної установки, попередньо охолобу. дженої до мінус 50°С. У камері ліофільної установПорівняльний аналіз з прототипом дозволяє ки створюють вакуум 30 Па.(Паскаля). Температузробити висновок, що використаня а-глобулінової ру в період створення вакууму підтримують на сироватки дозволяє отримати високоактивний і рівні мінус 55-60°С. Ліофілізацію проводять протяспецифічний антиген, ультрафільтрація на колонгом 35-54 годин. Перша фаза висушування триваках з порожнистими волокнами дозволяє уникнути лістю 25-36 годин проходить при мінусовій темпевтрат антигену, освітлення зконцентрованої кульратурі з підвищенням її на 2-4°С у годину від мінус туральної рідини центрифугуванням дає змогу 55-66°С до 0°С. Друга фаза проходить при плюсоуникнути великої втрати вірусів, контроль контамівій температурі з поступовим її підвищенням на 1нації сторонніми вірусами за допомогою ПЛР до2°С у годину від 0°С до 18-22°С протягом 10-18 зволяє виявляти контамінанти вірусної етіології, годин і вакуумі 30 Па. які не викликають цитопатогенну дію в культурах Після закінчення ліофілізації в камеру постуклітин, дозволяє багаторазово підвищити специфіпово впускають повітря, або азот через стерильчність антигену, що відповідає критерію "новизна". ний ватно-марлевий фільтр, поки тиск у ній не зріСпосіб виконують таким чином. вняється з атмосферним. Ампули із сухим Пересів культури клітин FLK-BLV здійснюють антигеном витягають із камери ліофільної устаноодин раз на 7-10 діб з посівною концентрацією 50вки, приєднують до канюль патрубків, що відсмок100 тис. клітин/см3. В якості ростового середовища тують, вакуум-колектора й запаюють під вакуумом використовують середовища 199, Ігла і сироватку при тиску не більше 33 Па. Флакони укупорюють ВРХ, очищену від імуноглобулінів. Характер росту під вакуумом при тиску не більше 33 Па. і формування моношару клітин та їх якість визнаПриклад 1. чають шляхом перегляду культури під світловим 50 дм3 вірус-культуральної рідини спочатку мікроскопом. концентрували методом ультрафільтрації, а тільки Контроль стерильності культури клітин FLKпотім очищали від детриту центрифугуванням при BLV та антигену вірусу лейкозу ВРХ здійснюють на 5000 об/хв. У клітинному детриті, який одержували тіогліколевому середовищі (ТГС) та контроль конпісля низькошвидкісного центрифугування попетамінації за допомогою ПЛР. редньо сконцентрованої вірус-культуральної рідиГлікопротеїдний антиген ВЛ ВРХ отримують з ни, специфічних білків ВЛ ВРХ в РІД не виявляли. вірус-культуральної рідини після її 2-3 разового При виготовленні антигену ВЛ для концентрування заморожування-відтавання. Вірус-культуральну вірус-культуральної рідини згідно діючої технології рідину концентрують у 50 - 100 разів на ультрафівикористовували ультрафільтрацію на порожніх льтраційної установці з порожнистими волокнами волокнах з порогом утримання 100 кД. Враховуюз порогом затримання 10-200 кД. Концентрат освічи на те, що діагностичну цінність представляють тлюють центрифугуванням при 3000 об/хв. впроповерхневі білки ВЛ gp 51, gp 30 та внутрішній довж 30 хв. Після цього супернатант збирають, р24 з молекулярною масою від 51 до 24 кД, для додають до нього 50% розчин ПЕГ-6000 (з розраконцентрування вірус-культуральної рідини були хунку 200 см3 розчину на 1 дм3 концентрату) і вивипробувані ультрафільтраційні модулі з порожніми волокнами на 15 кД і 50 кД (дослід). Було встатримують 12-24 години за температури 4 С. Після новлено, що при отриманні антигену ВЛ за станвідстоювання антиген осаджують центрифугувандартною технологією, його кількість складала ням при 5000 об/хв. впродовж 30-40 хвилин. Надо(335,0±7,6 см3) з 50 дм3 вірус-культуральної рідини сад зливають і утилізують, а осад антигену ВЛ з активністю в РІД 1:1,2 -1:1,8, в той час досліднозбирають і ресуспендують у рівному об'ємі забуго антигену було отримано (450,0±17) см3 з активференого фізіологічного розчину. Антиген підданістю 1:2,0 - 1:3,0 (табл. 1).В таблиці представлені ють УЗ-дезінтеграції при 400Вт, 22кГц, 100А впропорівняльні дані оцінки методів отримання антигедовж 10 хвилин. ну вірусу лейкозу ВРХ з культуральної рідини FLKКлітинний детрит, що отримують при освітBLV, яку отримували на середовищі з нативною ленні вірус-культуральної рідини збирають, розвосироваткою. v дять фізіологічним розчином у співвідношенні 1:1, Таким чином, використання волокон з меншим розмішують до повного розчинення та піддають порогом утримання дозволило на 34% збільшити УЗ-дезінтеграції при 400Вт, 22кГц, 100А впродовж вихід антигену ВЛ. 10 хвилин. Дезінтегрований детрит освітлюють Приклад 2. центрифугуванням при 3000 об/хв. впродовж 30 50 дм3 вірус-культуральної рідини накопичувахв. Надосад осаджують 50%-ним розчином ПЕГ3 3 ли при культивуванні клітин FLK-BLV на середо6000 (з розрахунку 200 см розчину на 1 дм конвищі з 10 % аглобулінової сироватки крові ВРХ. центрату), витримують 12-24 години за темпераБуло встановлено, що при використанні стандарттури 4 С. Після відстоювання антиген осаджують ної технології виготовлення антигену його кількість центрифугуванням при 5000 об/хв. впродовж 30-40 складала (90,0±5,7) см3 з 50 дм3 вірусхвилин. Надосад зливають і утилізують, а осад культуральної рідини з активністю в РІД 1:3,0 збирають і ресуспендують у рівному об'ємі забу1:4,0, в той час при використанні нової технології ференого фізіологічного розчину. (дослід) отримали антиген в кількості (155,0±18,9) Потім антиген розливають у стерильні ампули см3 з активністю 1:4,0 - 1:5,0 що на 72% більше або флакони по 1-20 мл. за допомогою автомати(табл. 2). В таблиці наведені порівняльні дані оцінчних дозаторів та укупорюють вакуумними пробки методів отримання антигену вірусу лейкозу ВРХ ками. Ампули (флакони) з антигеном заморожують з культуральної рідини FLK-BLV, яку отримували при мінус 40-50°С протягом 4-5 годин і переносять 5 52745 6 на середовищі з аглобуліновою сироваткою. За Таким чином спосіб одержання антигену для допомогою цього способу вдосконалено технолодіагностики лейкозу великої рогатої худоби в реагію одержання антигену ВЛ ВРХ, яка дозволяє у кції імунодифузії (РІД) є економічним та ефектив1,3 - 1,7 рази збільшити його вихід з одиниці об'єним, він дозволяє збільшувати вихід антигену ВЛ му вірус-культуральної рідини, що підвищує ефекна 34% - 72. Він придатний для використання в тивність виробництва. Ці антигени також краще промислових масштабах і дозволяє одержати біпіддаються ліофілізації, утворюючи швидко розльшу кількість активного, специфічного та стабільчинну таблетку. ного препарату антигена ВЛ ВРХ. Таблиця 1. Спосіб одержання антигену для діагностики лейкозу великої рогатої худоби в реакції імунодифузії (РІД) Спосіб виготовлення антигену ВЛ Згідно з ТУ Концентрування вірусвміщуючої рідини, центрифугування при 5000 об/хв., осадження антигену ВЛ ПЕГ- 6000 Кількість рідини Отримано анти- Активність АГ в на концентрагену ВЛ, см3 РІД 3 цію, дм 50 335,0±7,6 1:1,2 - 1:1,8 450,0±17,3 50 1:2,0 - 1:3,0 Кількість детриту, см3 Активність детриту в РІД 240,0±23,1 Нативний 90,0±15,2 0 Таблиця 2. Спосіб одержання антигену для діагностики лейкозу великої рогатої худоби в реакції імунодифузії (РІД) Спосіб виготовлення антигену ВЛ Згідно з ТУ Концентрування вірусвміщуючої рідини, центрифугування при 5000 об/хв., осадження антигену ВЛ ПЕГ- 6000 Кількість рідиОтримано ан- Активність АГ в ни на конценттигену ВЛ, см3 РІД 3 рацію, дм 50 90,0±5,7 1:3,0 - 1:4,0 50 Комп’ютерна верстка В. Мацело 155,0±18,9 1:4,0 - 1:5,0 Підписне Кількість детриту, см3 Активність детриту в РІД 240,0±23,1 Нативний 90,0±15,2 0 Тираж 26 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601