Спосіб одержання антигену для діагностики лейкозу великої рогатої худоби в реакції преципітації

Спосіб одержання антигену для діагностики лейкозу великої рогатої худоби, що включає культивування перещеплюваних ЛІНІЙ КЛІТИН на суміші Винахід відноситься до ветеринарної вірусологи (бютехнолопі), а саме до способів одержання антигену для діагностики лейкозу великої рогатої худоби (ВРХ) в реакції преципітації Лейкоз ВРХ - хронічне інфекційне злоякісне захворювання ВРХ, яке викликається вірусом, належним до род Retrovindae Лейкоз спричиняє значні економічні збитки тваринництву та небезпечний для людей Метою винаходу є одержання антигену для діагностики лейкозу ВРХ з подальшим використанням його в реакції преципітації Існує "Способ получения антигена вируса лейкоза крупного рогатого скота" (патент России №2020960, кл А61К39/12 от 15 10 1994) Сутність винаходу в тому, що культивують вірус продукуючих клітин на ростовому середовищі, що містить середовище Ігла, сироватку крові коняки, ПІВНІЧНИХ оленів, вітамінно-сольові домішки культивування проводять в апараті типу „Гироген" Цей спосіб є трудомістким та ще має не ВІТЧИЗНЯНІ компоненти В способі одержання антигену (патент России №2152224 G01 N33/53 от 30 06 98 "Способ получения антигена") використовується, глибоке заморожування, що має велику собівартість Прототипом може бути "Способ получения антигена для диагностики лейкоза крупного рогатого скота в реакции иммунодиффузии" (А с, №1585951 кл А61К39/12, от 27 1988г) Культивування клітин, що хронічно інфіковані онкорнавірусним антигеном, проводять на живильному середо живильних середовищ з сироваткою крові великої рогатої худоби (ВРХ), та з подальшим розділенням твердої фази від рідкої, який відрізняється тим, що до суміші живильних середовищ Ігла, 199, додають аглобулінову сироватку крові ВРХ, Lглутамш, інсулін, енробюфлокс, після чого клітинокультуральна рідина поєднується з надосадом, що отримують додаванням поверхнево-активної речовини до фіксованих на склі FLK+BLV, з подальшим титруванням одержаного антигену в реакції преципітації вищі, що містить гідролізат та має 0,5% білка, в яке додатково вводять гемопдролізат, а антиген одержують із твердої фази шляхом ультразвукової дезінтеграції Таким чином одержують антиген Цей спосіб може бути прототипом Але його використовують в РІД (реакція імунодифузії) В основу винаходу, що передбачається, поставлено задачу розробити спосіб одержання антигену для діагностики лейкозу великої рогатої худоби шляхом культивування перещеплюваних ЛІНІЙ клітин на суміші живильних середовищ з сироваткою крові великої рогатої худоби (ВРХ), та з послідуючим розділенням твердої фази від рідкої, та додаванням до суміші живильних середовищ Ігла (45%), 199 (40%), додають L-глутамш (0,05%), аглобулінову сироватку крові ВРХ (15%), інсулін (0,5ЕД/мл), енробюфлокс (1 20 3 ), після чого клітинно-культуральна рідина поєднується з надосадом, що отримують додаванням поверхневоактивної речовини до фіксованих на склі FLK+BLV, з подальшим титруванням одержаного антигену в реакції преципітації, щоб забезпечити можливість титрування антигену в реакції преципітації Аналіз відомих технічних рішень в галузі вірусологи (бютехнолопі) дозволяє зробити висновок про відсутність ознак, що схожі з суттєвими ВІДМІННИМИ ознаками способу, що заявляється, та признати це рішення, ВІДПОВІДНИМ критерію "суттєві ознаки" Спосіб виконується таким чином Антиген вірусу лейкозу виготовляють з клітин 1 00 ю 58720 но-культуральної рідини перещеплюваної лінії клітин нирки та селезінки теля, що інфіковані бичачим лейкозним вірусом (FLK+BLV) Клітини вирощують 5-7 днів в рідкому живильному середовищі, що включає середовища Ігла (45%), 199 (40%), аглобулінову сироватку крові ВРХ (15%), L-глутамш (0,05%), інсулін (0,5ЕД/мл), енробюфлокс (1 20 3 ) Одержану клітино-культуральну рідину асептично зливають в окрему ємність, а до фіксованих на склі FLK+BLV додають 2 об'єми 0,25-0,5% розчину ПАР (Твин-80, ТритонхЮО, Савинол) Після періодичного струшування через 2-3 години рідину з клітинами, що деструйовані, зливають та освітлюють центрифугуванням при 3-5тис об/хв Надосад поєднують з ККР Після ЧОГО суміш концентрують хЮ на апаратах розділяючих з пропускною здатністю 15 КДТ під тиском 0,2-0,Затм Концентрат освітлюють центрифугуванням при 3-5тис об/хв і до надосаду додають 50%-ний розчин ПЕГ-1000 до 10% концентрації ПЕГ вміщуючий концентрат витримують 18-24години при температурі 2-8°С, центрифугують при 35тис об/хв , а осад ресуспендують у 4 об'ємах фосфатно-буферного розчину NaCI, що містить тюмерсал та ентробюфлокс у концентрації 1 10 Зд р До одержаного гомогенату додають 30% 1,1,2трихлортрифторетану, шутелюють 2-3 години при температурі 2-8°С, центрифугують при G 200-300 Комп'ютерна верстка Л Ціхановська З одержаних 3-х фракцій нижня - 1,1,2трихлортрифторетан, середня - денатурований баластний білок, верхня - антиген вірусу лейкозу Верхню фракцію звільнюють від залишків 1,1,2трихлор трифторетона в повітряній камері підтиском 30-40Па Після ЧОГО антиген титрують в реакції преципітації проти позитивної сироватки та доводять його до титру 1 4-1 6 за допомогою фосфатнобуферного розчину NaCI Перевірка антигену на стерильність здійснюється за загальноприйнятими методами Для перевірки вірусного антигену, одержаного з культуральної рідини лінії клітин FLK+BLV на повноту інактивації відбирають 4 серонегативних до вірусу лейкозу телят у ВІЦІ 8-24 МІСЯЦІ Інактивованими вважають антигени досліджуваної серії, після ін'єкції яких у телят на протязі 4 МІСЯЦІВ не виявлені в реакції імунодифузм специфічна антитіла проти вірусу лейкозу ВРХ Використання рідкого живильного середовища що містить середовище Ігла, середовище 199, аглобулінову сироватку крові ВРХ, L-глутамш, інсулін, енробюфлокс та використання надосаду (витяжка з клітинного детриту) дає можливість збільшити вихід антигену в 2-2,2 рази з одиниці сировини Спосіб придатний для використання у промисловому виробництві Підписано до друку 05 09 2003 Тираж39 прим Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, Львівська площа, 8, м Київ, МСП, 04655, Україна ТОВ "Міжнародний науковий комітет", вул Артема, 77, м Київ, 04050, Україна