Спосіб отримання антигену для тестування лейкозу великої рогатої худоби

Спосіб отримання антигену для тестування лейкозу великої рогатої худоби, що включає культивування хронічно інфікованої культури FLK вірусом лейкозу великої рогатої худоби на поживному середовищі, відділення культуральної рідини, отримання клітинної маси, концентрування отриманого антигену з його доконцентруванням до заданого позначення білка, який відрізняється тим, що як поживне середовище використовують середовище Ігла та сироватку крові великої рогатої худоби, яка містить антитіла до вірусу лейкозу, взяті в співвідношенні 1:1. (19) (21) u200707335 (22) 02.07.2007 (24) 25.10.2007 (72) НАГАЄВА ЛЮБОВ ІЛЛІВН А, U A, АРАНЧІЙ СЕРГІЙ ВАСИЛЬОВИЧ, UA, ДОБРОСОЛ ГРИГОРІЙ ІЛЛІЧ, UA, НАГ АЄВ ЕВГЕН МИКОЛАЙОВИЧ, U A, Н АГ АЄВА ГАЛИНА ГРИГОРІВНА, UA (73) НАУКОВО-ВИРОБНИЧЕ ТОВАРИСТВО З ОБМЕЖЕНОЮ ВІДПОВІДАЛЬНІСТЮ "ЛЕЙКОНАД", U A (56) 3 27375 недоліком остається неможливість використання для оцінки імуногенної активності вакцини проти лейкозу ВРХ. В основу корисної моделі поставлено завдання одержання антигену для проведення диференційної діагностики наявності поствакцінальних антитіл у імунізованих тварин та визначення імуногенної активності вакцини. Поставлене завдання вирішується в способі отримання антигену для тестування лейкозу ВРХ, який дозволяє в сироватці крові тварин імунізованих вакциною рідкою інактивованою адсорбованою проти лейкозу ВРХ професора Нагаєвої Л.І. виявити антитіла, викликані польовим штамом вірусу (gp-51) та вакцинним штамом (р24). Технічним результатом корисної моделі є можливість тестування напруженості імунітету ВРХ після введення вищевказаної вакцини. Заявляємий спосіб включає культивування на поживному середовищі хронічно інфікованої вірусом лейкозу ВРХ культури FLK, відділення культуральної рідини, отримання клітинної маси, концентрування отриманого антигену з його доконцентруванням до заданого позначення білка. Було встановлено, що для отримання поставленого завдання доцільно в якості поживного середовища для культивування клітин FLK використовува ти середовище Ігла та сироватку крові ВРХ, яка містить антитіла до вірусу лейкозу, взяті в співвідношенні 1:1. Заявлене співвідношення є оптимальним, так як при зменшенні співвідношення середовища Ігла та сироватки різко втрачається чутливість реакції та кількість отримання антигену, а збільшення їх кількості не впливає на вихід кількості антигену. Спосіб реалізують наступним чином. Віруспродукуючі клітини FLK культивують на ростовому поживному середовищі, що містить поживні середовища Ігла та 199 в рівних співвідношеннях з додаванням натрієвої солі бензілпеніциліну та L-глютаміну, що містить сироватку крові ВРХ з антитілами до вірусу лейкозу протягом 8 діб до повного виснаження культуральної рідини. Культуральну рідину і дезінтегровані клітини культури FLK центрифугують при 1500об/хвил. протягом 20 хвилин. Надосадкову культуральну рідини зливають. Отриману клітину масу відмивають фізіологічним розчином і заморожують. Далі клітинну масу розморожують з послідуючим трикратним заморожуванням та розморожуванням, потім її механічно руйнують в гомогенізаторі з додаванням лікуючого буферу, взятих в співвідношенні 1:1. Отриману суміш лізують на магнітній мішалці при температурі 4°С 30хвилин. Далі суміш центрифугують при 3000об/хвил. 20 хвил. Отримана надсадкова рідина утримає білок р-24, кількість якого визначають за допомогою рефрактометра RL-3. Вміст його повинен бути більше 5мг/см. Далі антиген концентрують способом діалізу через плівку поліетиленгліколю або ліофілізують. Ліофілізований антиген р-24 має вигляд сірожовтого порошку. 4 Специфічну преципітуючу сироватку з р-24 антитілами для тестування отримують від гіперімунізованих донорів ВРХ через 2 місяці після третього введення вакцинного препарату. Контроль гуморального статусу вакцинованих тварин визначають через 30днів після останнього щеплення за допомогою реакції імунодіфузії в агаровому гелі використовуючи отриманий антиген р-24 та специфічну приципітуючу сироватку з р-24 антитілами, взятих в співвідношенні 1:1. Постановку реакції імунодифузії здійснюють за загальноприйнятою методикою постановки РІД. Як показують проведенні дослідження лінії преципітації чіткі, молочного кольору (припустима незначна опалесценція до лунки з антигеном).Титр антитіл знаходиться у межах 1:4-1:64, що свідчить про належну напругу імунітету до вір усу лейкозу ВРХ. У імунізованих тварин позитивна реакція в середньому знаходиться в межах 80-85%.