Спосіб визначення токсичності біологічних середовищ

Спосіб визначення токсичності біологічних середовищ, який включає витримування біологічної рідини з тестовою культурою та визначення в подальшому характеру змін клітин тестової культури, який відрізняється тим, що як тестову культуру використовують культуру ракових клітин організму людини, а після витримування її у біологічній рідині визначають ЯКІСНІ та КІЛЬКІСНІ ЗМІНИ з боку культури клітин і по співвідношенню змінених та незмінених клітин судять про ступінь токсичності біологічного середовища Спосіб відноситься до галузі біологічних наук і може бути використаним в медицині для діагностики патологічних станів біологічних середовищ при різноманітній патології органів і систем, наприклад, для визначення токсичності крові та кишкового вмісту у хворих з непрохідністю кишечника та поширеним перитонітом Після усунення джерел кишкової непрохідності або поширеного перитоніту шляхом проведення своєчасного та адекватного оперативного втручання, однією з головних ланок у патогенезі порушень, що розвиваються в подальшому, є синдром ентеральної недостатності Наслідком ентеральної недостатності є накопичення у просвіті кишечника застійного, токсичного вмісту з розвитком пперколонізацм умовнопатогеннихта патогенних мікроорганізмів Ступінь вираженості та тривалість протікання даного синдрому багато в чому визначає характер інтоксикації, подальший розвиток захворювання та його прогноз Слід зазначити, що інтоксикаційний синдром є найбільш частою причиною летальних випадків серед хворих з непрохідністю кишечника та поширеним перитонітом В таких умовах визначення токсичності крові та кишечного вмісту є важливим діагностичним заходом, що дозволяє адекватно визначити ступінь патологічних змін з боку вищезгаданих середовищ та в процесі лікування простежити ефективність проведення і ДОЦІЛЬНІСТЬ використання певних лікувальних маніпуляцій та процедур визначення токсичності біологічних середовищ, який полягає у визначенні тривалості життя найпростіших одноклітинних мікроорганізмів Paramecium caudatum під впливом досліджуваного середовища (парамеційний тест) //В П Андрющенко, СТ Федоренко Клінічна хірургія - 1997 № 9 - 1 0 -с 18-20, Ю Б Куцик Клінічна хірургія 1998, -№8 -с 23-25// Недоліком даного способу є нестабільність результатів та великий відсоток похибок, пов'язаних зі способом культивування, особливостями харчування та фазою життєвого циклу найпрості Найбільш близьким до заявляемого, є спосіб ших, що використовуються у ДОСЛІДІ Задачею винаходу є створення такого способу визначення токсичності біологічних середовищ, в якому шляхом використання певних засобів досягається простота, адекватність та точність діагностики патологічного стану вищезгаданих середовищ Зазначена задача досягається тим, що в способі визначення токсичності біологічних середовищ, який включає витримування біологічної рідини з тестовою культурою та визначення в подальшому характеру змін клітин тестової культури, згідно винаходу, в якості тестової культури використовують культуру ракових клітин організму людини, а після витримування їх у біологічній рідині визначають ЯКІСНІ та КІЛЬКІСНІ ЗМІНИ З боку культури клітин і по співвідношенню змінених та незмінених клітин судять про ступінь токсичності біологічного середовища ю ю 52951 Авторами даного винаходу, з урахуванням характеру змін з боку біологічних середовищ, підібраний такий засіб, який дозволяє досягти зазначеного у задачі результату Так, використання для діагностики культури ракових клітин, якій притаманні властивості тканин організму, дозволяє достовірно опосередковано простежити вплив токсинів, що їх вміщують біологічні середовища, на організм людини та адекватно визначити рівень токсичності біологічного середовища Характер культивування, спосіб забору, стандартність поживного середовища та умов культивування дозволяє запобігти похибок у результатах досліджень, притаманних парамеційному тесту Спосіб здійснюється наступним чином Для визначення токсичності біологічних середовищ використовуємо перещепну культуру клітин Нер-2 (клітини карциноми гортані людини) Клітини культивуємо у середовищі росту наступного складу середовище 199 - 250мл, середовище Ігла 200мл, сироватка крупної рогатої худоби - 50мл, пеніцилін - ЮООД/мл, стрептоміцин - 50мкг/мл Для досліджень використовуємо суспензію культури клітин у ПОСІВНІЙ концентрації 400000кл/мл в середовищі Ігла з 5% ембріональної сироватки телят Відібране біологічне середовище центрифугуємо при 4000об/хв протягом ЗОхв з метою відокремлення грубих домішок, з послідуючим фільтруванням через фільтри "Milhpore" з розміром пор 0,22мкм для деконтамінацм від супутньої мікрофлори 3 рідкої частини досліджуваного біологічного середовища готовимо 2 х кратні розведення у середовищі Ігла та вносимо в об'ємі 0,1 мл до 4 лунок 96 луночного пластикового планшету для культури клітин В ті ж лунки додаємо суспензію культури клітин в об'ємі 0,1мл До контрольних лунок (4шт) вносимо суспензію клітин в об'ємі 0,1мл та 0,1мл середовища Ігла Планшети витримуємо в термостаті при 37°С з підвищеним вмістом СОг Попередній облік результатів можливий через 2-12 годин, що використовується при потребі експресної оцінки даних Остаточний облік результатів здійснюється через 24 години візуально, з використанням інвертованого мікроскопу та наступним фіксуванням і забарвленням клітинних моношарів 5% розчином генціан вюлетового Про токсичність біологічного середовища свідчить цитопатична дія, яка настає під впливом досліджуваного середовища і проявляється руйнуванням 50% (ЦПД - 50%) та більш клітинного моношару у 4 лунках 96 луночного планшету Так, в контрольних лунках при нормальних умовах культивування культура клітин Нер-2 має вигляд рівномірно розташованих клітин у вигляді одного шару з чіткими контурами оболонок та зернистої цитоплазми (фиг 1) Під дією токсинів біологічного середовища частина клітин втрачає життєздатність, деформується, що візуально реєструється у вигляді зруйнованих клітин з ознаками зморщування, втрати цитоплазматичної мембрани та форми клітин (фіг 2) Про ступінь токсичності біологічного середовища свідчить кратність розведення досліджуваного матеріалу, в якій ще спостерігається руйнування 50% та більш клітинного моношару у 4 лунках Приклад №1 Хворий X, 1946рн, IX №5357/01 Діагноз Гострий гангренозно-перфоративний апендицит Периапендикулярний абсцес Місцевий гнійний перитоніт Рання післяопераційна злукова непрохідність кишечника Розлитий серозний перитоніт При виконанні релапаротомм, зважаючи на наявність показань, виконано назоінтестинальну штубацію Для визначення ступеню токсичності біологічних рідин хворого здійснювали забір крові з вени в об'ємі Юмл та кишкового вмісту через зонд в об'ємі 20мл 3 рідкої частини досліджуваних х біологічних середовищ робили 2 кратні розведення у середовищі Ігла та вносили в об'ємі 0,1 мл по одному розведенню до 4 лунок 96 луночного пластикового планшету для культури клітин В ті ж лунки додавали суспензію культури клітин в об'ємі 0,1мл До контрольних лунок (4шт) вносили суспензію клітин в об'ємі 0,1 мл та 0,1 мл середовища Ігла Планшет вміщували у термостат з температурою 37°С та подачею СОг Облік результатів проводили через 6 годин Так, на першу добу після релапаротомм токсичность крові (ЦПД - 50%) спостерігалась у розведенні 1 4, кишкового вмісту (ЦПД - 50%) - у розведенні 1 32 На фоні проведеної дезинтоксикаційної терапії на 2 добу після релапаротомм токсичність крові дорівнювала "0", що до кишечного вмісту ЦПД - 50% спостерігалась у розведенні 1 16 Отримані результати дали підставу для проведення детоксикації кишечника На 5 добу після релапаротомм токсичність кишечного вмісту ЦПД - 50% спостерігалась у розведенні 1 2, що може спостерігатися в нормі Отриманий результат дав підстави для видалення інтубаціиного зонду Приклад №2 Хвора П, 1959рн, IX №7460/01 Діагноз Перфоративна виразка цибулини 12палої кишки Загальний серозно-фібринозний перитоніт Ендотоксичний шок 1 - 2ст При виконанні операції, зважаючи на наявність показань, виконано назоштестинальну штубацію Для визначення ступеню токсичності біологічних рідин здійснювали забір крові хворої з вени в об'ємі Юмл та кишкового вмісту через зонд в об'ємі 20мл з наступним центрифугуванням матеріалів 3 рідкої частини досліджуваних біологічних середовищ робили 2 х кратні розведення у середовищі Ігла та вносили в об'ємі 0,1 мл по одному розведенню до 4 лунок 96 луночного пластикового планшету для культури клітин В ті ж лунки додавали суспензію культури клітин в об'ємі 0,1мл До контрольних лунок (4шт) вносили суспензію клітин в об'ємі 0,1мл та 0,1 мл середовища Ігла Планшет вміщували у термостат з температурою 37°С та подачею СОг Оцінку результатів проводили через 6 годин Так, на першу добу після релапаротомм токсичность крові (ЦПД 50%) спостерігалась у розведенні 1 8, кишечного вмісту (ЦПД - 50%) - у розведенні 1 64 На фоні проведеної дезинтоксикаційної терапії на 3 добу після операції токсичність крові дорівнювала "0", що до кишечного вмісту ЦПД - 50% спостерігалась у розведенні 1 16 Отримані результати дали підставу для проведення детоксикації кишечника На 5 добу після операції токсичність кишечного вмісту ЦПД - 50% спостерігалась у розведенні 1 2, що може спостерігатися в нормі Отриманий резуль 52951 тат дав підстави для видалення інтубаціиного зонДУ В цілому зазначений спосіб був застосований у 23 хворих із кишковою непрохідністю та розповсюдженим перитонітом, серед яких у 10 мала місце злукова непрохідність кишечника, у 6 - обтураційна непрохідність пухлинного генезу, у 7 мав місце розповсюджений перитоніт, як наслідок перфоративної виразки цибулини 12-палоі кишки, гострого деструктивного апендициту та гнійних гінекологічних захворювань У всіх випадках рівень токсичності крові та кишечного вмісту відповідав рівню інших клініко-лабораторних показників і відображав важкість захворювання Визначення рівня токсичності в динаміці дало можливість об грунтувати КІЛЬКІСТЬ, тривалість та простежити ефективність застосування сеансів дезінтоксикаційної терапії, що дало можливість більш ефективно та раціонально проводити післяопераційну консервативну терапію та в цілому скоротити термін перебування хворих у стаціонарі на 2-3 доби Заявлений спосіб визначення токсичності біологічних середовищ простий у виконанні, але дає можливість адекватно та достовірно визначити рівень токсичної дії вищезгаданих середовищ на організм людини, тому може бути використаним у всіх випадках, коли наслідки захворювання та результати лікування залежать від характеру впливу патологічно змінених біологічних середовищ на функцію органів і систем пацієнтів ФІГ.1 Фіг.2 ТОВ "Міжнародний науковий комітет" вул Артема, 77, м Київ, 04050, Україна (044)236-47-24