Спосіб оцінки токсичної дії метил-третбутилового ефіру на організм людини

Спосіб оцінки токсичної дії метилтретбутилового ефіру на організм людини, що 3 рилювання казеїнкінази-1 , відповідальний за інактивацію цього ензиму [14]. Проблема оцінки токсичної дії МТБЕ на організм ускладнюється тим, що на сьогодні не встановлені високочутливі молекулярно-генетичні біомаркери, які б давали змогу виявляти негативний вплив МТБЕ навіть при дії у низьких дозах. Все це не дає можливості визначати ступінь ризику впливу МТБЕ на здоров'я і життя людини, розробляти заходи, спрямовані на профілактику захворювань у населення. Найбільш близьким аналогом - прототипом до способу, що заявляється, є спосіб визначення токсичної дії МТБЕ за зміною маси тіла та окремих органів, вмістом в печінці Р450, рівнем гормонів у крові, тощо [15]. Але даний спосіб дає можливість визначати токсичну дію МТБЕ лише в дозах 400мг/кг та вищих, але не є ефективним при низьких дозах МТБЕ. Задачею корисної моделі є вдосконалення способу оцінки токсичної дії метил-третбутилового ефіру, встановлення біомаркерів його негативної дії для розробки ефективних заходів, спрямованих на профілактику захворювань у населення. Технічний результат, який одержують в результаті вирішення задачі, полягає у встановленні зміни експресії циркадіального гена Clock у життєво важливих органах (печінці, легенях та міокарді), як біомаркера токсичної дії МТБЕ, прогнозуванні патологічних змін в організмі, а також у своєчасній розробці цільових програм, спрямованих на попередження негативної дії МТБЕ на організм людини. Поставлена задача досягається тим, що у відомому способі, що включає введення метилтретбутилового ефіру внутрішньо лабораторним тваринам протягом тривалого періоду згідно корисної моделі виділяють РНК із печінки, легень та серця лабораторних тварин та проводять аналіз експресії мРНК Clock методом зворотної транскрипції та полімеразної ланцюгової реакції, та методом кількісної полімеразної ланцюгової реакції в реальному часі і при виявленні змін експресії циркадіального гена Clock в життєво важливих органах (печінці, легенях та міокарді) судять про токсичну дію метил-третбутилового ефіру на організм. Спосіб здійснюється наступним чином: Тотальні РНК виділяють із печінки, легень та серця щурів з допомогою реагенту Трізол (Trizol; Invitrogen, USA) згідно протоколу виробника. Осаджують РНК рівним об'ємом 2-пропанолу. Осади РНК промивають двічі 75% етанолом і розчиняють у воді, що не містить домішок рибонуклеаз. Експресію мРНК Clock досліджують методом зворотної транскрипції та полімеразної ланцюгової реакції, а також методом кількісної полімеразної ланцюгової реакції. РНК із різних органів щурів використовують як матрицю для синтезу кДНК з допомогою оліго(сГГ) праймера та Superscript II Reverse Transcriptase (Invitrogen, США) згідно протоколу виробника. Для ампліфікації кДНК Clock використовують HotStarTaq Master Mix Kit (QIAGEN, Німеччина) та специфічні для цих генів щурів пари праймерів. Для ампліфікації кДНК 54573 4 Clock використовують такі праймери: прямий (5’TGCACAGTCAGATGCTAGTG -3’) та зворотний (5’TGATCCACAAGATCAGATGG -3’) праймери. Нуклеотидні залишки цих праймерів відповідають залишкам нуклеотидів 264 - 283 та 455 - 436 в послідовності мРНК Clock щура (GenBank номер NM021856). Ці пари праймерів використовують для ампліфікації Clock як в ЗТ-ПЛР, так і в ПЛР в реальному часі. Для контролю кількості аналізуємої РНК досліджують експресією мРНК -актину. Експресія кожної смуги кДНК Clock порівнюється з експресією мРНК -актину. Продукти ампліфікації аналізують електрофорезом в 2% агарозному гелі, забарвлюючи кДНК бромистим етидієм. Гелі аналізують в системі Quantity One BioRad System (США). Переваги цього метода: висока інформативність, висока чутливість - вірогідні зміни експресії циркадіального гена Clock в життєво важливих органах (печінці, легенях та міокарді) виявлялися при дії на лабораторних тварин МТБЕ уже в дозі 0,5мг/кг. Таким чином, запропонований спосіб оцінки токсичної дії метил-третбутилового ефіру шляхом визначення зміни експресії циркадіального гена Clock в життєво важливих органах (печінці, легенях, міокарді) є чутливим, інформативним та зручним у виконанні. Зміни експресії циркадіального гена Clock можна вважати біомаркером токсичної дії МТБЕ на організм. Спосіб був апробований у відділі молекулярної біології Інституту біохімії ім. О.В. Палладіна Національної академії наук України та на кафедрі гігієни праці і професійних хвороб Національного медичного університету імені О.О.Богомольця, що дозволяє рекомендувати його для широкого впровадження. Використана література: 1. Яворовський О.П., Паустовський Ю.О., Веремей М.І. та ін. Гігієнічна характеристика умов праці та стану здоров'я у виробництві метилтретбутилового ефіру // Український журнал з проблем медицини праці. - 2005, - №3-4. - С.29-34. 2. Яворовський О.П., Паустовський Ю.О., Дроботенко В.А. та ін. Гігієнічна оцінка умов праці та стан здоров'я робітників, зайнятим виготовленням метил-третбутилового ефіру на Лисичанському НПЗ // Довкілля та здоров'я. - 2007. - №1 (40). С.34-38. 3. Eide E.J., Woolf M.F., Kang H., Woolf P., Hurst W., Camacho F., Vielhaber EX., Giovanni A., Virshup D.M. Control of mammalian circadian rhythm by CKIepsilon-regulated proteasome-mediated PER2 degradation // МоІ. Cell. Biol. - 2005. - 25, N 7. - P. 2795-2807. 4. Turek F.W., Joshu C, Kohsaka A., Lin E., Ivanova G., McDearmon E., Laposky A., Losee-Olson S., Easton A., Jensen D.R., Eckel R.H., Takahashi J.S., Bass J. Obesity and metabolic syndrome in circadian Clock mutant mice // Science. - 2005. - 308, N 5724. - P.1043-1045. 5. Oishi K., Shirai H., Ishida N. CLOCK is involved in the circadian transactivation of peroxisome-proliferator-activated receptor alpha 5 54573 (PPARalpha) in mice // Biochem. J. - 2005. - 386, PT 3. - P.575-581. 6. Rudic R.D., McNamara P., Curtis A.M., Boston R.C., Panda S., Hogenesch J.B., Fitzgerald G.A. BMAL1 and CLOCK, two essential components of the circadian clock, are involved in glucose homeostasis // PLoS Biol. - 2004. - 2, N 11. - P.E377. 7. Hogenesch J.B., Gu Y.Z., Jain S., Bradfield C.A. The basic-helix-loop-helix-PAS orphan MOP3 forms transcriptionally active complexes with circadian and hypoxia factors // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. - 1998. - 95, N 10. - P.5474.5479. 8. Gekakis N., Staknis D., Nguyen H.B., Davis F.C., Wilsbacher L.D., King D.P., Takahashi J.S., Weitz C.J. Role of the CLOCK protein in the mammalian circadian mechanism // Science. - 1998. 280, N 5369. - P. 1564-1569. 9. Tsinkalovsky О., Smaaland R., Rosenlund В., Sothern R.B., Hirt A., Steine S., Badiee A., Abrahamsen J.F., Eiken H.G., Laerum O.D. Circadian variations in clock gene expression of human bone marrow CD34+ cells // J. Biol. Rhythms. - 2007. - 22, N 2. - P.140-150. 10. Chen S.T., Choo K.B., Hou M.F., Yeh K.T., Kuo S.J., Chang J.G. Deregulated expression of the Комп’ютерна верстка О. Рябко 6 PERI, PER2 and PER3 genes in breast cancers. Carcinogenesis. - 2005. - 26, N 7. - P.1241-1246. 11. Winter S.L., Bosnoyan-Collins L., Pinnaduwage D., Andrulis I.L. Expression of the circadian clock genes Perl and Per2 in sporadic and familial breast tumors // Neoplasia. - 2007. - 9, N 10. P.797-800. 12. Lee C.C. The circadian clock and tumor suppression by Mammalian period genes. Methods Enzymol. - 2005. - 393. - P.852-861. 13. Vielhaber E., Eide E., Rivers A., Gao Z.H., Virshup D.M. Nuclear entry of the circadian regulator mPERl is controlled by mammalian casein kinase I epsilon // МоІ. Cell. Biol. - 2000. - 20, N 13. - P.48884899. 14. Gietzen K.F., Virshup D.M. Identification of inhibitory autophosphorylation sites in casein kinase I epsilon // J. Biol. Chem. - 1999. - 274, N 45. P.32063-32070. 15. de Peyster A., MacLean K.J., Stephens B.A., Ahern L.D., Westover СМ., Rozenshteyn D. Subchronic Studies in Sprague-Dawley Rats to Investigate Mechanisms of MTBE-Induced Ley dig Cell Cancer // Toxicological Sciences. - 2003. Vol.72. - P.31-42. Підписне Тираж 26 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601