Спосіб кріоконсервування сперміїв людини

Спосіб кріоконсервування сперміїв людини, який включає змішування еякулята з глюкозо 3 В основу корисної моделі поставлено задачу створити такий спосіб кріоконсервування сперміїв людини, у якому би за рахунок зміни умов інкубації та охолодження забезпечувалась можливість підвищити рухливість сперміїв після відігріву, а також скоротити тривалість процесу охолодження. Ця задача вирішується тим, що в способі кріоконсервування сперміїв людини, що включає змішування сперми з глюкозо-жовточно-цитратним кріоконсервантом, який містить кріопротектор гліцерил, і поетапне охолодження до -196°С, згідно з корисною моделлю, сперму змішують з кріоконсервантом у співвідношенні 1:4, гліцерол беруть в концентрації 28 %, а охолодження ведуть з 32°С до 4°С зі швидкістю 4°С/хв, після 5 хвилинної зупинки охолодження продовжують до -8°С з тією ж швидкістю, далі проводять сідінг і продовжують охолодження до -50°С зі швидкістю 10°С/хв, після чого зразки занурюють в рідкий азот. Зміна умов інкубації (співвідношення кріоконсерванту і сперми, підвищення концентрації гліцеролу) і режиму охолодження, який передбачає проведення сідінгу, дозволяє підвищити кріозахист клітин, і таким чином підвищити рухливість сперміїв у 1,5 рази. Процес триває лише 23 хвилини. Спосіб пояснюється наступними прикладами. Приклад 1. Для кріоконсервування брали еякулят при нормоспермії об'ємом 5 мл, з концентрацією сперміїв 75×106/мл та рухливістю 57±4,6 %. До сперми додавали 1,5 мл кріоконсерванту, що містив глюкозо-жовточно-цитратний буфер з вмістом гліцерола 28 %, і ставили в термостат при 37°С на 5 хвилин. Поліпропіленові соломини об'ємом 0,5 мл заповнювали зразком та переносили в камеру програмного заморожувача, починаючи процес охолодження. Охолоджували з 32°С до 4°С зі швидкістю 4°С/хв. Через 5 хвилин охолодження продовжували до -8°С зі швидкістю 4°С/хв. Після цього проводили сідінг, торкаючись соломін металевим пінцетом, охолодженим в рідкому азоті, і продовжували охолодження до -50°С зі швидкістю 10°С/хв, після чого зразки занурювали в рідкий азот (-196°С). Відігрівали соломини на водяній бані при 37°С впродовж 5 хвилин. Рухливість сперміїв після відігріву складала 62,3±1,8 %, після 1 години інкубації 60,1±3,2 %, через 2 та 3 години 56007 4 інкубації рухливість становила 56,4±2,1 %, та 52,2±1,6 %, відповідно. Отримані дані рухливості сперміїв після відігріву свідчать про високий рівень кріозахисту клітин після використання цього способу кріоконсервування. Приклад 2. Для експерименту брали 4 мл еякуляту з концентрацією клітин 56×106/мл та рухливістю 52±3,8. До сперми додавали 1,2 мл кріоконсерванта, що містив глюкозо-жовточно-цитратний буфер з вмістом гліцерола 28 %, і ставили в термостат при 37 °С на 5 хвилин. Поліпропіленові соломини об'ємом 0,5 мл заповнювали зразком та переносили в камеру заморожувача, починаючи процес охолодження. Охолоджували з 32°С до 4°С зі швидкістю 4°С/хв. Через 5 хвилин охолодження продовжували до 8°С зі швидкістю 4°С/хв. Сідінг не проводили. Продовжували охолодження до -50°С зі швидкістю 10°С/хв, після чого зразки занурювали в рідкий азот (-196°С). Відігрівали соломини на водяній бані при 37°С впродовж 5 хвилин. Рухливість сперміїв була визначена після відігріву еякуляту та становила 55,4±2,3 %, після години інкубації 50,1±4,3 %, впродовж останніх двох годин інкубації 46,0±3,5 %, та 24,0±2,7 %, відповідно, (табл. 1). З прикладу видно, що відсутність етапу сідінга призвела до кріопошкодження клітин та зниження рухливості впродовж трьох годин інкубації. Приклад 3. В експеримент брали еякулят зі зниженими показниками рухливості сперміїв (астеноспермія). Зразки охолоджували з 32°С до 4°С зі швидкістю 4°С/хв. Через 5 хвилин охолодження продовжували до -8°С зі швидкістю 4°С/хв. Після цього проводили сідінг, торкаючись соломин металевим пінцетом, охолодженим в рідкому азоті, і продовжували охолодження до -50°С зі швидкістю 10°С/хв, після чого зразки занурювали в рідкий азот (-196°С). Відігрівали соломини на водяній бані при 37°С впродовж 5 хвилин. Дані рухливості відігрітих сперміїв наведені в таблиці 2, з якої видно, що процес кріоконсервування зразків при астеноспермії не вплинув на динаміку рухливості клітин. Таким чином, даний спосіб можна використовувати для кріоконсервування еякулятів як в нормі,так і при астеноспермії. Таблиця 1. Показники рухливості сперміїв людини. Час після відігріву, год 0 1 Рухливість сперміїв, кріоконсервованих заявленим 62,3±1,8 60,1±3,2 способом, % Рухливість сперміїв, кріоконсервованих заявленим 55,4±2,3 50,1±4,3 способом без сідінгу, % Рухливість сперміїв кріоконсервованих за прототи41,5±1,6 40,0±2,0 пом, % 2 3 56,4±2,1 52,2±1,6 46±3,5 24±2,7 37,6±1,7 34,8±2,4 Таблиця 2. Показники рухливості сперміїв людини при астеноспермії. Час після відігріву, год 0 1 2 Рухливість нативних сперміїв (контроль), % 37,2±3,6 35,3±4,2 15,1±3,2 Рухливість кріоконсервованих сперміїв, % 24,5±2,1 13,2±2,8 7,4±3,6 3 8,5±3,7 4,3±2,7 5 56007 Джерела інформації 1. Louise Weidel, Gail S. Prins. Cryosurvival of human spermatozoa frozen in eight different buffer systems// Journal Androl - 1987. - V 8. - P. 41-47. Комп’ютерна верстка І.Скворцова 6 2. Jorge Hallak, Rakesh K. Sharma, Cheryl Wellstead, Ashok Agarwal. Cryo-preservation of human spermatozoa: comparison of TEST-yolk buffer and glycerol // Int. J. Fertil. - 2000. - V. 45, № 1. - P. 38-42. Підписне Тираж 26 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601