Спосіб оцінки стану імунокомпетентної сфери організму

Спосіб оцінки стану імунокомпетентної сфери організму, що включає визначення методом проточної цитофлюориметрії середньої інтенсивності флюоресценції (СІФ) та кількості світних клітин з визначеним фенотипом, який відрізняється тим, що на основі цих показників розраховують сумарний показник світіння (СПС) абсолютної кількості світних клітин (АКСК) в органі або периферичній крові за формулою: СПС=АКСК×СІФ і, порівнюючи цей показник з прийнятим за норму, роблять висновок про стан імунокомпетентної сфери організму. (19) (21) u201009694 (22) 03.08.2010 (24) 11.04.2011 (46) 11.04.2011, Бюл.№ 7, 2011 р. (72) ГОЛЬЦЕВ АНАТОЛІЙ МИКОЛАЙОВИЧ, ЛУЦЕНКО ОЛЕНА ДМИТРІВНА, ДУБРАВА ТЕТЯНА ГЕОРГІЇВНА, САФРАНЧУК ОЛЬГА ВОЛОДИМИРІВНА, ПОРОЖАН ЄВГЕНІЯ ОЛЕКСАНДРІВНА, БОНДАРОВИЧ МИКОЛА ОЛЕКСАНДРОВИЧ, ДІМІТРОВ ОЛЕКСІЙ ЮРІЙОВИЧ, ЧЕЛОМБІТЬКО ОЛЬГА ВАСИЛІВНА, ОСТАНКОВ МАКСИМ ВАДИМОВИЧ, РАССОХА ІРИНА ВІКТОРІВНА, СІРОУС МАРИНА АНАТОЛІЇВНА 3 гана або периферичної крові. Тому складно комплексно оцінити стан імунокомпетентної сфери, яка є показником імунного статусу організму. Крім того, може виникнути ситуація, коли один з показників відповідає нормальним значенням, а інший істотно відрізняється від норми. Тоді потрібні додаткові методи дослідження. В основу корисної моделі поставлена задача удосконалити відомий спосіб оцінки стану імунокомпетентної сфери організму шляхом введення інтегрального показника, і таким чином підвищити його об'єктивність. Ця задача вирішується тим, що, у способі оцінки стану імунокомпетентної сфери, який включає визначення методом проточної цитофлюориметрії СІФ та кількості світних клітин з визначеним фенотипом, відповідно до корисної моделі, на основі цих показників розраховують сумарний показник світіння (СПС) абсолютної кількості світних клітин (АКСК) в органі або периферичній крові за формулою: СПС=АКСК×СІФ, і, порівнюючи цей показник з прийнятим за норму, роблять висновок про стан імунокомпетентної сфери. Спосіб, що заявляється, забезпечує можливість об'єктивної оцінки функціонального стану імунокомпетентної сфери всього органа або периферичної крові по одному інтегральному показнику і не вимагає використання додаткових методів дослідження для характеристики імунного статусу. Спосіб здійснюють таким чином: В органі або периферичній крові методом проточної цитофлюориметрії визначають СІФ та відсоток клітин з визначеним фенотипом і перераховують на АКСК. Інтегральний показник розраховують за формулою: СПС=АКСК×СІФ. СПС порівнюють зі значеннями, прийнятими за норму й оцінюють стан імунокомпетентної сфери. Спосіб пояснюється наступними прикладами. Приклад 1. Стан імунокомпетентної сфери оцінювали у здорових лабораторних білих пацюків і тварин з експериментальним алергійним енцефаломієлітом (ЕАЕ). Для цього досліджували клітинну суспензію тимуса пацюків у нормі та при патології. Методом проточної цитофлюориметрії визначали клітини з фенотипом CD3, використовуючи МАТ до цього маркера. Після інкубації клітин тимуса з МАТ протягом 30 хвилин при 37°С, їх відмивали в 100мкл середовища Хенкса. До осаду додавали 500мкл середовища Хенкса. Клітини аналізували на проточному цитофлюориметрі з використанням програми Cell Quest. Реєстрували СІФ та відсоток світних клітин з маркером CD3 (Табл. 1). Отримані результати показників тварин з ЕАЕ достовірно не відрізнялись від здорових. Але при даній патології це неможливо. Після перерахування відсотка клітин тимуса здорових тварин на АКСК і помноження на показник СІФ (28,26×273=7714,98) був отримай СПС. Аналогічним чином розраховували СПС для клітин тимуса пацюків з ЕАЕ (33,19×281=9326,39), який виявився на 20,9% вище у порівнянні зі здоровими. На підставі цього 58203 4 був зроблений висновок щодо скомпрометованого стану імунокомпетентної сфери у пацюків з ЕАЕ. Приклад 2. У мишей викликали розвиток реакції трансплант проти хазяїна (РТПХ). Оцінювали стан імунокомпетентної сфери у здорових тварин і з РТПХ. Для цього визначали вміст Т-регуляторних клітин з фенотипом CD4+CD25+ у селезінці на проточному цитофлуориметрі FACS Calibur, використовуючи МАТ за протоколом, подібно прикладу 1. Реєстрували СІФ та відсоток світних клітин, з подвійним маркером (Табл.2). Отримані результати відсотка клітин були перераховані на АКСК. Було відмічено зниження АКСК і підвищення СІФ у тварин з РТПХ у порівнянні з аналогічними показниками здорових мишей, на основі чого неможливо зробити висновок про стан імунокомпетентної сфери. Розрахували СПС. У тварин з РТПХ СПС=17,67×141=2491,47, що на 14% нижче, ніж у здорових тварин - СПС=24,36×119=2898,84. Це об'єктивно свідчило про розвиток патологічного процесу, порушення функціонального стану імунокомпетентної сфери та відповідало дійсності. Приклад 3. У периферичній крові здорових білих пацюків лінії Wistar і тварин з ішемічним інсультом (II) визначали клітини з фенотипом CD4. Для цього у тварин брали зразки крові, додавали МАТ до CD4, після 30 хвилин інкубації відмивали в 100 мкл середовища Хенкса, доливали 1 мл лізіруючефіксуючого розчину і витримували 15 хвилин при кімнатній температурі. Далі центрифугували, надосадову рідину відбирали, а клітинний осад розводили у 0,5мл ізотонічного розчину. Клітини аналізували на проточному цитофлюориметрі з використанням програми Cell Quest. Реєстрували СІФ та відсоток світних клітин з фенотипом CD4, які перераховували на АКСК (Табл. 3). У тварин з II ці показники не істотно відрізнялися від аналогічних у здорових тварин, що свідчило про відсутність патології, тобто не відповідало дійсності. Об'єктивний висновок про порушення стану імунокомпетентної сфери у тварин з II був зроблений після розрахунку СПС. Він на 7,1% нижче, ніж у здорових тварин, що підтвердило наявність патологічного процесу. Приклад 4. Оцінку зміни стану імунокомпетентної сфери мишей з цукровим діабетом (ЦД) проводили до і після лікування стовбуровими клітинами кісткового мозку і порівнювали отримані результати з показниками здорових тварин. Для цього виділяли селезінку, отримували клітинну суспензію і досліджували популяцію CD8+ клітин. Після інкубації з МАТ до CD8 протягом 30 хвилин при 37°С клітини відмивали в 100мкл середовища Хенкса. Потім додавали 1мл лізіруюче-фіксуючого розчину і витримували 15 хвилин при кімнатній температурі. Після цього центрифугували, надосадову рідину відбирали, а клітинний осад розводили у 0,5мл ізотонічного розчину. Клітини аналізували на проточному цитофлюориметрі з використанням програми Cell Quest. Реєстрували СІФ та відсоток світних клітин з маркером CD8, який був перерахований на АКСК (Табл. 4). При патології АКСК збільшувалося, а 5 58203 після лікування несуттєво знижувалося, протилежним чином змінювався СІФ. З цих даних важко об'єктивно оцінити ефективність застосованої терапії. Був знайдений СПС, який свідчив про те, що стан імунокомпетентної сфери істотно змінився при ЦЦ, що відповідало дійсності, а застосована терапія стовбуровими клітинами кісткового мозку покращила цей стан. Отже, інтегральний показник СПС у порівнянні з окремими показниками СІФ та АКСК враховує функціональні зміни, що відбуваються в органі або периферичній крові, об'єктивно відображуючи стан імунокомпетентної сфери, а отже імунний статус організму. Таблиця 1 + Показники CD3 клітин в тимусі здорових пацюків і при ЕАЕ АКСК СІФ СПС Здорові тварини 28,26±1,41 273±13,65 7714,98±19,24 Тварини з ЕАЕ 33,19±3,52 281±9,1 9326,39±32,03 Таблиця 2 + + Показники CD4 CD25 клітин у селезінці здорових мишей і при РТПХ АКСК СІФ СПС Здорові тварини 24,36±2,1 119±11,4 2898,84±23,9 Тварини з РТПХ 17,67±2,5 141±10,2 2491,47±25,5 Таблиця 3 + Показники CD4 клітин у периферичній крові здорових пацюків і при II АКСК СІФ СПС Здорові тварини 99,66±13,7 227±21,6 22622,82±295,9 Комп’ютерна верстка Н. Лиcенко Тварини з II 94,63±9,8 222±19,4 21007,86±190,1 6 Таблиця 4 + Показники CD8 клітин у селезінці здорових пацюків і при ЦД АКСК СІФ СПС Здорові тварини 16,59±3,1 156±13,7 2588,04±42,5 Тварини з ЦД Тварини з ЦД до лікування після лікування 42,54±5,3 36,09±4,2 112±11,8 119,58±14,5 4764,48±62,5 4315,64±60,9 Джерела інформації: 1. Hashimoto M., Hirota К., Yoshitomi H. et al. Complement drives Thl7 cell differentiation and triggers autoimmune arthritis. // J Exp Med. - 2010 207 (6) - P.1135-1143. 2. Frey O., Meisel J., Hutloff A. et al. Inducible costimulator (ICOS) blockade inhibits accumulation of polyfunctional T helper 1/T helper 17 cells and mitigates autoimmune arthritis. // Ann Rheum Dis. 2010 - 69 (8) - P.1495-1501. 3. Terjung В., Sohne J., Lechtenberg B. et al. pANCAs in autoimmune liver disorders recognise human beta-tubulin isotype 5 and cross-react with microbial protein FtsZ. // Gut. - 2010 - 59 (6) - P.808816. 4. Кишкун А.А. Современные методы диагностики и оценки эффективности лечения инфекции, вызванной Helicobacter pylori // Клиническая Лабораторная Диагностика - 2002. - №8. - с.41-46. 5. Sari С, Ertug S., Karadam S.Y. et al. The comparative evaluation of Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA), Indirect Hemagglutination Test (IHA) and Indirect Fluorescent Antibody Test (IFAT) in the diagnosis of cystic echinococcosis. // Turkiye Parazitol Derg. - 2009 - 33 (1) - P.73-76. 6. Wolff A.S., Oftedal B.E., Kisand K. et al. Flow cytometry study of blood cell subtypes reflects autoimmune and inflammatory processes in autoimmune polyendocrine syndrome type I. // Scand J Immunol. - 2010 - 71 (6). - P.459-467. Підписне Тираж 23 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601