Спосіб визначення стереометричних характеристик ультраструктур клітин

Спосіб визначення стереометричних характеристик ультраструктур клітин, що включає стереометричну оцінку мікрофотографії з використанням стандартних окулярних вставок світлооптичного мікроскопа, який відрізняється тим, що додатково визначають довжину контактуючої поверхні кожного компартменту, відстань між контактуючими поверхнями компартментів, а надалі обчислюють Винахід відноситься до медицини, зокрема до визначення, вимірювання, або реєстрації з діагностичною ціллю та може бути використаним в патологічній анатомії та патофізіології, переважно для визначення функціонального стану серцевосудинної системи Кількісна оцінка різних параметрів морфологічних об'єктів потребує таких вимог, як надійність, точність, простота та достовірність висновків будь якого морфологічного дослідження У зв'язку з цим розроблені та продовжують активно розроблятись багаточисленні методи КІЛЬКІСНОГО стереометричного аналізу тканин та органів При цьому використовуються різні стереометричні тест-системи, вибір яких визначається конкретними морфологічними задачами дослідника Найбільш розповсюджені в цій області методи стереометрії на орган ступінь просторового сполучання структурнофункціональних компартментів і визначають стереометричні характеристики ультраструктур клітин, причому, якщо S5 - визначають високий ступінь просторового сполучання компартментів, за умов, що S _ L 1 + L 2 + L n 'ер де S - критерій ступеня просторового сполучання компартментів, І_і, І_2, Ln - довжина контактуючої поверхні компартменту, мкм, Іср - середня відстань між контактуючими поверхнями компартментів, а • _І1+І„ п де 1-і, Іп - відстань між контактуючими поверхнями компартментів на одній вимірюваній ДІЛЯНЦІ, МКМ, п - КІЛЬКІСТЬ вимірюваних ділянок 'ер ному та тканинному рівнях, які основані на використанні стандартних окулярних вставок світлового мікроскопа Менш розробленими залишаються методи, направлені на стереометричну оцінку ультраструктур на клітинному рівні, що пов'язано з використанням електронної мікроскопи та необхідністю проведення багато численних проміжних етапів КІЛЬКІСНОГО ультрамікроскопічного дослідження В свою чергу, це робить дослідження дорогим та накладає суттєві обмеження на якість рішення конкретних наукових задач До сих пір створення ефективних методів кількісної оцінки ультраструктур біологічних об'єктів залишається актуальною проблемою в морфології та є стимулом для подальшого покращення методичних способів, адекватних задачам морфологічного експерименту о о> ю 59109 В морфологічних дослідженнях відомий спосіб вимірювання основних стереометричніх параметрів, оснований на використанні стандартних окулярних вставок світлооптичного мікроскопу, які являють собою тест-системи різних типів К недолікам цього методу слід віднести його обмежену точність та чутливість, оскільки максимальне збільшення при СВІТЛОВІЙ мікроскопи менше порога, необхідного для повноцінного стереометричного аналізу багатьох ультра-та мікроструктур [1] Відомий спосіб ультраструктурометри біологічних об'єктів, що включає стереометричну оцінку мікрофотографії з використанням стандартних окулярних вставок світлооптичного мікроскопа, у ВІДПОВІДНОСТІ з яким, виготовляють позитивну мікрофотографію, накладають на останню нанесену на прозору стандартну окулярну вставку, розраховують кінцеве збільшення мікрофотографії та проводять стереометричну оцінку ультраструктур, за умови, що А=ВС, де А - кінцеве збільшення мікрофографм, В - збільшення електронного мікроскопа, С - проміжне збільшення мікрофотографії при проекції на фотобумагу [2] Причиною, що стримує досягнення очікуваного технічного результату, є обмежена інформативність дослідження, обумовлена неможливістю кількісної оцінки різнорідних ультраструктур, розміри яких на виготовленій мікрофотографії надвеликі чи надмалі, що не співпадає з масштабами тестсистеми Обмежена точність дослідження, яка пов'язана з неточністю визначення проміжних збільшень мікрофотографії, зниженням якості зображення в процесі виготовлення фотографи, а також з виникненням систематичної помилки внаслідок проведення стереометрії ультраструктур, які мають таку ж товщину, як і тестова ЛІНІЯ, ЧИ співпадають з точкою перетину тест-системи Висока матеріалоємність та тривалість дослідження пов'язані з необхідністю виготовлення мікрофотографій, визначенням проміжних збільшень мікрофотографій, отриманням електронограм на великих збільшеннях для оцінки ультраструктур малих розмірів В основу винаходу поставлено задачу розробити такий спосіб визначення стереометричних характеристик ультраструктур клітин, який дозволяє одночасно оцінити структури з різними розмірами на всій поверхні досліджуємого об'єкту, підрахувати загальну КІЛЬКІСТЬ ТИХ ЧИ ІНШИХ структур, оцінити ступінь просторового сполучання між структурно-функціональними компартментами клітин та тканин, що підвищує інформативність та точність дослідження, знижує його тривалість та матеріалоємність Означений вище технічний результат досягається тим, що у відомому способі визначення стереометричних характеристик ультраструктур клітин, що включає стереометричну оцінку мікрофотографії з використанням стандартних окулярних вставок світлооптичного мікроскопа, який відрізняється тим, що, додатково визначають довжину контактуючої поверхні кожного компартменту, відстань між контактуючими поверхнями компартментів, а надалі обчислюють ступінь просторового сполучання структурно-функціональних компартментів і визначають стереометричні характеристики ультраструктур клітин, причому, якщо S5 визначають високу ступінь просторового сполучання компартментів, за умов, що Li+L2+Ln s _ 'ер де S - критерій ступеню просторового сполучання компартментів, І_і, І_2, Ln - довжина контактуючої поверхні компартменту, мкм, Іср - середня відстань між контактуючими поверхнями компартментів, а •ер Ч п де h, Іп - відстань між контактуючими поверхнями компартментів на одній вимірюємій ДІЛЯНЦІ, мкм, п - КІЛЬКІСТЬ вимірюємих ділянок Причинно-наслідковий зв'язок сукупності істотних ознак з означеним вище технічним результатом полягає втому, що для визначення стереометричних характеристик ультраструктур клітин та біологічних тканин з'являється можливість проводити дослідження різноманітних ультраструктур, які мають різні розміри, підраховувати КІЛЬКІСТЬ структур, оцінювати ступінь просторового сполучання структурно-функціональних компартментів в біологічному об'єкті, а також досліджувати фотопластину при великих збільшеннях по всій м площині шляхом вільного пересування по предметному столику мікроскопа Все це підвищує інформативність способу визначення стереометричних характеристик у порівнянні з прототипом За рахунок відсутності проміжних етапів (виготовлення мікрофотографій, підбір та розрахунок проміжних збільшень) суттєво підвищується точність дослідження, знижується його тривалість та матеріалоємність Для доведення можливості відтворення способу з отриманням вищезазначеного технічного результату, проведено дослідження на серці щура Результати проведених досліджень на експериментальних тваринах дозволили встановити, що стереометрична оцінка електронограм, яку проводять безпосередньо на фотопластинці при різних збільшеннях стереоскопічного мікроскопу дає можливість проводити стереометрію різноманітних ультраструктур, що мають різні розміри, підраховувати КІЛЬКІСТЬ структур, оцінювати ступінь просторового сполучання структурно-функціональних компартментів в біологічному об'єкті Отже, сукупність відокремлюючих ознак винаходу, що заявляється, є істотною, бо має причинно-наслідковий зв'язок з підвищенням інформативності та точності дослідження, зменшенням матеріалоємності та тривалості обробки біологічного матеріалу ВІДОМОСТІ, ЩО підтверджують можливість здійснення способу визначення стереометричних характеристик ультраструктур клітин, що заявляєть 59109 ся, полягають в наступному Для здійснення способу визначення стереометричних характеристик ультраструктур клітин необхідне таке обладнання і матеріали як набір реактивів, ультрамікротом, електронний мікроскоп, окулярні вставки у вигляді ЛІНІЙКИ Фіксування та заливку матеріалу виконують за традиційною схемою [3] Спосіб визначення стереометричних характеристик ультраструктур клітин виконують наступним чином Приклад 1 Ультратонкий зріз 0,08мкм завтовшки, виготовлений з тканини міокарда білого безпорідного щура-самця (вагою 180г) по стандартній методиці [3], досліджували в електронному мікроскопі Фотопластинку з поля зору мікроскопа виготовили при збільшенні 3000 Оброблену та висушену фотопластинку розмістили на предметному столику стереоскопічного мікроскопа Визначили, що КІЛЬКІСТЬ мітохондрій в ЮОмкм2 кардюмюцита дорівнює 51 одиниці Підрахували довжину поверхні мітохондрм, контактуючої з кардюмюцитом (І_і) 12,3мкм, підрахували довжину контактуючої з мітохондріею поверхні кардюмюцита (І_2), яка дорівнює 10,2мкм Зробили виміри відстані між кардюмюцитом та мітохондрією на трьох ділянках (h, Ь, Із) та обчислили Іср=2 Потім за допомогою формули S= 'ер визначили, що критерій S становить 11,25 Комп'ютерна верстка Е Гапоненко одиниць, що говорить про високий ступінь просторового сполучання двох компартментів (мітохондрією та кардюмюцитом) Таким чином спосіб визначення стереометричних характеристик ультраструктур клітин дозволяє при використанні однієї фотопластини визначити параметри гетерогенних ультраструктур, розміри яких відрізняються більш ніж на 2 порядки (міофібрили, включення ЛІПІДІВ та глікогену, мітохондрм, крісти мітохондрій), та потребують використання різних збільшень та різних тестових систем Крім того, вільно переміщуючи фотопластину, вказані параметри можливо визначити по всій площині електронограми та значно збільшити ефективність її використання Також з'являється можливість оцінити ступінь просторового сполучання структурно-функціональних компартментів в КЛІТИНІ та біологічній тканині Отже, розроблений об'єкт відповідає умовам «промислова придатність», «новизна», «винахідницький рівень» і може бути кваліфікований винаходом України Джерела інформації 1 Непомнящих Л М Патологическая анатомия и ультраструктура сердца (Комплексное морфологическое исследование об ще патологи чес ко го процесса в миокарде) - Новосибирск Наука, 1981 324с 2 Автандилов Г Г Медицинская морфометрия Руководство - М Медицина, 1990 -384с 3 Уикли Б Электронная микроскопия для начинающих Пер С англ -М Мир, 1975 - з 178с Підписано до друку 05 09 2003 Тираж39 прим Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, Львівська площа, 8, м Київ, МСП, 04655, Україна ТОВ "Міжнародний науковий комітет", вул Артема, 77, м Київ, 04050, Україна