Спосіб культивування личинок гельмінтів у тварин

Спосіб культивування личинок гельмінтів у тварин, що включає їх культивування, виділення та підрахунок, який відрізняється тим, що для вирощування личинок використовують комплект двох поліпропіленових стаканчиків, додатково фекалії зволожують 0,1 % водним розчином стрептоциду, виділення личинок проводять без перенесення проб фекалій, а облік личинок гельмінтів здійснюють з використанням лічильної камери. (19) (21) u201014576 (22) 06.12.2010 (24) 10.06.2011 (46) 10.06.2011, Бюл.№ 11, 2011 р. (72) КОРЧАН ЛЕОНІД МИКОЛАЙОВИЧ, ПРИХОДЬКО ОЛЕНА ЮРІЇВНА, ПРИХОДЬКО ЮРІЙ ОЛЕКСАНДРОВИЧ, КОРЧАН МИКОЛА ІВАНОВИЧ (73) КОРЧАН ЛЕОНІД МИКОЛАЙОВИЧ, ПРИХОДЬКО ОЛЕНА ЮРІЇВНА, ПРИХОДЬКО ЮРІЙ ОЛЕКСАНДРОВИЧ, КОРЧАН МИКОЛА ІВАНОВИЧ 3 кої вологості і постійного температурного режиму в термостаті виникають сприятливі умови для розвитку різноманітних бактерій і грибків ("плісняви"), які можуть затримувати розвиток яєць і створювати небезпеку для довкілля й дослідника. Крім того, відомий метод культивування личинок потребує трудомістких робіт по монтуванню для кожної проби фекалій апарату Бермана та значних матеріальних затрат. При перенесенні проб фекалій зі склянок у апарат Бермана можлива втрата личинок і забруднення довкілля. Відомий метод також має ненадійний спосіб обліку личинок, оскільки при середній і високій інтенсивності інвазії виникають труднощі в процесі їх підрахунку на предметному або часовому склі, бактеріологічних чашках під покривним склом або у краплі осаду. Вони полягають у затраті значного часу для максимального огляду приготовлених препаратів і можливого повторного вивчення однієї й тієї ж ділянки, тобто проводиться орієнтовний облік інтенсивності інвазії. В основу корисної моделі поставлена задача розробити спосіб культивування личинок гельмінтів у тварин, шляхом удосконалення відомого способу досягти можливості отримання більш чистої культури личинок, здатності відділяти личинки окремих видів гельмінтів, уникнути використання складного і дорогого обладнання, значних затрат часу для проведення досліджень, забезпечити надійну санітарну безпечність довкілля й дослідника та підвищити ступінь достовірності результатів дослідження. Поставлену задачу вирішують створенням способу культивування личинок гельмінтів у тварин, що включає культивування, виділення і підрахунок личинок, який, згідно корисної моделі, відрізняється тим, що вирощування личинок проводять у спеціальному комплекті двох поліпропіленових стаканчиків, додатково фекалії зволожують 0,1% водним розчином стрептоциду, виділення личинок здійснюють без перенесення проб фекалій, а для їх підрахунку використовують лічильну камеру для гельмінтоларвоскопічних досліджень. Запропонований спосіб культивування личинок у тварин здійснюється наступним чином. Беруть комплект звичайних, бажано прозорих, поліпропіленових стандартних стаканчиків для гарячих і холодних продуктів об'ємом 100-150мл із внутрішнім діаметром дна 4-4,5см. Кожний комплект складається з зовнішнього і внутрішнього стаканчиків. На дні внутрішнього стаканчика роблять дрібні отвори діаметром 0,8мм (сітку). На дно внутрішнього стаканчика розміщують одним шаром досліджувану пробу фекалій (5г) і опускають його в зовнішній стаканчик на відстані 1,5см від його дна. Такий рівень занурення стаканів фіксується металевою паличкою (голкою від одноразового шприца), вставленою в стінку відповідної висоти внутрішнього стаканчика. Пробу фекалій і стінки внутрішнього стаканчика зволожують (можна користуватися побутовим розпилювачем) 0,1% водним розчином стрептоциду. Така концентрація розчину стрептоциду не знижує життєздатність яєць гельмінтів, не вбиває личинок, що вилуплюються з них та попереджує 60180 4 розвиток різноманітних бактерій і грибків, які можуть затримувати розвиток яєць і створювати небезпеку для довкілля й дослідника. Зайва рідина просочується крізь сітку внутрішнього стаканчика у зовнішній, який слугує резервуаром для підтримання вологості фекалій за інкубації в термостаті. Для стандартизування температурного режиму в різні періоди року і в різних умовах лабораторії, стаканчики з досліджуваними пробами ставлять у термостат, інкубація за температури 27±1°С. Для забезпечення умов диференціювання личинок до інвазійної стадії фекалії жуйних тварин і коней культивують 10-14 днів, собак - 10 днів, свиней - 4 дні (з урахуванням терміну розвитку личинок стронгілят та рабдитат різних видів до інвазійної стадії). Щоденно проби виймають із термостату, злегка зволожують розчином стрептоциду і проводять їх аерацію протягом 30 хвилин (витримують поза термостатом). Раз у три дні фекалії обережно перевертають скляною паличкою. У випадку забруднення рідини у зовнішньому стакані, її можна замінити, попередньо перевірив у ній вміст і стадійність розвитку личинок гельмінтів. Після закінчення терміну культивування для виділення личинок в зовнішній стаканчик доливають до 30,0мл теплої води (40°С). Внутрішній стаканчик опускають у зовнішній до тих пір, щоб розкладений шар фекалій лише стикався із теплою водою, а не занурювався в неї. Такий рівень занурення фекалій у теплу воду фіксується металевою паличкою (голкою від одноразового шприца) вставленою в стінку відповідної висоти внутрішнього стаканчика. Дослідні проби ставлять у термостат (40±1°С) і витримують протягом двох годин. За цей, час внаслідок підсихання верхньої й зволоження нижньої частин фекалій, личинки переходять в активний стан і мігрують у теплу воду. Вони не здатні плавати й осідають на дно зовнішнього стаканчика. Через дві години внутрішній стаканчик обережно виймають. Половину об'єму води із зовнішнього стаканчика виливають у першу центрифужну пробірку, а залишок рідини змішують із осадом і виливають у другу центрифужну пробірку. Для запобігання втрати личинок дно зовнішнього стаканчика ополіскують чистою водою першої пробірки. Пробірки центрифугують при 1000об./хв. протягом двох хвилин. Потім рідину із пробірок відбирають, а осад ресуспендують в 1мл надосадкової рідини, розносять по коміркам запропонованої нами лічильної камери для гельмінтоларвоскопічних досліджень (Пат. 25476 Україна, МПК С12М3/00. Камера для гельмінтоларвоскопічних досліджень / Корчан Л.М., Корчан М.І. Бородай А.Б. (UA). - №U200703576; заявл. 02.04.2007: опубл. 10.08.2007, бюл. №12/2007) і проводять мікроскопію (підрахунок личинок в 1мл суспензії, отриманої із 5г фекалій). За високої інтенсивності інвазії (високої концентрації личинок гельмінтів) можна зробити більше розведення осаду личинок перед проведенням мікроскопії з наступним урахуванням його під час математичних підрахунків. 5 60180 Таким чином, запропонований спосіб культивування личинок гельмінтів у тварин досить ефективний. Точність дослідження запропонованим способом обумовлена в більшості стандартизацією проведених у ньому дій, має надійний і простий кількісний облік личинок у пробі або в 1г досліджуваних фекалій при середній і високій інтенсивності інвазії з використанням лічильної камери. Його використання не потребує складного обладнання й значних затрат часу для дослідження, сприяє Комп’ютерна верстка Н. Лиcенко 6 більшій санітарній безпечності, попереджує розвиток різноманітних бактерій і грибків, які можуть затримувати розвиток яєць та створювати небезпеку для довкілля й дослідника. Спосіб також дає можливість отримати чистішу культуру личинок, що полегшує проведення її мікроскопії; відділяти, за необхідності, личинок окремих видів гельмінтів. Все це значно сприяє підвищенню ефективності лікування тварин, удосконаленню проведення основних протипаразитарних заходів. Підписне Тираж 24 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601