Спосіб визначення фосфату у присутності легкогідролізуючих органічних сполук фосфору

Спосіб визначення фосфату у присутності легкогідролізуючих органічних сполук фосфору з 3 60496 способу є і невелика чутливість, що може стати на заваді при аналізі деяких біологічних рідин. Задачею даної корисної моделі є підвищення точності та чутливості визначення фосфату у присутності ЛОФ. Задача вирішується способом визначення фосфату у присутності легкогідролізуючих органічних сполук фосфору з використанням ГПК, який відрізняється тим, що в якості аналітичної форми використовується іонний асоціат (ІА) 12молібдофосфорного гетерополіаніону з поліметиновим барвником астрафлоксином, а для стабілізації забарвлення і зменшення впливу гідролізу легкогідролізуючих органічних сполук фосфору одразу після утворення ІА створюють рН 5,0-5,5. При визначенні фосфату у присутності ЛОФ спочатку отримують 12-молібдофосфорний гетерополікомплекс при реакції фосфату з підкисленим розчином молібдату, при взаємодії якого з поліметиновим барвником астрафлоксином утворюється інтенсивно забарвлений іонний асоціат. Реакція утворення комплексу і іонного асоціату є миттєвими. Тому, по-перше, якщо здійснити вимірювання одразу після змішування розчинів, вплив гідролізу ЛОФ буде незначним. По-друге, іонний асоціат астрафлоксину з 12-молібдофосфатом на відміну від гетерополісиней є стійким і у слабкокислому середовищі. Відомо, що при рН>4,5 гідроліз ЛОФ практично припиняється. Для стабілізації забарвлення запропоновано одразу після отримання реакційної суміші вводити ацетатний буферний розчин з рН 5,0. Треба враховувати й те, що в цих умовах гідроліз ЛОФ вже не впливає на оптичну густину розчину, тому що при рН 5,0 ГПК не може утворюватися. Розчин ІА при рН 5,0 є стійким протягом декількох годин. Рівняння утворення 12-молібдофосфорного комплексу і його іонного асоціату з астрафлоксином наступні: 32+ 3НРО4 +12МоО4 +23Н =РМо12О40 3+ РМо12О40 +3АФ =(АФ)3РМо12О40 Структурна формула барвника астрафлоксину CH3 CH3 4 Запропонований спосіб є цілком придатним і для визначення ЛОФ у сумішах з фосфатом. Концентрацію ЛОФ визначають після їх повного гідролізу як різниця між загальним вмістом фосфору і концентрацією ортофосфату у пробі. Перевагами запропонованого способу визначення фосфату у присутності ЛОФ є його простота, в ньому не використовуються складні прилади або аналітичні операції. Вимірювання можуть проведені на будь-якому спектрофотометрі або фотоколориметрі. В методиці визначення не застосовуються дорогі або малодоступні реагенти. Застосована реакція є швидкою і однією з найбільш чутливих. Молярний коефіцієнт ІА АФ-МФК 5 -1 -1 дорівнює 1,510 моль лсм . Закон Бера виконується в інтервалі концентрацій фосфору (V) (4-8 80)10 моль/л. Приклад 1. Визначення КФ та фосфату у суміші. В колбу на 25 мл вносять 5 мл 1 М НСl, 7 мл -4 0,01 н Na2MoO4, 1 мл 10 М астрафлоксину. В отриманий розчин реагенту вносять аліквоту суміші розчинів фосфату і КФ, перемішують та одразу додають 5 мл 3,6 М CH3COONa (цієї кількості ацетату натрію достатньо, аби створити ацетатну буферну суміш з рН 5,0±0,2). Доводять дистильованою водою до позначки. Оптичну густину вимірюють в кюветах на 5 см на спектрофотометрі або фотоколориметрі при 580 нм відносно дистильованої води. Для визначення загального вмісту фосфору в колбу на 25 мл вносять 5 мл 1 М НСl, ті ж самі аліквоти фосфату і КФ, що у попередній частині аналізу, доводять об'єм дистильованою водою до 15 мл. Нагрівають на водяній бані при температурі 60-80°С протягом 5 хв. Після охолодження дода-4 ють 7 мл 0,01 М Na2MoO4, 1 мл 10 М астрафлоксину, доводять дистильованою водою до позначки. Оптичну густину вимірюють в кюветах на 5 см на спектрофотометрі або фотоколориметрі при 580 нм відносно дистильованої води. Приклад аналізу модельних сумішей КФ та фосфату наведений у таблиці 1. CH3 H3C + N N CH3 Cl CH3 Таблиця 1 Визначення фосфату та КФ в модельних сумішах Введено, М КФ Р -6 410 -6 410 -6 410 -6 210 -7 810 -7 810 -7 4,510 -7 8,510 -7 8,510 -7 3,610 -7 8,510 Р, моль/л R, % -7 (1,16±0,07)10 -7 (5,71±0,19)10 -7 (9,7±0,5)10 -7 (9,06±0,12)10 -7 (3,8±0,2)10 -7 (8,33±0,18)10 101 100 99,7 105 98,0 Знайдено, М P після гідролізу, моль/л -6 (4,15±0,14)10 -6 (4,8±0,2)10 -6 (5,02±0,10)10 -6 (2,99±0,06)10 -6 (1,15±0,06)10 -6 (1,62±0,06)10 КФ за різницею, моль/л -6 4,0310 -6 4,2310 -6 4,0510 -6 2,0810 -7 7,6910 -7 7,8710 R, % 100 105 101 104 96,1 98,3 5 60496 Приклад 2. Визначення ортофосфату у плазмі крові. Для відокремлення протеїнів в колбу на 25 мл вносять 1 об'єм плазми, 2 об'єми 10% трихлороцтової кислоти. Відфільтровують осад через паперовий фільтр (синя стрічка). Фільтрат доводять до 25 мл дистильованою водою. Проводять фотометричну реакцію. В колбу на 25 мл вносять 5 мл 1 М НСl, 7 мл 0,01 М Na2MoO4, -4 1мл 10 М астрафлоксину. В отриманий розчин 6 реагенту вносять аліквоту фільтрату, перемішують та одразу додають 5 мл 3,6 М СН3СОONa (цієї кількості ацетату натрію достатньо, аби створити ацетатну буферну суміш з рН 5,0±0,2). Доводять дистильованою водою до позначки. Оптичну густину вимірюють у кюветах на 5 см на спектрофотометрі або фотоколориметрі при 580 нм відносно дистильованої води. Приклади результатів аналізу наведені у таблиці 2. Таблиця 2 Визначення ортофосфату у плазмі крові Зразок Зразок 1 Зразок 2 Зразок 3 Зразок 4 Знайдено РО4 ІА AF-12-молібдофосфат Введено 3РО4 , моль/л -4 210 -4 810 -3 1,610 -4 410 -4 810 -4 310 -4 510 -4 6,510 Ср, моль/л -4 (4,4±0,2)10 -4 (6,45±0,09)10 -3 (1,20±0,05)10 -3 (2,01±0,09)10 -4 (5,66±0,17)10 -4 (9,37±0,15)10 -3 (1,36±0,06)10 -3 (1,77±0,04)10 -4 (8,75±0,15)10 -3 (1,17±0,06)10 -3 (1,38±0,05)10 -3 (1,55±0,04)10 Спосіб може бути використаний при визначенні неорганічного фосфату, легкогідролізуючих органічних ефірів фосфору за рахунок визначення фосфору, який вивільнюється під час ензимного гідролізу, ензимів, інгібіторів ензимного гідролізу та розповсюджений на інші органічні сполуки фосфору, зокрема, фосфоліпіди, фосфопротеїни, аденінові нуклеозіди та ін. Джерела інформації: 1. Baginski E. S., Epstein E., Zak В. Огляд методів визначення фосфату // Annals Clin.Labor.Sci. - 1975. - Vol.5. - P.399. 2. Drueckes P., Schinzel R., Palm D. Фотометричний мікротитриметричний метод визначення неорганічних фосфатів у присутності легкогідролізуючих органічних сполук фосфору // Analyt.Biochem. - 1995. - Vol.230. - P.173. Комп’ютерна верстка Л. Ціхановська Sr R, % 0,04 0,011 0,04 0,04 0,02 0,013 0,04 0,019 0,013 0,04 0,03 0,023 101 94,6 97,9 105 104 97,3 100 103 3 Молібденова синь [4] Ср, моль/л Sr -4 (4,3±0,2)10 -3 (2,06±0,07)10 -4 (5,4±0,2)10 -4 (8,99±0,14)10 -3 (1,28±0,07)10 -3 (1,71±0,06)10 -4 (8,70±0,16)10 -3 (1,34±0,07)10 -3 (1,57±0,04)10 R, % 0,04 0,026 0,03 0,013 0,05 0,03 0,011 101 95,2 101 0,04 0,023 92,4 106 3. Saheki S., Takeda A., Shimazu T. Визначення неорганічного фосфату у слабкокислому середовищі, яке підходить для вимірювання активності глікоген фосфорілази // Anal. Biochem. - 1985. Vol.148. - P.277. 4. Lowry O.H., Lopez J.A. Визначення неорганічних фосфатів в присутності легкогідролізуючих органічних сполук фосфору // J. Biol. Chem. - 1945. - Vol.162. - P.421. 5. Furchgott R. F., Gubareff Т. Визначення неорганічних фосфатів та креатинфосфату в тканевих екстрактах // J. Biol. Chem. - 1956. - Vol.223, N 1. - P.377. 6. Патент США №3853469, 1974 р. Реагент і метод для визначення фосфору. МКВ G01n 31/22, G01n 33/16. Підписне Тираж 24 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601