Спосіб визначення активності лужної фосфатази

Спосіб визначення активності лужної фосфатази, що заснований на спектрофотометричному визначенні фосфату після ензиматичного гідролізу фосфатвмісного субстрату, який відрізняється тим, що як аналітичну форму для визначення фосфату застосовують іонний асоціат 12молібдофосфорного гетерополіаніону з поліметиновим барвником. (19) (21) u201013227 (22) 08.11.2010 (24) 25.06.2011 (46) 25.06.2011, Бюл.№ 12, 2011 р. (72) ХЛИНЦЕВА СВІТЛАНА ВІКТОРІВНА, ВИШНІКІН АНДРІЙ БОРИСОВИЧ (73) ДНІПРОПЕТРОВСЬКИЙ НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ ІМЕНІ ОЛЕСЯ ГОНЧАРА 3 60495 підвищення простоти, точності, експресності та чутливості визначення активності ЛФ. Задача вирішується способом, заснованим на спектрофотометричному визначенні фосфату після ензиматичного гідролізу фосфатвмісного субстрату і, згідно корисної моделі, як аналітичну форму для визначення фосфату застосовують іонний асоціат 12-молібдофосфорного гетерополіаніону з поліметиновим барвником. При визначенні активності ЛФ як субстрату використовували динатрій феніл фосфат або пірофосфат, інкубацію проводили при 37 °С протягом 30 хв, а швидкість реакції визначали за фосфатом, який утворюється при гідролізі фенілфосфату. Для визначення фосфату використовували швидку, високочутливу та селективну реакцію утворення іонного асоціату 12-молібдофосфату з поліметиновим барвником астрафлоксином. Як субстрат можна використовувати пірофосфат, фторфосфат й інші фосфатвмісні сполуки, які гідролізують у присутності ЛФ. Перевагами запропонованого способу визначення активності ЛФ є простота, експресність. Застосована реакція для визначення фосфату є швидкою і однією з найбільш чутливих. Молярний коефіцієнт іонного асоціату 12молібдофосфорного гетерополіаніону з астрафло5 -1 -1 ксином дорівнює 1,510 моль лсм . Закон Бера виконується в інтервалі концентрацій фосфору(V) -8 (4-80) 10 моль/л, межа визначення активності ЛФ складає 0,2 U/л. Приклад 1. Методика визначення активності ЛФ. Приготування реагенту: в колбу на 25 мл вносять 1,25 мл конц. НСl, 2,3 мл 0,1 М Na2MoO4, 1,8 -3 мл 10 М астрафлоксину, доводять об'єм дистильованою водою до позначки. Приготування карбонатного буферного розчину: 1,68 г натрію бікарбонату розчиняють в воді, доводять рН до 9,3 0,3 М натрію карбонатом, доводять об'єм до 100 мл дистильованою водою. 4 Приготування субстратно-буферного розчину: 32 мг натрій фенілфосфату розчиняють в воді, додають 2,5 мл 0,3 М карбонатного буферного розчину, доводять об'єм дистильованою водою до 25 мл. В пробірку вносять 2,1 мл субстратнобуферного розчину, витримують 3 хв в термостаті при температурі 37 °С, додають аліквоту розчину фосфатази, яка має активність у межах 0,2-4 U/л. Проводять інкубацію в термостаті при температурі 37 °С протягом 30 хв. Охолоджують до кімнатної температури, додають 3 мл розчину реагенту, доводять об'єм до 10 мл та вимірюють оптичну густину в кюветах на 5 см на спектрофотометрі або фотоколориметрі при 580 нм відносно дистильованої води. При необхідності визначення більшої активності ЛФ, ніж 4 U/л, потрібно розводити розчин після інкубації. Приклад 2. Визначення активності ЛФ у плазмі крові. В пробірку вносять 2,1 мл субстратнобуферного розчину, (виготовлення описано у прикладі 1), витримують 3 хв в термостаті при температурі 37 °С, додають 0,07 мл плазми крові. Проводять інкубацію в термостаті при температурі 37 °С протягом 30 хв. Далі проводять операцію відокремлення протеїнів, щоб позбавитися їх шкідливого впливу. До попереднього розчину додають 3 мл 10 % трихлоруксусної кислоти, відфільтровують осад через паперовий фільтр (синя стрічка). Фільтрат доводять до 25 мл дистильованою водою. Аліквоту фільтрату змішують з 3 мл реагенту (див. приклад 1), доводять об'єм до 10 мл та вимірюють оптичну густину в кюветах на 5 см на спектрофотометрі або фотоколориметрі при 580 нм відносно дистильованої води. Результати аналізу наведені в таблиці 1. Спосіб дозволяє визначати активність ЛФ у межах 0,7 - 1000 U/л. Таблиця 1 Визначення активності ЛФ в плазмі крові Зразок Зразок 1 Зразок 2 Зразок 3 Зразок 4 Зразок 5* Активність за методикою по фенолу [2] U/1** мккат/л*** 66,6 1,11 25,5 0,43 22,1 0,37 21,7 0,36 Активність за запропонованою методикою U/1 мккат/л 67,7 1,13 26,5 0,44 21,3 0,36 21,4 0,36 64,2 1,07 * як субстрат використовували пірофосфат. ** 1 U це така кількість будь-якого ферменту, яка в оптимальних умовах каталізує перетворення 1 мікромолю субстрату або утворення 1 мікромолю продукту за хвилину (мкмоль/хв). *** 1 кат - це кількість ферменту, яка забезпечує перетворення 1 моль субстрату за 1 сек (моль/с). В медицині активність ферменту приводять у розрахунку на 1 л біологічної рідини. Запропонований спосіб дозволив підвищити чутливість визначення активності ЛФ до 0,2 U/л, покращити точність визначення за рахунок зниження заважаючого впливу гідролізу органічних сполук фосфору, значно зменшити час, необхідний для виконання аналізу, тобто знизити час інкубування з 50 до 30 хв, а час утворення забарвленої речовини з 20 до 1 хв. 5 60495 Джерела інформації: 1. King E.J., Armstrong A.R. Зручний метод для визначення активності фосфатази в сироватці крові та жовчі // Canad. Med. Assoc. J. - 1934. - Vol. 31. - P. 376. 2. Kind P.R.N., King EJ. Визначення фосфатази у плазмі за реакцією продукту гідролізу - фенолу з 4-аміно-антипірином. // J. Clin. Path. – 1954. - Vol. 7.- P. 322. 3. Bessey О.A., Lowry O.H., Brock M.J. Методика для швидкого визначення лужної фосфатази з п'ятьма кубічними міліметрами сироватки // J. Biol. Chem. - 1946. - Vol. 164. - P. 321. 4. Патент США № 4306020, 1981 p. Суміш та метод для аналізу лужної фосфатази. МКВ C12Q 1/42. Комп’ютерна верстка Л. Купенко 6 5. Bodansky А. Дослідження фосфатази II. Визначення фосфатази в сироватці крові. Фактори, які впливають на точність визначення // J. Biol. Chem. - 1933. - Vol. 101. - P. 93. 6. Патент США № 3926735,1975 p. Спосіб визначення лужної фосфатази. МКВ C01N 31/14. 7. Baykov A.A., Evtushenko O.A., Avaeva S.M. Метод малахітового зеленого для визначення ортофосфату та його застосування у імунологічному аналізі, заснованому на використанні в якості ензиму лужної фосфатази // Anal. Biochem. - 1988. Vol. 171, N 2. - P. 266. Підписне Тираж 24 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601