Спосіб оцінки токсичної дії метил-третбутилового ефіру у щурів

Спосіб оцінки токсичної дії метилтретбутилового ефіру у щурів, що включає визначення зміни маси тіла та окремих органів, який 3 регуляції. Більше того, виявлено сайт аутофосфорилювання казеїнкінази-1, відповідальний за інактивацію цього ензиму [14]. Проблема оцінки токсичної дії МТБЕ на організм ускладнюється тим, що на сьогодні не встановлені високочутливі молекулярно-генетичні біомаркери, які б давали змогу виявляти негативний вплив МГБЕ навіть при дії у низьких дозах. Все це не дає можливості визначати ступінь ризику впливу МТБЕ на здоров'я і життя людини, розробляти заходи, спрямовані на профілактику захворювань у населення. Найбільш близьким аналогом-прототипом до способу, що заявляється, є спосіб визначення токсичної дії МТБЕ за зміною маси тіла та окремих органів, вмістом в печінці Р450, рівнем гормонів у крові тощо [15]. Але даний спосіб дає можливість визначати токсичну дію МТБЕ лише в дозах 400 мг/кг та вищих, але не є ефективним при низьких дозах МТБЕ. Задачею корисної моделі є вдосконалення способу оцінки токсичної дії метил-третбутилового ефіру, встановлення біомаркерів його негативної дії для розробки ефективних заходів, спрямованих на профілактику захворювань у населення. Технічний результат, який одержують в результаті вирішення задачі, полягає у виявленні виникнення альтернативних сплайс-варіантів мРHК 6-фосфофрукто-2-кінази/фруктозо-2,6бісфосфатази-4 (PFKFB-4) в життєво важливих органах (печінці та легенях), як біомаркера токсичної дії МТБЕ, прогнозуванні патологічних змін в організмі, а також у своєчасній розробці цільових програм, спрямованих на попередження негативної дії МТБЕ на організм людини. Поставлена задача вирішується тим, що у відомому способі, який включає визначення зміни маси тіла та окремих органів тощо, згідно з корисною моделлю, виділяють РНК із печінки та легень лабораторних тварин та проводять аналіз експресії PFKFB-4 методом зворотної транскрипції та полімеразної ланцюгової реакції, а також методом кількісної полімеразної ланцюгової реакції, синтезують і клонують кДНК PFKFB-4 в pCRII-TOPO векторі та аналізують за допомогою агарозного гель-електрофорезу і при виявленні альтернативних сплайс-варіантів мРНК 6-фосфофрукто-2кінази/фруктозо-2,6-бісфосфатази-4 (PFKFB-4) в життєво важливих органах (печінці та легенях) судять про токсичну дію метил-третбутилового ефіру на організм. Спосіб здійснюється наступним чином: Тотальні РНК виділяють із печінки та легень щурів за допомогою реагенту Трізол (Trizol; Invitrogen, USA) згідно з протоколом виробника. Осаджують РНК рівним об'ємом 2-пропанолу. Осади РІІК промивають двічі 75 % етанолом і розчиняють у воді, що не містить домішок рибонуклеаз. Експресію мРНК PFKFB-4 досліджують методом зворотної транскрипції та полімеразної ланцюгової реакції, а також методом кількісної полімеразної ланцюгової реакції. РНК із різних органів щурів використовують як матрицю для синтезу кДНК з допомогою оліго(dT) праймера та 60911 4 SuperScript II Reverse Transcriptase (Invitrogen, США) згідно з протоколом виробника. Для ампліфікації кДНК PFKFB-4 використовують та "MasterCycler Personal" (Eppendorf, Німеччина) та специфічні для цих генів щурів пари праймерів Sigma (USA) чи Metabion (Germany). Для ампліфікації кДНК PFKFB-4 використовують такі праймери: прямі 5' GGGATGGCGTCCCCACGGGAAC-3' (M1), 5'-TATCTGTGTGGATCCTGAGG-3' (M2) чи 5'-AGCGTGGAAGGTCCTCAACG-3' (М3) та зворотні 5'-CAAGGCACACTGCTTCCTG-5' (M5), 5' GTCAAGGAAGTAGGCCAG-3' (М6) чи 5'-GATTCTCAGCAGCAGGTCAG-3' (M7) праймери. Нуклеотидні залишки цих праймерів відповідають залишкам нуклеотидів 32-53, 366-385, 9911010 (прямі праймери) та 358-340, 1246-1229 чи 1637-1618 (GenBank номер NM_019333). Для аналізу експресії альтернативних сплайсваріантів мРНК PFKFB-4 EU404101 використовували прямий праймер 5'CAGTTCATCAGTGACCAGAAC-3' (M8) та зворотний праймер 5' ACCAGGTCTTCATAGGACGG-3' (M9). Нуклеотидні залишки цих праймерів відповідають залишкам нуклеотидів 893-913 та 1 1431102 кДHК PFKFB-4 щурів (GenBank accession number NM_019333). Ці пари праймерів використовують для ампліфікації PFKFB-4 як в полімеразній ланцюговій реакції, так і в кількісній полімеразній ланцюговій реакції в реальному часі. Для контролю кількості аналізуємої РНК досліджують експресією мРНК  актину. Експресія кожної смуги кДНК PFKFB-4 порівнюється з експресією мРНК  -актину. Продукти ампліфікації аналізують електрофорезом в 2 % агарозному гелі, забарвлюючи кДНК бромистим етидієм. Гелі аналізують в системі Quantity One BioRad System (США). Переваги цього способу: висока інформативність, висока чутливість - утворення альтернативних сплайс-варіантів мРНК PFKFB-4 в життєво важливих органах (печінці та легенях) виявлялися при дії на лабораторних тварин МТБЕ уже в дозі 0,5 мг/кг. Таким чином, запропонований спосіб оцінки токсичної дії метил-третбутилового ефіру шляхом визначення виникнення альтернативних сплайсваріантів мРНК PFKFB-4 в життєво важливих органах (печінці та легенях) є чутливим, інформативним та зручним у виконанні. Виникнення альтернативних splice варіантів mРНК 6-фосфофрукто-2кінази/фруктозо-2,6-бісфосфатази-4 (PFKFB-4) в життєво важливих органах (печінці та легенях) можна вважати біомаркером токсичної дії МТБЕ на організм. Спосіб був апробований у відділі молекулярної біології Інституту біохімії ім. О.В. Палладіна Національної академії наук України та на кафедрі гігієни праці і професійних хвороб Національного медичного університету імені О.О. Богомольця, що дозволяє рекомендувати його для широкого впровадження. 5 60911 Джерела інформації:. 1. Яворовський О.П., Паустовський Ю.О., Веремей М.І. та ім. Гігієнічна характеристика умов праці та стану здоров'я у виробництві метилтретбутилового ефіру //Український журнал з проблем медицини праці.-2005.- № 3-4, - С. 29-34. 2. Яворовський О.П., Паустовський Ю.О., Дроботенко В.А. та ін. Гігієнічна оцінка умов праці та стан здоров'я робітників, зайнятим виготовленням метил-третбутилового ефіру на Лисичанському НГІЗ //Довкілля та здоров'я.-2007.- № 1 (40).- С. 34-38. 3. Eide E.J., Woolf M.F, Kang К, Woolf P., Hurst W., Camacho F., Vielhaber E.L., Giovanni A., Virshup D.M. Control of mammalian circadian rhythm by CKIepsilon-regulated proteasome-mediated PER2 degradation // Мої. Cell. Bid.-2005.-25, N 7. - P. 2795-2807. 4. Turek F.W., Joshu C, Kohsaka A., Lin E., Ivanova G., McDearmon E., Laposky A., Losee-Olson S., Easton A., Jensen D.R., Eckel R.H., Takahashi J.S., Bass J. Obesity and metabolic syndrome in circadian Clock mutant mice / Science.-2005.-308, N 5724. - P. 1043-1045. 5. Oishi K., Shirai H., ishidaN. CLOCK is involved in the circadian transactivation of peroxisomeproliferator-activated receptor alpha (PPARalpha) in mice // Biochem. J.-2005.-386, PT 3. - P. 575-581. 6. Rudic R.D., McNamara P., Curtis A.M., Boston R.C., Panda S., I Iogeneseh J.B., Fitzgerald G.A. BMAL1 and CLOCK, two essential components oFthe circadian clock, are involved in glucose homeostasis // PLoS Biol.-2004.-2 Nll.-P. E377. 7. Hogenesch J.B., Gu Y.Z., Jain S., Bradfield C.A. The basic-helix-loop-helix-PAS orphan MOP3 forms transcriptionally active complexes with circadian and hypoxia factors // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.-1998.-95, N 10. - P. 5474-5479, Комп’ютерна верстка А. Крижанівський 6 8. Gekakis N., Staknis D., Nguyen H.B., Davis F.C., Wilsbacher L.D., King D.P. Takahashi J.S., Weitz CJ. Role of the CLOCK protein in the mammalian circadian mechanism // Science.-1998.280, N 5369. - P. 1564...1569. 9. Tsinkalovsky O., Smaaland R., Rosenlund В., Sothern R.B., Hirt A., Steine S. Badiee A., Abrahamsen J.F., Eiken H.G., Laerum O.D. Circadian variations in clock gene expression of human bone marrow CD34+ cells //. 1. Biol. Rhythms.-2007.-22, N 2. - P. 140-150. 10. Chen ST., Choo K.B., Hou M.F., Yeh K.T., Kuo S.J., Chang J.G. Deregulate expression of the PERI, PER2 and PER3 genes in breast cancers. Carcinogenesis.-2005.-26, N 7. - P. 1241-1246. 11. Winter S.L., Bosnoyan-Collins L., Pinnaduwage D., Andrulis I.L. Expression of the circadian clock genes Perl and Per2 in sporadic and familial breast tumors // Neoplasia.-2007.-9, N 10. - P. 797-800. 12. Lee C.C. The circadian clock and tumor suppression by Mammalian period genes. Methods Enzymol.-2005.-393.-P. 852-861. 13. Vielhaber В., Eide E., Rivers A., Gao Z.H., Virshup D.M. Nuclear entry ofthe circadian regulator mPERl is controlled by mammalian casein kinase 1 epsilon // Мої. Cell. Biol.-2000.-20, N 13. - P. 48884899. 14. Gietzen K.F., Virshup D.M. Identification of inhibitory autophosphorylation sites in casein kinase 1 epsilon // J. Biol. Chem.-1999.-274, N 45. - P. 3206332070. 15. de Peyster A., MacLean K.J., Stephens B.A., Ahem L.D., Westover СМ., Rozenshteyn D. Subchronic Studies in Sprague-Dawley Rats to Investigate Mechanisms of MTBE-Induced Leydig Cell Cancer //Toxicological Sciences.-2003.-Vol.72.P.31-42. Підписне Тираж 24 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601