Спосіб підготовки кріоконсервованих фрагментів надниркових залоз новонароджених поросят для трансплантації

Спосіб підготовки кріоконсервованих фрагментів надниркових залоз новонароджених поросят для трансплантації, що включає розморожування фрагментів, видалення кріопротектора та рекультивування протягом 2 діб в середовищі 199, збагаченому 10 % ембріональної телячої сироватки, який відрізняється тим, що рекультивування проводять при температурі 24 °С. (19) (21) u201013487 (22) 15.11.2010 (24) 25.07.2011 (46) 25.07.2011, Бюл.№ 14, 2011 р. (72) УСТИЧЕНКО ВІКТОРІЯ ДМИТРІВНА, АЛАБЕДАЛЬКАРІМ НАТАЛІЯ МИХАЙЛІВНА, БОНДАРЕНКО ТЕТЯНА ПЕТРІВНА (73) ІНСТИТУТ ПРОБЛЕМ КРІОБІОЛОГІЇ І КРІОМЕДИЦИНИ НАЦІОНАЛЬНОЇ АКАДЕМІЇ НАУК 3 61440 Кріоконсервовані фрагменти надниркових залоз новонароджених поросят відігрівають при 42 °С та видаляють кріопротектор шляхом 4-разової заміни живильного середовища. Далі рекультивують при 24 °С в атмосфері з 5 % СО2 протягом 2 діб в 2 мл середовища 199, що містить 10 % ембріональної телячої сироватки, 100 Од/мл пеніциліну та 75 мкг/мл канаміцину. Приклад 1 Новонароджених поросят забивали з використанням ефірного наркозу, надниркові залози негайно вилучали в стерильних умовах, відмивали середовищем 199, що містило 100 Од/мл пеніциліну і 75 мкг/мл канаміцину, подрібнювали на фра3 гменти розміром 1-3 мм та кріоконсервували в присутності 5 % ДМСО зі швидкістю охолодження 1С/хв. [3]. Кріоконсервовані фрагменти надниркових залоз відігрівали при 42 °С, видаляли кріопротектор шляхом 4-разової заміни живильного середовища та рекультивували при 24 °С в атмосфері з 5 % СО2 протягом 2 діб в 2 мл середовища 199, що містить 10 % ембріональної телячої сироватки, 100 Од/мл пеніциліну та 75 мкг/мл канаміцину. Після рекультивування визначали базальну та стимульовану секрецію кортизолу. Вивчення стимульованої секреції проводили при додаванні до середовища інкубації дбцАМФ до кінцевої концентрації 2 ммоль/л. Рівень кортизолу в середовищі інкубації фрагментів визначали методом радіоімунологічного аналізу з використанням стандартних тест-наборів 125 СТЕРОН-К- І-М (Білорусія) і нормували на білок, концентрацію якого визначали за методом Бредфорд [3]. Статистичну обробку результатів проводили з використанням t-критерію Стьюдента і однофакторного дисперсійного аналізу (ANOVA) - для непараметричних даних. Виходячи з даних, представлених в Табл. 1, рекультивування при 24 °С дозволяє зберегти високий рівень базальної секреції кортизолу клітинами кріоконсервованих фрагментів надниркових залоз новонароджених поросят (137,67±7,53 4 нмоль/г білку), що у 2,92 рази вище, ніж у випадку рекультивування за умов прототипу (37 °С). Зразки, підготовані згідно з заявленим способом, здатні також до стимульованої секреції в присутності стимулятора стероїдогенезу дбцАМФ. Так, рівень стимульованої секреції дорівнює 310,42±10,12 нмоль/г білку, що у 2,25 рази вище в порівнянні з базальною секрецією, та складає 121,49 % по відношенню до відповідного показника за прототипом, прийнятого за 100 %. Приклад 2 Ефективність заявленого способу оцінювали при ксенотрансплантації фрагментів надниркових залоз новонароджених поросят тваринам з наднирковою недостатністю. Трансплантацію кріоконсервованих і рекультивованих фрагментів надниркових залоз, підготованих згідно з Прикладом 1, в дозі 35 мг здійснювали під капсулу нирки адреналектомованих мишей під комбінованим наркозом (кетамін - 2,5 мг, ксилазін - 0,5 мг/100 г маси тіла тварин). Через 30 діб після трансплантації тварин виводили з експерименту та оцінювали рівень кортизолу в плазмі крові за допомогою радіоімунологічного аналізу з використанням стандартних тест-наборів СТЕ125 РОН-К- І-М (Білорусія). В надниркових залозах мишей основним глюкокортикоїдом є кортикостерон у зв'язку з неактивністю ферменту CYP21в, що відповідає за синтез кортизолу. Однак незначна кількість кортизолу (10 нмоль/л) присутня в плазмі крові мишей, тому про ефективну продукцію кортизолу клітинами трансплантату свідчило підвищення рівня даного показника вище 10 нмоль/л. На 30 добу після трансплантації спостерігалось підвищення рівня кортизолу в плазмі крові тварин-реципієнтів (316,43 % в порівнянні з рівнем даного показника для адреналектомованих тварин, прийнятого за 100 %), який складав 32,94±2,31 нмоль/л, що у 2,8 рази вище в порівнянні з даними, отриманими за умов прототипу. Таблиця 1 Вміст кортизолу (нмоль/г білку) у середовищі інкубації кріоконсервованих фрагментів надниркових залоз новонароджених поросят після рекультивування за різних температурних режимів Температура рекультивування 24°С 37°С (за прототипом) Нативні фрагменти 242,8±2,29 186,95±12,51 Кріоконсервовані та рекультивовані фрагменти Базальна секреція Стимульована секреція 137,67±7,53 * 310,42±10,12# 47,07±2,31 * 255,5±12,03# * - відмінності вірогідні в порівнянні з відповідними нативними фрагментами (р