Спосіб підготовки кріоконсервованої органотипової культури надниркової залози для трансплантації

Спосіб підготовки кріоконсервованої органотипової культури надниркової залози для трансплантації, що включає розморожування культури та видалення кріопротектора, який відрізняється тим, що після видалення кріопротектора проводять рекультивування органотипової культури в стандартних умовах протягом 48 годин. Корисна модель належить до кріобіології і кріомедицини і може бути використана в трансплантології. Найбільш близьким до заявленого способу за своєю суттю та ефектом, що досягається, є спосіб підготовки кріоконсервованої культури клітин надниркової залози для трансплантації, який включає розморожування на водяній бані при 42°С та видалення кріопротектору шляхом 3-х разового відмивання від кріопротектору стерильним фізіологічним розчином [1]. Недоліком цього способу є те, що він не забезпечує високого рівня гормональної активності клітин трансплантата та їх життєздатності [2]. Це зумовлено тим, що він не дозволяє відновити функціональну активність та життєздатність клітин надниркової залози, що були знижені у зв'язку з пригніченням метаболічної активності при низькотемпературному зберіганні. Крім того, це зниження може бути пов'язано з неспроможністю мембран клітин до репарації пошкоджень, що спричиняються змінами клітинного об'єму при видаленні кріопротектору. В основу корисної моделі поставлено задачу створити такий спосіб підготовки кріоконсервованої органотипової культури надниркової залози для трансплантації, в якому введення додаткового етапу підготовки органотипової культури забезпечить підвищення гормональної активності та життєздатності її клітин. Ця задача вирішується тим, що в способі підготовки кріоконсервованої органотипової культури надниркової залози для трансплантації, який включає розморожування культури та видалення кріопротектору, згідно з корисною моделлю, після видалення кріопротектору проводять рекультивування органотипової культури в стандартних умовах протягом 48 годин. Рекультивування дозволяє позбутися пролітичних клітин, які з'являються після кріоконсервування (заморожування - відігріву та видалення кріопротектору) та несуть в собі приховані мембранні дефекти, що призводять до їх лізису. Існування такої популяції клітин в органотипової культурі призводить до його забруднення клітинними залишками, лізосомальними протеолітичними ферментами, що може впливати на функціональну активність органотипової культури при трансплантації. Крім того рекультивування дає змогу розмороженим клітинам відновитися після впливу осмотичних та температурних факторів при заморожуванні - відігріві, що позитивно впливає на їх гормонопродукуючу здібність. Рекультивування мас бути не менш ніж 48 годин, тому що в перші 24 години відбувається лізис пошкоджених при кріоконсервування клітин, які елімінуються з культури при заміні живильного середовища, а в наступну добу спостерігається активація не тільки базальної, але й стимульованої секреції гормонів клітинами органотипової ю 00 О) 4845 культури, що є найбільш важливим при використанні її для трансплантації. Введення в спосіб процесу рекультивування дозволяє підвищити гормональну активність та життєздатність клітин органотипової культури надниркової залози на 155% та 15 , відповідно. Приклади здійснення способу. Приклад 1. Органотипову культуру надниркових залоз, кріоконсервовану з 5% ДМСО, розморожували на водяній бані при 42°С і видаляли ДМСО шляхом 3-х разового відмивання Юмл живильного середовища. Після цього культуру приміщували в 2мл живільного середовища, що містило 10% ембріональної телячої сироватки, 100Од/мл пеніциліну та 75мкг/мл канаміцину. Рекультивували при 37°С в атмосфері з 5% СОг на протязі 48 годин в стерильних умовах. Після першої доби здійснювали заміну живильного середовища шляхом відбирання 2мл живильного середовища та додавання 2мл свіжого живильного середовища. Життєздатність клітин органотипової культури після 48 годин рекультивування визначали методом суправітального забарвлення з трипановим синім. Гормональну активність визначали за вмістом кортизолу в живильному середовищі флуоресцентним методом [3] та виражали в мкг% на 1мг білку, який вимірювали за методом Бредфорда [4]. Результати подані в табл. 1 і 2. клітин органотипової культури надниркових залоз до 95%. З даних табл.2 випливає, що рівень секреції кортизолу на 48 годину рекультивування перевищує не тільки гормонсекретуючу активність культури, яка була одержана за прототипом, а, навіть, і нативній. Приклад 2. Спосіб здійснювали аналогічно прикладу 1. Після 24 та 48 годин рекультивування органотипова культура була приміщена в свіжий живильний розчин, що містить стимулятор стероідогенезу АКТГ, та інкубована на протязі 60хв. при 37°С для визначення АКТГ-стимульованної секреції кортизолу. Вміст кортизолу визначали флуоресцентним методом та нормували на 1мг білку. Результати подані в табл. 3. З даних табл.З випливає, що розморожена органотипова культура більш здатна відповідати на стимуляцію АКТГ тільки на другу добу рекультивування, причому рівень стимульованої секреції є вищім в порівнянні з АКТГ-стимульованою нативною культурою. Таким чином, з наведених даних виходить, що заявлений спосіб підготовки кріоконсервованої органотипової культури надниркової залози забезпечує одержання трансплантаційного матеріалу з більш високим рівнем функціональної активності та життєздатності. Як видно з даних табл. 1, запропонований спосіб забезпечує підвищення життєздатності Таблиця 1 Життєздатність клітин кріоконсервованої органотипової культури надниркових залоз до та після рекультивування (п=10) Умови експерименту Після розморожування кріопротектору та видалення кріопротектору Після розморожування, видалення кріопротектору та рекультивування Життєздатність, % від контролю 80+3 95+4 Таблиця 2 Рівень кортизолу в живильному середовищі на протязі рекультивування кріоконсервованої органотипової культури надниркових залоз (п=10) Умови експерименту Контроль (нативна 5- добова культура) Після розморожування та видалення кріопротектору Після розморожування, видалення кріопротектору та рекультивування протягом 48 год Вміст кортизолу мкг%/мг білку % від контролю 0,236±0,016 100 0,185+0,012 78,3 0,551±0,015 233,4 4845 Таблиця З Рівень кортизолу в інкубаційному середовищі при АКТГ-стимульованому стерощогенезі органотипової культури надниркових залоз (п=10) Умови експерименту Вміст кортизолу Стимульована секреція Базальна секреція %від базальної % від власної Мкг%/мг білку Мкг%/мг білку секреції контробазальної секлю реції 5-добова культура (контроль) Після розморожування, видалення крюпротектору та рекультивування протягом 24 год 48 год 0,236±0,016 0,405±0,007 171,6 0,309±0,005 0,418+0,001 130,9 177,1 0,388+003 0,988+0,005 125,6 236,4 Джерела інформації 1 Легач Е И Бондаренко Т П Криоконсервирование адренокортикальной ткани и ее использование в клинике // Клінічна фармація -1999 , т З , № 2 -С112-115 2 Бондаренко Т П , Кандикова Н Г , Альбедалькарим Н М , Божок Г А , и др Сравнительное изучение жизнеспособности эндокринных тканей Комп ютерна верстка А Крижанівський новонарожденных поросят // Пробл криобиологии -2000 -№4 -С 59-61 3 Резников А Г методы определения гормонов Справочное пособие - К Наук думка -1980 -255-258 4 Практическая химия белка /Под ред Дарбе А Пер с англ - М Мир, 1989 , -С 297-298 Підписне Тираж 37 прим Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул Урицького 45 м Київ, МСП 03680, Україна ДП 'Український інститут промислової власності", вул Глазунова, 1, м Київ - 42, 01601