Спосіб одержання сухого екстракту із листя плюща звичайного (hedera helix l.) з комплексною муколітичною, антимікробною та протизапальною активністю

Спосіб одержання сухого екстракту із листя плюща звичайного (Hedera helix L.), що включає екстрагування сухого подрібненого листя плюща звичайного спиртом етиловим, який відрізняється тим, що проводять вичерпне 6-кратне екстрагування рослинної сировини 70 % спиртом етиловим при температурі 90-95 °С і ліофільне висушування екстракту, що виявляє комплексну муколітичну, антимікробну та протизапальну активність. (19) (21) u201103137 (22) 17.03.2011 (24) 10.10.2011 (46) 10.10.2011, Бюл.№ 19, 2011 р. (72) ЛУЦЕНКО ЮЛІЯ ОЛЕКСАНДРІВНА, ГАВРИЛЮК ОЛЕНА МИХАЙЛІВНА, НЄКТЄГАЄВ ІГОР ОЛЕКСІЙОВИЧ, ГАВРИЛЮК ІРИНА МИХАЙЛІВНА, ДАРМОГРАЙ РОМАН ЄВДОКИМОВИЧ (73) ЛУЦЕНКО ЮЛІЯ ОЛЕКСАНДРІВНА, ГАВРИЛЮК ОЛЕНА МИХАЙЛІВНА, НЄКТЄГАЄВ ІГОР 3 63489 хвилин 6 разів (1:10; двічі 1:5; 1:2,5; 1:5; 1:2,5). Таке співвідношення забезпечує раціональне використання екстрагенту і вичерпну екстракцію БАР із сировини, що підтверджують за допомогою хроматографії в тонкому шарі сорбенту. Об'єднані витяжки охолоджують, фільтрують, відганяють спирт етиловий на водяній бані з горизонтальним холодильником і проводять ліофільне висушування. Спосіб ілюструється наступними прикладами. Приклад здійснення способу. 50 г подрібненого сухого листя плюща звичайного заливали 500 мл 70 % спирту етилового і екстрагували впродовж 30 хв на водяній бані зі зворотним холодильником при температурі 90-95 °С, охолоджували, фільтрували. Екстракцію повторювали ще п'ять разів порціями 250, 250, 125, 250, 125 мл, після чого з об'єднаних фільтратів відганяли спирт етиловий на водяній бані з горизонтальним холодильником, охолоджені водні залишки переносили у скляні флакони ємністю 500 мл (по 200 мл) і ліофільно висушували. Вихід сухого екстракту становив 24,6±0,07 %, сумарний вміст тритерпенових глікозидів у перерахунку на гедеракозид С 8,51±0,06 %. Дослідження антимікробної (бактеріостатичної) активності екстракту проводили, використовуючи метод дифузії активної речовини в агар із застосуванням паперових дисків. Нанесення екстракту на диски здійснювали за методикою А. 4 Б. Черномирдика [2] в концентрації 0,5; 1,0 і 1,5 мг на диск. як досліджувані культури використовували рекомендовані ВООЗ та Державною Фармакопеєю України (Розділ 2.6. Біологічні випробування) музейні штами паличкоподібних (Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027, Esherichia coli ATCC 25922, Proteus vulgaris ATCC 4636) і кокоподібних форм бактерій (Staphylococcus aureus ATCC 25923, Staphylococcus epidermidis ATCC 12228), а також гриби Candida albicans ATCC 885653 [3]. Для дослідження як універсальне поживне середовище використовували 5 % кров'яний агар та добові бульйонні культури на основі 1 % цукрового бульйо9 ну в суспензії щільністю 1 х 10 мікробних тіл на 1 мл середовища; гриби культивували на агаризованому середовищі Сабуро. Посіви інкубували при температурі 37 °С протягом 24-72 год. у залежності від культуральних особливостей. Результати оцінювали за діаметром зон затримки росту мікроорганізмів в мм (середнє значення із п'яти паралельних дослідів). В результаті проведених досліджень (представлені у таблиці) було встановлено, що пропонований сухий екстракт із листя плюща звичайного виявляє бактеріостатичну активність і затримує ріст кокоподібних бактерій, Proteus vulgaris та грибів роду Candida вже в концентрації 0,5 мг/диск. Найнижча активність відзначена відносно Esherichia coli та Staphylococcus epidermidis. Таблиця Бактеріостатична активність сухого екстракту листя плюща звичайного Концентрація, мг/диск 0,5 1,0 1,5 Pseudomonas aeruginosa 0 22 ± 0,51 22 ± 0,92 Esherichia coli 0 9 ± 0,78 10 ± 0,55 Діаметр затримки росту, мм Proteus Staphylococcus vulgaris aureus 7 ± 0,63 10 ± 0,47 16 ± 0,76 12 ± 0,32 17 ± 0,62 14 ± 0,41 Протизапальну активність сухого екстракту плюща звичайного вивчали на моделі гострого ексудативного запалення, викликаного карагеніном. Гострий асептичний набряк стопи щурів викликали субплантарним введенням під апоневроз задньої кінцівки 0,1 мл 2 % розчину карагеніну [4]. Для дослідження використовували білих нелінійних щурів масою 220-280 г, яких утримували у стандартних умовах віварію. Тварин розділили на три групи по шість тварин у кожній: 1-ша контрольна група; 2-га - внутрішньошлунково протягом чотирьох днів отримувала досліджуваний екстракт в дозі 200 мг/кг; 3-тя - внутрішньошлунково протягом чотирьох днів отримувала препарат порівняння ортофен у середньоефективній дозі 8 мг/кг. На п'ятий день експерименту піддослідним тваринам усіх груп субплантарно вводили розчин карагеніну. Вираженість запального процесу оцінювали за збільшенням об'єму ураженої кінцівки, який вимірювали до та через 3 години після введення карагеніну (в момент максимального розвитку запальної реакції, коли рівень простагландинів у вогнищі Staphylococcus epidermidis 7 ± 0,64 9 ± 0,54 10 ± 0,37 Candida albicans 9 ± 0,61 15 ± 0,45 16 ± 0,53 запалення досягає пікового значення) за допомогою онкометра. Протизапальну (антиексудативну) активність визначали за здатністю зменшувати набряк у досліджуваних тварин у порівнянні з контрольною групою та вираховували її у відсотках. Активність досліджуваного екстракту розраховували за формулою: V ПА  (1  )  100% VK , де ПА - протизапальна активність, %; VД - середній приріст об'єму лапи у піддослідних тварин, %; VK - середній приріст об'єму лапи у тварин з контрольної групи, %. Сухий екстракт листя плюща звичайного характеризувався протизапальною активністю (20,61±2,11 %), однак за ефективністю поступався синтетичному препарату порівняння (53,76±4,33 %). 5 як патологічна модель для вивчення впливу сухого екстракту листя плюща звичайного на бронхіальне дерево та респіраторні відділи легень було використано експериментальний бронхіоліт. Дослідження проводили на статевозрілих білих лабораторних щурах масою 160-180 г, яких утримували у стандартних умовах віварію. Бронхіоліт викликали шляхом щоденного однократного інтраназального введення суспензії сефадексу G-50 у концентрації 50 мг/мл із розрахунку 2,0 мл/кг протягом чотирьох днів. При потраплянні в дихальні шляхи сефадекс викликає проліферацію епітелію бронхів, підвищення їх реактивності та розвиток інтерстиціального набряку. Вважається, що така модель пошкодження легенів шляхом інстиляції частинок сефадексу відповідає бронхіоліту у людей [5]. Піддослідні тварини розподіляли на три групи по шість особин в кожній: 1-ша -інтактні тварини, 2га - контрольна група (сефадекс), 3-тя - внутрішньошлунково отримували сухий екстракт листя плюща звичайного в дозі 200 мг/кг двічі на день і сефадекс за схемою. Фітосубстанцію вводили у вигляді водного розчину. Біологічний матеріал (легені з бронхами) забирали після декапітації тварин під ефірним наркозом на п'яту добу експерименту. Для гістологічного дослідження матеріал фіксували у 10 % забуференому формаліні та піддавали рутинній обробці. Вивчали щонайменше 10 різних ділянок тканини при забарвленні гематоксилінеозином. Для кількісної характеристики виявлені патогістологічні ознаки оцінювали за трьома ступенями вираженості: незначні, помірні та виражені зміни. Мікроскопічне дослідження тканини легень тварин контрольної групи дозволило виявити цілий комплекс змін, які можна трактувати як прояви дистрофії, гемодинамічних розладів та реакції перибронхіальної лімфоїдної тканини в порівнянні з інтактними тваринами. У тварин, які отримували сухий екстракт листя плюща звичайного, в досліджуваному матеріалі виявляли вакуолі в епітеліоцитах частини бронхів та бронхіол, які можуть бути проявом дистрофії або посиленої секреторної активності клітин (помірний ступінь вираженості). Стеноз просвіту бронхів був незначним. Гемодинамічні розлади спостерігали лише в окремих ділянках легеневої тканини. Перибронхіальні лімфоїдні проліферати були Комп’ютерна верстка Л. Купенко 63489 6 більш значними, ніж в інтактних тварин, але менш вираженими, ніж у контрольній групі. Одержані дані свідчать про те, що механізм дії екстракту на комплекс змін, що розвинулися під дією ксенобіотика (прояви дистрофії, гемодинамічних розладів та реакції перибронхіальної лімфоїдної тканини) стосувався активності клітин макрофагального ряду. Муколітичний ефект пояснюється поєднанням декількох механізмів: посиленням або порушенням секреторної активності епітелію бронхів і бронхіол, посиленням процесів ексудації з виходом рідини та еритроцитів з мікроциркуляторного русла, а також, опосередковано, через зниження рівня гіперпластичних реакцій лімфоїдної тканини. Таким чином, проведені дослідження свідчать, що представлений удосконалений спосіб одержання сухого екстракту з листя плюща звичайного дозволяє отримати екстракт з високим вмістом тритерпенових глікозидів як активно діючих речовин, який має комплексну муколітичну, антимікробну та протизапальну активність. Встановлені властивості отриманого сухого екстракту дозволяють пропонувати вищезгаданий спосіб для одержання ефективної фітосубстанції для лікування гострих і хронічних інфекційно-запальних захворювань бронхолегеневої системи з утрудненим відходженням мокротиння. Джерела інформації: 1. United States Patent 20060210660 Al, USA, A 61 К 36/25; A 61 К 31/704; Publication Date: 09/21/2006. 2. Черномирдик А. Б. Справочник по применению антибиотиков и других химиотерапевтических препаратов / А. Б. Черномирдик. - М., 1977. - С. 118-119. 3. Державна Фармакопея України / Державне підприємство "Науково-експертний фармакопейний центр" - 1-е вид. - Харків: РІРЕГ, 2001. - Доповнення 1. - 2004. -520 с. 4. Стефанов О. В. Доклінічні дослідження лікарських засобів. Методичні рекомендації / О. В. Стефанов. - К.: Авіцена, 2001. - 528 с. 5. Лискина И. В. Респираторный бронхиолит, ассоциированный с интерстициальной болезнью легких: современное определение и клиникоморфологические проявления / И. В. Лискина // Международный медицинский журнал. - 2010. - № 2. - С.15-19. Підписне Тираж 23 прим. Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601