Спосіб визначення рекомбіногенної активності компонентів агроландшафту

Спосіб визначення рекомбіногенної активності компонентів агроландшафту, що включає відбір 3 63490 них організмів використовують дріжджісахароміцети. Головним недоліком способів пов'язаних з використанням нижчих еукаріот, є складність екстраполяції отриманих результатів для людини, що пов'язано з відсутністю процесів метаболітичної активації та детоксикації, характерних для ссавців та людини. Низку переваг, порівняно з іншими тест-організмами має використання способів біотестування із застосуванням класичного генетичного об'єкту Drosophila melanogaster. Цей об'єкт характеризується такими вигідними для проведення досліджень показниками, як висока плодючість, короткий життєвий цикл, мала кількість хромосом; об'єкт досить добре досліджений. Крім того, аналіз рекомбіногенної активності на рівні цілого організму дає можливість врахувати той факт, що деякі речовини, які не проявляють рекомбіногенних властивостей, пройшовши додаткову активацію можуть стати рекомбінаційно активними. Адже ферментативні системи дрозофіли є подібними до мікросомальної фракції печінки ссавців [7]. Найближчим аналогом є визначення рекомбінаційної активності шляхом підрахунку соматичної рекомбінації (мозаїцизму) у дрозофіли [8]. Для розрахунку частоти соматичного кросинговеру в даному тесті використовують дві тестерні лінії дрозофіли: лінія 1- multiple wing hairs (mwh; фенотиповий прояв - клітини крила з двома-трьома ворсинками замість однієї); 3 лінія 2 -flare - (flr /In(3LR)TM3, Ser; фенотиповий прояв - деформація ворсинок, на кшталт опа3 лення полум'ям). Мутація flr в гомозиготоному стані летальна. Тому її підтримують в гетерозиготному стані з балансерною хромосомою ТМЗ (маркованою мутацією Ser - вирізка на крилі). Згідно цього способу незайманих самок лінії 1 у кількості 10 особин та 5 самців лінії 2 віком 3-5 діб поміщають у пробірку, яка містить стандартне поживне середовище. Через 72±4 години батьків пересаджують у пробірки зі свіжим поживним середовищем, а в колишні пробірки вносять розчини тестованих речовин. Аналіз особин першого покоРечовина/ концентрація Загальне число переглянутих особини Дикий тип Статистичну обробку результатів проводять з використанням критерію Фішера, порівнюючи частоту появи кросоверних особин в контрольному та дослідному варіантах [10]. Розрахунки проводять за формулою [10]: nn F  ( 1  2 )2 1 2 , n1  n2 де 1 та 2 - кути в радіанах для часток порівнюваних вибірок, n1 та n2 - об'єми вибірок розраховуються за формулою:  2 arcsin p , де 180 4 ління починають із 9-10 днів після початку експерименту, потім готують препарати крил. Аналіз препаратів крил проводять в світловому мікроскопі при збільшенні х400. Всі особини, які при цьому утворюються є гетерозиготними за обома мутаціями і тому характеризуються нормальними ворсинками крил. Але завдяки мітотичному кросинговеру на крилах дрозофіл формуються групи ворсинок з мутантною формою. Частота цих подій і є мірою мітотичного кросинговеру [8]. Значним недоліком цього способу є оцінка процесів рекомбінації в соматичних клітинах на рівні окремої особини, що не дозволяє апроксимувати отримані результати на генеративні клітини, а отже на організм та популяції організмів в цілому. В основу корисної моделі поставлено задачу визначати рекомбіногенну активність компонентів агроекосистеми шляхом встановлення частоти кросинговеру в генеративних клітинах в статевій хромосомі D. melanogasher на ділянці між генами white (w, 1-1,5) і cut (ct, 1-20). Рекомбіногенну активність ґрунту, природних вод, рослинницької продукції, що є компонентами конкретної агроекосистеми пропонуємо визначати способом, наведеним нижче. В даному тесті використовують дві тестерні лінії дрозофіли: лінія 1 - Canton-S (C-S), лабораторна лінія лінія 2 - w ct (w - white - біле забарвлення очей, ct- cut - обрізаний край крила; обидві мутації рецесивні). Згідно цього способу незайманих самок лінії 2 у кількості 3 особин разом з 2 самцями лінії 1 поміщають у пробірки (2-3 шт.), які містять поживне середовище, до складу якого введені зразки тестованих компонентів агроекосистеми. Нащадків першого покоління пересаджують на стандартне середовище. Частоту кросинговеру оцінюють, аналізуючи розподілення фенотипових проявів у нащадків у другому поколінні. Аналіз проводять під бінокулярним стереоскопічним мікроскопом у відбитому світлі [9]. Результати дослідження подаються в таблиці w ct W ct Частота кросинговеру р - це частоти появи кросоверів у контролі та досліді. Розрахований F-критерій порівнюють з критичним значенням при двох значеннях числа ступеню свободи: df1=1та df2=n1+n2-2 Якщо Fфакт. > Fтабл., то різниця вважається вірогідною, а тестована речовина - рекомбіногенною. Джерела інформації: 1. Morgan Т. Н.. Chromosomes and associative inheritance//Science.- 1911, 34.-N 880.-P. 636-638. 2. Colot V. and Rossignol J.L. Eukaryotic DNA methylation as an evolutionary device// BioEssays. 1999.V. 21: P. 402-411. 5 3. Єрмакова Н.Ю. Застосування експресних біологічних методів в еколого-гідрогеологічних дослідженнях // Автореф. дис. канд. геол. наук: 04.00.06.–К., 2000. –20 с. 4. Жученко А.А. Король А.Б. Рекомбинация в эволюции и селекции.-М:Наука.-1985.-400с. 5. Whittingill M. Some effects of gamma rays on recombination and crossing-over in Drosophila melanogaster II Genetics. - 1951. - Vol.36. - P. 332355. 6. Тоцький В.М., Гандірук Н.Г., Ланцман І.В. Життєздатність і частота кросинговеру на ділянці b-cn хромосоми 2 у Drosophila melanogaster, за вмісту солей тяжких металів у поживному середовищі // Вісник ОНУ. -2003. - Т. 8. - Вип. 1. - С. 75 80. Комп’ютерна верстка М. Мацело 63490 6 7. Селезнева Е.С., Белоусова З.П., Макарова Т.В. О генотоксичности модифицированных нуклеозидов // Известия Самарского научного центра Российской академии наук, 2000, т.2., №2, С. 344347. 8. Vogel E.W. Test for recombinagens in somatic cells of Drosophila // Mutat. Res.- 1992.-284.-P.159175. 9. Загальна і молекулярна генетика Практикум // Демидов СВ., Безруков В.Ф., Сиволоб А.В. та ін. - Київ: Фітосоціоцентр, 2005 - 240 с. 10. Атраментова Л.О., Утєвська О.М. Статистичні методи в біології - Харків: ХНУ імені Карамазіна, 2007, 208 с. Підписне Тираж 23 прим. Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601