Спосіб ультраструктурної діагностики незворотної гібернації міокарда при ішемічній хворобі серця

Спосіб ультраструктурної діагностики гібернації міокарда при ішемічній хворобі серця, який включає виявлення гранул глікогену в кардіоміоцитах, який відрізняється тим, що при виявленні кумуляції та агрегації гранул глікогену у формі розеток (альфа-глікоген) діагностують важку хронічну і незворотну гібернацію кардіоміоцитів, що є підставою для хірургічного втручання. (19) (21) u201103778 (22) 29.03.2011 (24) 10.10.2011 (46) 10.10.2011, Бюл.№ 19, 2011 р. (72) КИЯК ЮЛІАН ГРИГОРОВИЧ, БАРНЕТТ ОЛЬГА ЮЛІАНІВНА, БЕШ ДМИТРО ІГОРОВИЧ, КОВАЛИШИН ВАСИЛЬ ІВАНОВИЧ, КИЯК ГРИГОРІЙ ЮЛІАНОВИЧ (73) ЛЬВІВСЬКИЙ НАЦІОНАЛЬНИЙ МЕДИЧНИЙ УНІВЕРСИТЕТ ІМЕНІ ДАНИЛА ГАЛИЦЬКОГО 3 хоча присутні початкові ознаки гібернації КМЦ, що проявляються деструкцією саркомерів ( ). На Фіг. 3 - електронна мікрофотографія частини гібернованого КМЦ із стінки хронічної післяінфарктної аневризми лівого шлуночка пацієнта, де гранули глікогену (альфа-глікоген) переважно зібрані в розетки ( ) і займають більшу частину площі КМЦ. Крім глікогену, в КМЦ присутні залишки Мф і М, що свідчить про їх важку гібернацію, втрату ними органоспецифічності і здатності до скорочення. На Фіг.4 - електронна мікрофотографія частини гепатоцита білого щура, в цитоплазмі якого більшість гранул глікогену (альфа-глікоген) зібрані у типові для печінки розетки ( ). Спосіб ультраструктурної діагностики гібернації міокарда при ІХС здійснюють таким чином. Проводять забір міокарда при проведенні операції аорто-коронарного шунтування або вентрикулопластики лівого шлуночка (за Дором) за інформованою згодою пацієнта. Невеликий шматочок тка3 нини (об'єм близько 1 мм ) забирають для дослідження і промивають у какодилатному буфері від крові, а потім поміщають в 2 % розчин OsO4 на 1 годину для фіксації за методом М. Карновського [2]. Після цього тканину промивають в двох змінах какодилатного буфера. Наступним етапом є зневоднення досліджуваної тканини, що проводиться з використанням етанолу. Зафіксовану тканину послідовно поміщають в різні концентрації етанолу (70, 90, 100 %), а пізніше - у 100 % ацетон за методом В. Weakley [3]. Наступним етапом є просочування тканини смолами. Для цього зафіксований та зневоднений кусочок тканини поміщають в суміш аралдіту та епону на 12 годин при кімнатній температурі. Потім тканину міокарда переносять у свіжу суміш аралдіту та епону (Merk, Німеччина), розлиту в капсули, для полімеризації у термостаті протягом 24 годин, при температурі 60 °C. Подальшим етапом є отримання на ультратомі зрізів міокарда, товщиною 1 мкм. Зрізи поміщають на спеціальні металеві сітки і контрастують їх цитратом свинцю за методом Е. Reynolds [4]. Після цього тканина готова для дослідження в електронному мікроскопі. При вивченні тканини проводять фотографування різних ділянок міокарда при різних збільшеннях. В подальшому проводять вивчення фотографій і визначають життєздатність клітин міокарда та зворотність їх гібернації у залежності від наявності різного типу гранул глікогену. Результативність запропонованої корисної моделі підтверджена проведеними експериментальними дослідженнями (Фіг.1, Фіг.4). В експериментальній частині було взято 5 здорових білих щурів-самців масою 250 г кожен. Зразу після декапітації розтинали грудну і черевну порожнини і проводили забір тканини серця (Фіг.1) та печінки (Фіг.4), які обробляли і фіксували осмієм згідно з вищеописаною методикою. Зразу після забору тканину промивали в какодилатному буфері від крові, а потім поміщали в 2 % розчин OsO4 на 1 годину для фіксації за методом М. Карновського [2]. Після цього тканину промивали в двох змінах какодилатного буфера. Наступним етапом було 63576 4 зневоднення досліджуваної тканини з використанням етанолу. Зафіксовану тканину послідовно поміщали в різні концентрації етанолу (70, 90, 100%), а пізніше - у 100 % ацетон за методом В. Weakley [3]. Наступним етапом було просочування тканини смолами. Для цього зафіксований та зневоднений кусочок тканини поміщали в суміш аралдіту та епону на 12 годин при кімнатній температурі. Потім тканину міокарда переносили в свіжу суміш аралдіту та епону (Merk, Німеччина), розлиту в капсули, для полімеризації в термостаті протягом 24 годин, при температурі 60 С. Наступним етапом було отримання на ультратомі зрізів міокарда, товщиною 1 мкм. їх поміщали на спеціальні металеві сітки і контрастували цитратом свинцю за методом Е. Reynolds [4]. Після цього тканина була готова для дослідження в електронному мікроскопі. При вивченні тканини проводили фотографування різних ділянок міокарда при різних збільшеннях. В подальшому проводився аналіз мікрофотографій. Для виявлення помірного, а також незворотного ураження гібернованих КМЦ, проведено клінічні та ультраструктурні дослідження і співставлення результатів вивчення біопсій хронічної аневризми серця пацієнта Д. чоловічої статі віком 51 р. Діагноз: Ішемічна хвороба серця. Постінфарктний кардіосклероз. Аневризма передньо-верхівкового сегменту лівого шлуночка. Гіпертонічна хвороба, III стадія, II ступінь. Гіпертензивне серце. Серцева недостатність ПБ стадія, систолічна дисфункція лівого шлуночка (фракція викиду лівого шлуночка 34 %). При проведенні пластики аневризми лівого шлуночка проводили забір кусочків міокарда із стінки хронічної аневризми лівого шлуночка та обробляли його згідно з вищеописаною методикою. У помірно гібернованих КМЦ людини з колорубцевої зони окремі гранули бета-глікогену розташовані досить рівномірно між міофібрилами, навколо мітохондрій і під сарколемою, що свідчить про життєздатність КМЦ (Фіг. 2). На відміну від класичних бета-гранул глікогену, що містяться в КМЦ серця білих мишей (Фіг.1), а також в помірно гібернованих, але ультраструктурно збережених КМЦ серця людини (Фіг.2), - у стінці хронічної аневризми серця виявлено КМЦ, що втратили свою кардіоспецифічність (Фіг.3). Вони містять агреговані гранули глікогену (альфаглікоген) у формі розеток ( ) не властиві для міокарда, а характерні для клітин печінки [5]. Для порівняння виявлених змін в гібернованих КМЦ людини, що втратили органоспецифічність (Фіг.3), наводимо ультраструктурну будову клітин печінки щура (Фіг.4). Забір і фіксація тканини печінки щура були ідентичними з підготовкою до ультраструктурного дослідження біопсійного матеріалу із стінки хронічної аневризми людини. Класично, в гепатоцитах печінки (Фіг.4) глікоген (альфаглікоген) розташований у формі розеток ( ). При порівнянні виявленого альфа-глікогену у формі розеток в гібернованих КМЦ людини (Фіг.З) і альфа-глікогену в печінкових клітинах щура (Фіг.4), 5 - констатовано майже повну ультраструктурну подібність, що підтверджує втрату гібернованими КМЦ людини (із стінки хронічної аневризми серця) органоспецифічності і здатності до скорочення у випадку тривалої і незворотної гібернації. Виявлено ультраструктурні критерії, які дають можливість діагностувати важку і незворотну гібернацію КМЦ, що має значення для прогнозування перебігу хвороби і дозволяє вибрати оптимальний метод медикаментозного, інвазивного чи хірургічного лікування. Джерела інформації: 1. Cardiomyocyte remodelling during myocardial hibernation and atrial fibrillation: prelude to apoptosis / G.D. Dispersyn, J. Ausma, F. Thone [et al.] // Cardiovascular Research.-1999.- №43.- P. 947-957. Комп’ютерна верстка А. Крижанівський 63576 6 2. Karnovsky M.J. Use of ferrocyanide-reduced osmium tetraoxide in electron microscopy // th Proceeding of the 11 Annual Meeting of the American Society for Cell Bioljgy.-1971.-146a. 3. Weakley B.S.-A. beginners handbook in biological electron microscopy, -Edinburg; London, 1972.-324 p. 4. Reynolds E.S. The use of lead citrate at high pH as an elektronopaque stain in electron microscopy // Jour. Cell Biol.-1963. - V. 17. - P. 20-212. 5. Хэм А., Кормак Д. Поджелудочная железа, печень и желчный пузырь / Гистология в пяти томах. Том IV. Пер. с. англ. Москва.-1983. - С. 159202. Підписне Тираж 23 прим. Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601