Спосіб встановлення типовості ліній кукурудзи

Винахід належить біотехнології і може бути використаний при визначенні типовості інбредних ліній кукурудзи. Визначення типовості, тобто відповідності генетичних показників еталонному зразку і генетичної однорідності, інбредних ліній, є однією з обов'язкових процедур в селекції. Генетично однорідні лінії забезпечують отримання гібридного насіння F1 з високим (не менш 98%) рівнем гібридності. Найбільш близьким до запропонованого технічного рішення є метод визначення типовості за електрофоретичними спектрами зеїну (Асыка Ю.А., Попереля Ф.А. Контроль генетической чистоты семян кукурузы методом электрофоретического анализа зерна (рекомендации). Москва. 1990. 38с.). Зеїн виділяють з окремих зернівок, проводять електрофорез зеїну в поліакріламідному гелі та аналізують компонентний склад зеїну. Шляхом порівняння отриманих спектрів встановлюють гетерогенність чи однорідність тестуємних зразків. Даний винахід вибрано як прототип. До недоліків даного способу слід віднести низький рівень поліморфізму зеїну та наявність цих білків тільки в зерні. Даних про гомозіготність зеїнкодуючих локусів недостатньо для ствердження про гомозиготність інших локусів. З метою усунення вказаних недоліків пропонується спосіб, заснований на порівнянні електрофоретичних спектрів ДНК, отриманих в результаті ампліфікації локусів, що містять гіперваріабельні мікросателітні ділянки, за допомогою полімеразної ланцюгової реакції. В основу винаходу поставлено задачу в способі встановлення однорідності ліній кукурудзи шля хом типування ДНК, що дозволить підвищити надійність тестування однорідності партій насіння. Поставлена задача вирішується тим, що дослідження проводять методом ампліфікації ДНК тестуємих зразків насіння за допомогою метода полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР), електрофорезу ампліфікованих фрагментів ДНК в поліакріламідному гелі та порівняння генотипів зразків між собою. Відмінними від прототипу ознаками в винаході, що заявляється, є: - спосіб підготовки зразків до аналізу; - показник, по якому ідентифікують однорідні генотипи. Спосіб забезпечує високу точність та можливість оцінки великої кількості зразків, не потребує наявності коштовного обладнання. Спосіб здійснюється таким чином. 1. Виділення ДНК з 10 індивідуальних зразків лінії, що тестується (паростка, зерна, листя, коріння). 1смсегмент паростка (чи будь-якого органу рослини) чи зерно в 1,5мл-пробірці типу "епендорф" (далі епендорф) гомогенизувати скляним пестиком та залити 0,5мл лізуючого буфера (20,0mM Na3EDTA, 0,1 М Тріс-НСІ рН8.5 при 25°С, 1,4М NaCl, 2,0% СТАВ) до повної мацерації тканин. Лізат інкубувати 30хв. при 55°С. Додати рівний об'єм (0,6мл) суміші хлороформ-ізоаміловий спирт (24:1 за об'ємом), перемішати до утворення білої емульсії. Отриману суміш центрифугувати 5хв. при 14000об./хв на мікрофузі "Eppendorf 5415", водну фазу перенести в чистий епендорф. До водної фази додати 0,5 обсягу (0,3мл) ізопропілового спирту, перемішати і осадити ДНК центрифугуванням при 14000об./хв протягом 1хв. на мікрофузі "Eppendorf 5415". Надосадну рідину злити, осад промити двічі 0,5мл 70% етанола - центрифугувати при 14000об./хв протягом 1хв. на мікрофузі "Eppendorf 5415", надосадну рідину злити. Підсушити осад при кімнатній температурі 15-20хв і розчинити в 400мкл ТЕ-буферу (10,0mM Тріс-НСІ, 1,0mM ЕДТА). 2. Флюориметричне визначення концентрації ДНК. Концентрацію виділеної ДНК визначити на флюориметрі "ТКО 100 Dedicated mini Fluorometer" ("Hoefer Scientific Instruments", США) у TNE-буфері (3M NaCI 50mM Na2HP04) у присутності флюоресцентного барвника Hoechst 33258. 3. Проведення полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР). ПЛР проводити у 0,5мкл-епендорфах з використанням ампліфікатора "Терцик" ("ДНК-технологія", Росія). Реакційна суміш для проведення ПЛР об'ємом 20мкл містить: 50mM KCІ, 20mM Тріс-НСІ рН8.4 (25°С), 1,5mM MgCl2, 0.01% Твін-20, по 0.2mM кожного dATP, dCTP, dTTP, dGTP, no 0.25mkM прямого і зворотного праймерів, 20нг ДНК і 1од. ДНК-полімерази Taq. Поверх реакційного розчину нашаровувати 50мкл мінеральної олії. Температурний режим ампліфікації такий: 94°С 1хв.; 60°С 1хв.; 72°С 2хв., начальна денатурація - 5хв., фінальна елонгація - 10хв. Кількість циклів - 35. Аналізувати 10 мікросателітних локусів, розташованих на десятьох різних хромосомах. В таблиці наведено хромосомну локалізацію та послідовність фланкуючих праймерів даних SSR-локусів. Таблиця Деякі характеристики SSR-локусів Хромосома SSR-локус 1 phi056 2 phi090 3 phi047 4 phi072 5 phi008 6 phi129 7 phi049 8 phi060 A В A В A В A В A В A В A В A Послідовність праймерів (5'-3') acg ccc aga tct gtt cct tct с atg gcg gca ggc cga ttg tt cta cct atc caa gcg atg ggg a cgt gca aat aat tcc ccg tgg ga gga gat gct cgc act gtt ctc ctc cac cct ctt tga cat ggt atg acc gtg cat gat taa ttt ctc cag cct t gac agcgcg caa atg gat tga act cgg cta cgg agg cgg tg gat ggg ссc аса cat cag tc gtc gcc ata caa gca gaa gtc ca tcc agg atg ggt gtc tca taa aac tc gtt tgg cca tac cgt act gct tct tcc agt tct tcc gaa acg aaa ggg аса tgc aga agc ttg gca tca agg 9 phi042 10 phi041 В A В A В gct gag cga tca gtt cat cca g atg tgg cca tca ttc aat gct gta gac аса gat gca ggt gca gcc aga ttg gct ccc agc gee gca aa gat cca gag cga ttt gac ggc a 4. Електрофоретичний розподіл продуктів ампліфікації. Продукти ПЛР-ампліфікації (5мкл-аліквоту ПЛРсуміші) фракціонувати в 10% денатур уючому (8 М сечовина) поліакриламідному гелі в 1хТВЕ-буфері (89mM тріс, 89mM борна кислота, 2mM EDTA) при постійній напрузі 500В та температурі 60°С 1-2год. залежно від довжини фрагментів ампліфікації. Для приготування одного гелю розміром 16х18см товщиною 1мм необхідно змішати 12,5мл 8М сечовини, 12,5мл розчину 30% поліакриламіду з 8М сечовиною, 2,5мл 10хТВЕ-буфер у, 25мкл ТМЕД, 50мкл 10% ПСА. Гель залити у форми, як описано в керівництві користувача устатк ування. Перед нанесенням продуктів ампліфікації провести префорез на протязі 30хв. при постійній напрузі 300В і температурі 60°С. Для контролю за просуванням фрагментів ДНК в гелі зразок змішати з 1мкл денатуруючого буфера для нанесення (98% формамід, 10mM ЕДТА рН8,0, 0,2% (w/v) бромфеноловий синій, 0,2% (w/v) ксиленціанол) та денатурирувати протягом 3хв. при 95оС, після чого швидко охолодити на льодяній бані та за допомогою гамильтонівського шприця нанести в лунку гелю. Електрофорез припинити згідно з довжиною пробігу ксиленціанолу, який відповідає розміру фрагментів ампліфікації. Дві крайні доріжки гелю повинні містити зразок ДНК з відомою молекулярною вагою. Як стандарт молекулярної маси використовува ти ДНК фага лямбда, рестриктовану EcoRI, ДНК pUC19, рестриктовану Mspl, чи ДНК pUC18, рестриктовану Taql. 5. Візуалізація продуктів ампліфікації. Поліакриламідний гель фарбувати відповідно методики: гель покласти на 5хв. у 10% етанол, перенести у 1% НNО3 на 3хв. Гель промити кілька разів дистильованою водою. Витримати 20хв. у 0,012М AgNO3 у темряві, промити кілька разів дистильованою водою. Інкубувати гель у відновлюючому розчині (0,28М Na2CO3 (безводний), 0,019% формалін), змінюючи розчин у кожному разі його потемніння, до появи забарвлення фрагментів ампліфікації. Промити кілька разів бідистильованою водою, покласти в 10% оцтову кислоту на 2хв. На завершення промити 2хв. бідистильованою водою. Гелі зберігати між двома листами прозорої поліетиленової плівки. Приклади конкретного використання запропонованого способу. Приклад 1 Здійснювали оцінку типовості чотирьох сестринських інбредних ліній Од24. ДНК виділяли з 10 індивідуальних 7-добових етиольованих паростків кожного представника лінії. Проводили ПЛР-аналіз чотирьох мікросателітних локусів: phi056, phi090, phi047, phi072. Дані порівняльного аналізу електрофоретичних спектрів ДНК наведено у таблиці. Таблиця Порівняння електрофоретичних профілів ДНК (10-ДНК-профілі всіх зразків однакові; n/m - співвідношення числа зразків з різними ДНК-профілями; верхній індекс 1 - гомозигота; верхній індекс 2 - гетерозигота) Лінія та номер зразка Од24 1-1-4 №46 Од24 8-5 №47 Од24 2 №48 Од24 зм №49 SSR-локус phi056 101 1 1 2 2 /1 /6 101 101 phi090 81/22 101 101 61/41 phi047 101 101 91/12 101 phi072 101 91/11 101 101 Проаналізована лінія Од24 є гетерогенною в межах кожного зразка та між зразками. Приклад 2 Здійснювали оцінку типовості інбредної лінії Од141. ДНК виділяли з 20 індивідуальних зерен. Проводили ПЛР-аналіз десятьох мікросателітних локусів. Дані порівняльного аналізу електрофоретичних спектрів ДНК наведено у таблиці. Таблиця Порівняння електрофоретичних профілів ДНК (11 - гомозигота за даним локусом) № зразка phi056 Од141 1 11 2 11 3 11 4 11 5 11 6 11 7 11 8 11 9 11 Лінія phi090 11 11 11 11 11 11 11 11 11 phi047 11 11 11 11 11 11 11 11 11 phi072 11 11 11 11 11 11 11 11 11 Локус phi008 phi129 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 phi049 11 11 11 11 11 11 11 11 11 phi060 11 11 11 11 11 11 11 11 11 phi042 11 11 11 11 11 11 11 11 11 phi041 11 11 11 11 11 11 11 11 11 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 Аналізована лінія є гомогенною за 10 мікросателітними локусами, що дозволяє зробити висновок про генетичну чистоту лінії Од141.