Спосіб встановлення типовості та рівня гібридності генотипів соняшника

Винахід належить до біотехнології, а саме до використання ДНК-маркерів в селекції та насінництві соняшника. Генетично однорідні інбредні лінії є підставою для отримання насіння F1 з високим рівнем гібридності, що забезпечує прояв ефекту гетерозису та значну врожайність соняшника. Тому необхідні надійні методи контролю генетичної типовості ліній та рівня гібридності. Основним способом оцінки цих показників є грунт-контроль, що вимагає значних посівних площ і часу та в значній мірі є суб'єктивним аналізом. Найбільш близьким до винаходу, що заявляється, є спосіб встановлення типовості та гібридності за допомогою електрофорезу запасного білку - геліантину (Попереля Ф.А., Нецветаев В.П., Асыка Ю.А., Либенко Н.А., Блажиевская Л.А. Способ определения типичности родительских линий и гибридности семян F1 подсолнечника // А.с. №1800670 от 9.10.1992 (Заявка №4904588 от 23.10.1991). У відповідності з даним способом з окремих насінин лінії соняшника виділяють геліантини та проводять електрофорез у ПАА гелях. Після фіксації та фарбування аналізують білкові спектри на електрофореграмах. Про типовість ліній говорять виходячи з відсотка насінин, що мають ідентичні спектри. Рівень гібридності визначається відсотком насінин, у спектрах яких поєднуються компоненти спектрів материнської та батьківської ліній. Даний спосіб вибрано як прототип. До недоліків даного способу треба віднести слідуючи: серед комерційних гібридів соняшника поліморфним є лише один з шести локусів, кодуючи х геліантини, та більша частина ліній не відрізняються одна від іншої. З метою усунення вказаних недоліків, пропонується спосіб встановлення типовості та рівня гібридності комерційних генотипів соняшника, оснований на ДНК-типуванні ліній та гібридів за окремими мікросателітними локусами геному соняшника. В основу винаходу поставлено задачу оцінки типовості та гібридності партій насіння шляхом порівняльного аналізу спектрів ампліфікації мікросателітних локусів геному, що дозволить підвищити точність встановлення типовості та гібридності та скоротити термін проведення оцінки. Поставлена задача вирішується в способі оцінки генотипів соняшника на типовість та гібридність, який включає встановлення відсотка типових для певної лінії чи гібриду рослин, тим, що з 3 денних паростків 100 насінин виділяють ДНК, проводять за допомогою полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР) ампліфікацію певних мікросателітних локусів (чотирьох - для встановлення типовості лінії, одного - для встановлення гібридності), розділяють продукти реакції в 10% ПАА гелі та ідентифікують типові чи гібридні рослини шляхом порівняння електрофоретичних спектрів і підрахунку кількості рослин з однаковим алельним складом. Відмінними від прототипу ознаками в винаході, що заявляється, є: - спосіб підготовки зразків до аналізу, - показник, по якому ідентифікують типові та гібридні рослини. Спосіб забезпечує високу точність та об'єктивність оцінки, дає можливість встановлювати гібридність навіть коли батьківські форми є генетично близькоспорідненими. Причинно-наслідковий зв'язок між сукупністю заявлених ознак та досягнутим результатом (підвищення точності та об'єктивності оцінки) можна пояснити так. Аналіз поліморфізму мікросателітних локусів генома дозволяє отримувати стабільні кодомінантні маркери. Рослини генетично однорідних гомозиготних ліній повинні мати однаковий електрофоретичний спектр за кожним локусом. Успадкування алелів певного локусу здійснюється за законами Менделя, тобто за кожним локусом гібрид F1 повинен отримати один алель від материнської лінії, другий - від батьківської. Таким чином, електрофоретичні спектри рослин F1 повинні бути ідентичними та поєднувати алелі вихідних форм. Спосіб здійснюється таким чином. 1. Виділення ДНК. Сегменти 3 денних паростків 100 окремих насінин досліджуваної партії насіння соняшника гомогенізувати в 1.5мл-пробірках в лізуючому буфері (20.0мМ Na3EDTA, 0.1М тріс-НСl рН 8.5 при 25°С, 1.4М NaCl, 2.0% СТАВ) до повної мацерації тканин. Лізат інкубувати 45 хв. при 60°С. Додати рівний об'єм суміші хлороформ-ізоаміловий спирт (24:1 за об'ємом), перемішати до утворення білої емульсії. Центрифугувати 5 хв. при 14000об./хв. на мікрофузі "Eppendorf 5415", водну фазу перенести в чисті пробірки та додати рівний об'єм ізопропілового спирту, перемішати, осадити ДИК центрифугуванням при 10000об./хв. протягом 4хв. на мікрофузі "Eppendorf 5415". Осадок промити двічі 0.5мл 70% етанолу, центрифугувати при 10000об./хв. протягом 4хв. на мікрофузі "Eppendorf 5415". Осадок ДНК підсушити при кімнатній температурі 15хв. та розчинити в 0.3мл ТЕбуферу (10.0мМ трис-НСl, 1.0мМ ЕДТА). 2. Проведення полімеразної ланцюгової реакції. ПЛР проводити на приладі "Терцик" ("ДНК-технологія", Росія). Вміст реакційної суміші для проведення ПЛР об'ємом 20мкл: 50мМ КСІ, 20мМ тріс-НСl (рН 8,4 при 25°С), 0,01% Tween-20, 2мМ MgCl2, 0,2мкМ праймеру, 200мкМ кожного dNTP, 20нг геномної ДНК, 1 од. Taq-полімерази. Ампліфікація: денатурація - 94°С - 2хв., далі - 40с.; відпал - 60°С - 30с. - 35 циклів; синтез - 72°С - 2хв.; елонгація 5хв. В таблиці наведено номенклатуру мікросателітних локусів та послідовності праймерів для ампліфікації ДНК за даними локусами. Таблиця Мікросателітні локуси соняшника та послідовності праймерів для їх аналізу Локус ORS 78 ORS 509 П 3 П 3 Послідовність прямого (П) та зворотного (3) праймерів (5'-3') GTTCGTCGAGTAC ATGTTCTGC TTTCCCTCTGGAAAGTTGTCA CAACGAAAAGAC AGAATCGAAA CCGGGAATTTTACAAGGTGA ORS 595 ORS 815 П 3 П 3 CTCACCTGCCTCCATCTCTC ATCCCGCAC ATACC AAGTGT GGAAAGC AGC AATGGTTC ATAA CACCAAGTGC AAACCCTAGAAA 3. Електрофоретичний розподіл продуктів ампліфікації. Оцінювати продукти ампліфікації (5мкл-аліквоту ПЛРсуміші) у 10 % денатуруючому поліакриламідному гелі. Склад гелю: 10% акриламід, 7М мочевина, 1 х ТВЕ-буфер (50мМ тріс-Н 3ВО3, 2мМ ЕДТА, рН 8.0). Умови електрофорезу: напруга 500V протягом 90хв. при 65°С. Для приготування одного гелю необхідно змішати 12.5мл 8М сечовини, 12.5мл розчину 30% поліакриламіду з 8М сечовиною, 2.5мл 10 х ТВЕ-буферу, 25мкл ТМЕД, 50мкл 10% ПСА. Для контролю за просуванням фрагментів ДНК в гелі зразок змішати з 1мкл денатуруючого буфера для нанесення (98% формамід, 10мМ ЕДТА рН 8.0, 0.2% (w/v) бромфеноловий синій, 0.2% (w/v) ксиленціанол) та денатурувати протягом 1.5хв. при 95°С, після чого швидко охолодити на льодяній бані та за допомогою шприца нанести в лунку гелю. Одна доріжка гелю повинна містити зразок ДНК з відомою молекулярною вагою. Як стандарт молекулярної маси використовувати ДНК pUC19, рестриктовану MspI. 4. Візуалізація продуктів ампліфікації. Поліакриламідний гель фарбувати відповідно до методики: гель покласти на 5хв. у 10% етанол, перенести у 1% HNO3 на 3 хв. Гель промити кілька разів дистильованою водою. Витримати 20хв. у 0.012М AgNO3 у темряві, промити кілька разів дистильованою водою. Інкубувати гель у відновлюючому розчині (0.28М Na2CO3 (безводний), 0.019% формалін), змінюючи розчин у кожному разі його потемніння, до появи забарвлення фрагментів ампліфікації. Промити кілька разів бідистильованою водою. Гелі зберігати між двома листами прозорої поліетиленової плівки. 5. Документування отриманню електрофореграм. Документувати отримані електрофореграми відеосистемою YDS ("Amersham Pharmacia Biotech"). Молекулярну вагу поліморфних фрагментів ДНК встановлювати за допомогою комп'ютерної програми "Image Master ID Elite" згідно стандарту молекулярної ваги. 6. Встановлення типовості та рівня гібридності. Порівнюючи ампліфікаційні спектри окремих насінин, встановити кількість типових для даної лінії, що в відсотковому виразі буде являти собою показник типовості. В разі встановлення рівня гібридності, порівняти ампліфікаційні спектри окремих насінин гібриду та його вихідних форм за тим локусом, що є поліморфним для батьківських ліній. Кількість зразків, ампліфікаційні спектри яких утримують алелі обох батьківських ліній, в відсотковому виразі буде являти собою показник гібридності. Приклади конкретного використання запропонованого способу. Приклад 1 Встановлення типовості насіння лінії Од1036 Для дослідження брали насіння лінії Од1036, виділяли ДНК зі 100 насінин, ампліфікували ДНК окремих насінин з праймерами до мікросателітних локусів ORS 78, ORS 509, ORS 595, ORS 815 та проводили електрофоретичний розподіл продуктів ампліфікації. Серед дослідженого насіння зустрічалися зразки з типовим та нетиповим спектром (фіг.1). Оцінка, згідно заявленому способу, 100 насінин дозволила встановити відсоток типових для даної лінії рослин: зі 100 такими були 95, тобто типовість даної партії насіння лінії Од1036 дорівнює 95%. Приклад 2 Встановлення рівня гібридності насіння гібриду Од123 Для дослідження брали насіння гібриду Од123, виділяли ДНК зі 100 насінин, ампліфікували ДНК окремих насінин з праймерами до мікросателітного локусу ORS 78 та проводили електрофоретичний розподіл продуктів ампліфікації. Серед дослідженого насіння зустрічалися зразки двох типів. У насіння першого типу в спектрах поєднувалися алель 162 п.н. (як у материнської лінії) та алель 156 п.н. (як у батьківської лінії) (фіг.2: доріжки 3, 4, 6, 7), що свідчить про їх гібридну природу. У спектрах насіння другого типу були присутні лише алелі 162 п.н. (фіг.2: доріжки 2, 5), що виключає можливість їх походження від лінії Од4В. Оцінка, згідно заявленому способу, 100 насінин дозволила встановити відсоток гібридних рослин: зі 100 такими були 72, тобто рівень гібридності даної партії насіння гібриду Од123 дорівнює 72%.