Спосіб визначення місцевого імунного захисту тканин пародонта

Спосіб визначення місцевого імунного захисту тканин пародонта, що належить до групи імуноло 3 Поставлена задача вирішується тим, що для більш точної оцінки імунного захисту проводиться визначення вмісту окремих субпопуляцій Тлімфоцитів безпосередньо в патологічному вогнищі місцево, у тканинах периапікальної ділянки зуба, шляхом визначення вмісту окремих субпопуляцій Т-лімфоцитів в суспензії клітин периапікальної ділянки зуба, методом оцінки стану місцевого імунітету при захворюваннях пародонта, що дає конкретне уявлення про рівень імунного захисту. Технічним результатом від застосування винаходу є те, що реалізація даного винаходу дозволяє одного боку підвищити ефективність та надійність визначення вмісту субпопуляцій Тлімфоцитів у гранулематозній та грануляційній тканині периапікальної ділянки тканин пародонта. Визначення кількісного вмісту субпопуляцій Тлімфоцитів є діагностично значущим показником імунологічної реактивності при захворюваннях пародонта і дає можливість призначення адекватного лікування та уникнення ускладнень, що ведуть до повної вторинної адентії. Винахід здійснюється наступним чином: 1 етап - методика забору тканин периапікальної області і підготовка до дослідження. Перед проведенням провідникової анестезії пацієнти прополіскували порожнину рота 0,12 % розчином хлоргесидина упродовж 1 хв. Стерильним скальпелем № 15 робили трапецієвидний розріз. Тупо, гостро відшаровували слизово-окістний клапоть. Основа розрізу була звернена до перехідної складки. Клапоть відшаровували распатором від альвеолярного краю до перехідної складки. За допомогою стерильних фрез і борів різного діаметру здійснювали обробку периапікальної області з використанням сольового розчину як охолодження. Забір периапікальної тканини здійснювалася за допомогою стерильної кюрети. При заборі периапікальної тканини із зубів, отриманих після екстракції, ця тканина відділялася від верхівки кореня за допомогою стерильного леза скальпеля. Зразки тканини поміщалися у флакони з поживним середовищем ДМЕМ (Дульбекко модифіковане поживне середовище Ігла), що містить антибіотики: гентаміцин (150 мкг/мл) і Амфотерицин Бі (10 мкг/мл), негайно ж транспортувалися в лабораторію, зберігали при +4 °С не більше 4-х годин. Шматочки тканини периапікальної ділянки подрібнювали механічно, переносили в чашку Петрі шляхом пропускання через шприц з голкою для внутрішньовенних ін'єкцій. Обробку клітин трипсином або ферментами не проводили унаслідок виключення дії ферментних експресій CD імунологічних рецепторів, оскільки відомо, що трипсин зменшує експресію Т-лімфоцитів CD - 2 CD - 3 рецепторів. Отриману клітинну суспензію фіксували через клітинний фільтр і підраховували кількість фіксованих клітин по забарвленню 0,1 % розчин трипсинового синього. Отриману клітинну суспензію доводили 9 до концентрації 2-3×10 клітин в одному мілілітрі і використовували в подальших дослідженнях. 2 етап - значення кількості субпопуляцій Тлімфоцитів у культурі тканин пародонта. У наших дослідженнях визначалися основні субпопуляції лімфоцитів, що відповідають за місцевий імунітет і 67448 4 беруть участь у реакціях противірусного захисту за допомогою набору моноклональних антитіл виробництва Інституту проблем онкології НАН України. Використовувалися в роботі наступні моноклональні антитіла анти CD - 3, 4, 8, що виявляють Тлімфоцити хелпери (CD - 4) і Т-лімфоцити цитотоксичні (CD - 8). Окрім цього в роботі досліджували антиген адгезії і колонізації CD - 11 β, який експресується переважно на макрофагах, а також CD - 95 антитіла проти рецептора апоптозу (Fas - рецептор), який відображує готовність активованих клітин до апоптозу або подальшого диференціювання. Визначення вказаних субпопуляцій лімфоцитів здійснювалось згідно з методичними рекомендаціями Б.В. Пінегіна та ін. і інструкції по застосуванню моноклональних антитіл. Метод визначення окремих субпопуляцій полягав в наступному. До 100 мкл суспензії клітин тканин періодонта додавали 10,0 мкл відповідного моноклонального антитіла і інкубували на протязі 40 хвилин, після цього клітинну суспензію відмивали 2 рази фізіологічним розчином і зважували в 100,0 мкл готового розчину до якого додавали 10,0 мкл вторинних антитіл мічених флюорисцентом на 40 хвилин. Після цього проводили 2-х кратне промивання фізіологічним розчином і клітинну суспензію фіксували 0,1 % розчином формаліну. Дослідження вмісту окремих субпопуляцій лімфоцитів проводили на проточному цитофлюориметрі FACS com фірми Bector Diskinson (США). Кількість окремих фракцій лімфоцитів визначали у відсотках до загальної кількості клітин в суспензії клітин, отриманих з тканин періодонта за програмою Wind MDI 2.8. Прикладом конкретного застосування заявленого способу є історія хвороби № 44. Пацієнт 54 роки звернувся на кафедру стоматології Інституту стоматології НМАПО ім. П.Л. Шупика до лікаря зі скаргами на наявність норицевого ходу у ділянці присінку порожнини рота 26 зуба. Наявність норицевого ходу відмічає протягом року. Раніше за допомогою не звертався. Дані обстеження. Слизова оболонка порожнини рота набрякла, гіперемійована, з синюшним відтінком. Рухомість зубів І-ІІ ступеня. При зондуванні в ділянці жувальної групи зубів верхньої та нижньої щелепи виявлені пародонтальні кишені глибиною 3-4 мм. Наявність значних зубних відкладень у пришийкових ділянках зубів верхньої та нижньої щелеп. Коронкова частина 26 зуба без видимих патологічних змін. Пульпа 26 зуба нежиттєздатна, горизонтальна перкусія позитивна, вертикальна безболісна. Клінічне обстеження тканин пародонта: тканина ясен навколо 26 зуба гіперемована, в ділянці дистального щічного кореня запалена, в ділянці проекції фуркації кореня спостерігається пародонтальна нориця, на дистальній поверхні дистального щічного кореня виявлена пародонтальна кишеня глибиною 10 мм, рецесія ясеневого краю - 5 мм, втрата клінічного прикріплення ясен складає 15 мм. Дані рентгенологічного обстеження. На ортопантомограмі верхньої та нижньої щелепи відмічається зменшення висоти кісткової тканини міжальвеолярних перетинок за рахунок резорбції на 1/3 довжини кореня у ділянці зубів верхньої щелепи та на 1/2 довжини кореня в ділянці коренів нижніх зубів. На приціль 5 67448 ній рентгенографії 26 зуба верхівка міжзубної кісткової перетинки розрихлена, малюнок губчатої кісткової тканини розмитий. В ділянці дистального щічного кореня спостерігається кісткова кишеня глибиною 10 мм, в ділянці медіального щічного та дистального кореня періодонтальна щілина нерівномірно розширена. Попередньо був поставлений діагноз: генералізований пародонтит І-ІІ ступінь тяжкості, хронічний перебіг. Хронічний гранулюючий періодонтит 26 зуба. Ендо-пародонтальне ураження 26 зуба. Дані лабораторних досліджень. У хворого виявлено наявність комбінованої вірусної інфекції в тканинах пародонту: вірус герпесу І типу - 1000,0 в 100 мкл клітинної суспензії, вірус Епштейн-Барра - 1000,0 в 100 мкл клітинної суспензії, цитомегаловірус - 1000,0 в 100 мкл клітинної суспензії Визначення вмісту імунокомпетентних клітин засвідчила зменшення рівня CD3+ та CD8+ лімфоцитів; так CD3+ лімфоцити 10,69 % при нормі 40-45 %, CD8+ лімфоцити складали 2,96 % при нормі 20-30 %. Це свідчить про суттєве пригнічення імунного захисту, що призвело до хронічного вірусного враження тканин пародонта. Для санації даного хворого крім безпосереднього ендодонтичного лікування вогнища ендопародонтального ураження була запропонована схема лікування дистрофічно-запального захворювання тканин пародонта, яке було діагностовано при клінічному огляді. Оскільки при вірусологічному дослідженні у пацієнта були виявлені віруси герпесу, цитомегаловірус та вірус Епштейн-Барр, то попередньо була проведена превентивна терапія противірусним препаратом антигомотоксичної дії для попередження маніфестних проявів вірусної інфекції в порожнині рота при подальших стоматологічних втручаннях. Для цього був використаний препарат «Енгістол» фірми Heel (регістраційне свідоцтво: № UA/ 2053 /01/01 от 01.11.04.). Препарат призначався за схемою: по 1 таб. під язик 3 р/д. протягом тижня. В гострих випадках - кожні 15 хв. протягом перших 2 годин. При поліпшенні стану перехід на звичайне дозування 6 (по 1 таб. під язик 3 р/д протягом тижня.). А також була проведена імунокорекція за допомогою препарату Ехінацея композитум С по 1 амп. (2-3 р/тиж. у вигляді питних ампул протягом 2-3 тижнів). Крім загального лікування проводилась місцева терапія: 1. Обробка СОПР розчином антисептиків (хлоргексидин 2 % або 0,5 % р-н етонію); 2. Усунення місцевих подразників (зняття зубних відкладень, ревізія пародонтальних кишень); 3. Антибактеріальна терапія пародонтальних кишень (аплікації р-нів хлоргексидину, 1 % водний розчин йодинолу, 1-2 % р-н димексиду для промивання пародонтальних кишень) в поєднанні місцевого застосування Лімфоміозота (10 сублінгвальних крапель розчинити в 5-15 мл води) у вигляді аплікацій . Запропонований нами спосіб має таки переваги: - можливість визначення стану місцевого імунітету безпосередньо у патологічному вогнищі, що суттєво відрізняється від визначення системного імунітету зміни якого можуть залежить від інших причин (діабет, ревматизм, атеросклероз, гепатит та ін.); - визначення рівня субпопуляцій Т-лімфоцитів у суспензії клітин свідчить про їх пряму участь в реакціях противірусного захисту та про наявність недостатньої активності (імунної недостатності); - можливість не лише визначення стану місцевого імунітету, а й визначити доцільності використання імунокорегуючої терапії. Література: 1. Бажанов Н.Н., Козлов В.А., Максимовский Ю.М., Робустова Т. Г, 1996. 2. Орехова Л.Ю. «Иммунологические механизмы в патогенезе воспалительных заболеваний пародонта». Автореферат дисс. докт. мед. наук., М, 1997 г., 34 с., с. 30; 3. Канканян А.П., Леонтьев В.К. «Болезни пародонта», Ереван, 1998 г., 360 с., с. 244. Комп’ютерна верстка Л. Купенко Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601