Гуанідинвмісні олігомери як бактерицидні речовини

Винахід відноситься до гуанідину, його солей, комплексів або продуктів приєднання, конкретно до гуанідинвмісних олігомерів загальної формули: H2 N - C - NH - CH 2 - CH - R - CH - CH 2 - NH - C - NH2 NH.HCl OH NH.HCl OH CH3 де R (CH2 - O O - CH2 - CH - CH2 - NH - C - NH)5 C CH3 OH NH.HCl (І) CH3 CH2 - O CH3 C O - CH2 - CH - CH2 OOCC6H4(CH2 - O)n - C6H4COOCH2 - CH - CH2 - O CH3 n = 50 OH OH CH3 m + n = 30 OH CH2 - O - [CH2 - CH - O]x CH2 (ІІ) CH3 O - CH 2 - CH - CH2OOCC6 H4 (CH2 - O)m - (CH 2 - CH-O)n - C6 H4 COOCH2 - CH - CH 2 - O C O - CH3 CH3 CH3 CH3 CH2 - O C O - CH3 C (ІІІ) CH3 OH CH3 CH3 CH - [OCH - CH 2]y - O - CH2 - CH - CH2 - NH - C - NH2 OH NH.HCl CH2 - O - [CH2 - CH - O]x CH2x + y + z = 10 CH3 (IV) які є бактерицидними речовинами та призначені для використання в мікробіологічній промисловості, а також для обробки води, як дезінфектанти та антисептики. В літературі відомі способи отримання бактерицидних речовин, які містять у своєму складі вторинні та третинні аміногрупи [1-4]. Відомою бактерицидною речовиною є алкоксиметилметиламонійметасульфат, комерційна назва алкамон ДС -[5] формули: + [CnH2n+1 OCH2N(CH3)(CH2 CH3 )2][CH3 SO4 ] n=10-18 Він широко використовується як дезінфікуюча речовина для обробки приміщень тваринницьких ферм, ветеринарного, промислового та медичного обладнання. Але після проведення досліджень він характеризується незначною бактерицидною активністю по відношенню до умовно-патогенних грам-позитивних та грам-негативних бактерій. Крім того він не виробляється в Україні. Задачею винаходу є створення гуанідинвмісних речовин, які забезпечують бактерицидну активність по відношенню до грампозитивних та грамнегативних бактерій. Поставлена задача виконується одержанням гуанідинвмісних олігомерів загальної формули: H2 N - C - NH - CH2 - CH - R - CH - CH2 - NH - C - NH2 NH.HCl OH NH.HCl OH CH3 де R (CH2 - O O - CH2 - CH - CH2 - NH - C - NH)5 C OH CH3 NH.HCl (І) CH 3 CH2 - O CH3 C O - CH2 - CH - CH2OOCC6H4(CH2 - O)n - C6H4COOCH2 - CH - CH2 - O CH 3 OH n = 50 CH 3 CH2 - O OH CH3 CH 3 m + n = 30 OH CH 2 - O - [CH 2 - CH - O]x CH2 O - CH 3 (ІІ) CH3 CH3 O - CH 2 - CH - CH2 OOCC6H 4(CH 2 - O)m - (CH 2 - CH-O)n - C 6H 4COOCH 2 - CH - CH2 - O C C OH C CH3 O - CH3 (ІІІ) CH 3 CH 3 CH - [OCH - CH 2]y - O - CH 2 - CH - CH 2 - NH - C - NH2 OH CH 2 - O - [CH 2 - CH - O]x CH2x + y + z = 10 NH.HCl CH (IV) Суть винаходу пояснюється наступними прикладами: Приклад 1. Отримання гуанідинвмісних олігомерів (І). В реактор загружають 18г епоксидної смоли Epicot-828 (м.м. 360) (0,05 моля) яку розчиняють у етанолі концентрація 80%, та поступово прикапують спиртовий розчин 3,6г гуанідину (0,06 моля) у 10,9г етанолу. Реакцію проводили 2-3 години при 50-60°С. Контроль за завершеністю реакції проводили титрометричним методом по вмісту епоксидних груп та методом ІЧ спектроскопії по зникненню смуг поглинання епоксидних груп 920см-1 та титруванням кінцевих аміногруп. Приклад 2. Отримання гуанідинвмісних олігомерів (ІІ). 3 Реакція проходить у три стадії. На першій стадії одержуємо карбоксильований олігоетер. До 15г (0,1М) олігооксиетиленгліколю м.м. 1500 додаємо 2,96г (0,2М) фталевого ангідриду та 0,2% каталізатору - триетиламіну (від сумарної маси компонентів). Реакцію проводили 3 години при 80°С. Контроль за завершеністю реакції проводили титрометричним методом по вмісту СООН-груп. На другій стадії до 17,96г карбоксилвмісного олігоетеру (0,1М) додавали 7,2г (0,2М) Epicote-828, та каталізатор - трифенілфосфін (0,2%) від сумарної маси компонентів. Реакцію проводили 3-4 години при 80-100°С. Контроль за завершеністю реакції проводили по вмісту кінцевих епоксидних груп. На третій стадії до 25,2г продукту одержаного на ІІ стадії (0,1М) додавали 10,8г (0,2М) гуанідину. Приклад 3. Синтез блочного олігоетеру (III). Аналогічно прикладу (2), але вихідним компонентом був проксанол м.м. 3100. Загрузки: 31г проксанолу (0,1М), 2,96 фталевого ангідриду (0,2М) гуанідину. Приклад 4. Синтез гуанідинвмісних олігомерів (IV). Реакція проводили між лапроксидом (м.м.560) та гуанідином при співвідношенні компонентів (1:3) аналогічно прикладу І. Загрузки: 7 г лапроксиду (0,01М) і 1,08г гуанідину (0,02М). Таблиця 1 Основні показники синтезованих гуанідинвмісних олігомерів № І ІІ III IV Вихідні компоненти олігоетер Поліоксиетиленгліколь Бісфенол-А оброблений фталевим ангідридом Проксанол оброблений Бісфенол-А фталевим ангідридом Лапроксид олігоепоксид Бісфенол-А Співвідношення компонентів 5:6 Вміст йонних MM, г/моль груп, % 7,98 2367 2:1:2 8,57 2205 2:1:2 4,39 4305 1 :3 26,60 1064 Для дослідження дезинфікуючої та бактерицидної активності синтезованих сполук по відношенню до грампозитивних та грамнегативних бактерій використовували штами бактерій Чеської (ССМ), Американської (АТСС) та Української колекції мікроорганізмів (УКМ) та деякі ізоляти, які на даний час підтримуються у навчально-методичній лабораторії мікробіологічного профілю кафедри біології НаУКМА, зокрема: Escherichia coli HB 101, Pseudomonas aeruginosa ССМ 1961, Staphylococcus aureis ССМ 209 (Тип-штам, типовий для виду). Усі бактерії культивували на м'ясо-пептитидному агарі (МЛА), для культивування кишкової палички застосовували середовище Ендо. Бактерицидну активність визначали суспензійним методом [6]. Оптимальний час дії вказаної сполуки за певних концентрацій визначали через 15 та 30 хвилин при висіву на чашки Петрі з середовищем МЛА чи Ендо за методом Yould [7]. Кількість бактерій, що вижили після такої обробки, визначали за числом колонієутворюючих одиниць (КУО/мл) через 24 години інкубації при температурі 37 °С за вказаним методом. Ефективність бактерицидної дії сполук визначали за кількістю клітин, що вижили, розраховуючи їх життєздатність за формулою: C=lgNt/Ntk, де Nt - кількість бактерій, що вижили після дезинфіктанту, Ntk - кількість бактерій у контролі за той самий проміжок часу. Ефективність препаратів оцінювали за шкалою, наведеною в таблиці 2. Таблиця 2 Шкала оцінки ефективності препаратів Значення С (lg Nt/Ntk), КУО/мл від-2,0 до-2,9 від -3,0 до -3,9 від -4,0 до -4,9 від -5,0 до -5,9 від -6,0 та більше Кількість клітин, що загинули, % 99,0 99,9 99,99 99,999 >99,999 Досліди проводили у 3-х повторах, отримані результати обробляли математично на персональному комп'ютері. Мінімальну пригнічувальну концентрацію сполук по відношенню до грамнегативних та грампозитивних бактерій визначали методом розведень в агаризованому середовищі в модифікації реплік [8]. Кінцеві концентрації сполук в МЛА відповідно становили: 200, 180, 140, 120, 100, 50, 25, 10 ppm. Мінімальною пригнічувальною концентрацією (МПК) вважали ту найменшу концентрацію сполук в середовищі, за якою був відсутній ріст мікроорганізмів на МЛА. Суспензії добових тест-культур готували у стерильному фізичному розчині (1.109кл/мл), в об'ємі 0,2 мл вносили у лунки реплікатора та висівали паралельно на три чашки Петрі відповідно до схеми експерименту. Результати обраховували через 24 та 48 годин культивування бактерій, при 32-37°С. Як контроль використовували середовище МЛА без додавання синтезованих сполук. Результати дослідження бактерицидної активності сполук по відношенню до грамнегативної бактерії Escherichia coli HB 101, так як ця культура є санітарно-показовою мікробіологічної якості води, наведені в таблиці 3. Таблиця 3 Бактерицидна активність синтезованих сполук по відношенню до грамнегативної бактерії Escherichia coli HB 101 Сполука І ІІ III IV алкамон ДС 10 ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ Кінцева концентрація сполук у середовищі (ррm): 25 50 100 120 140 180 ++++ ++++ +++ ++ + ++++ +++ ++ + ++++ ++++ ++++ +++ ++ + +++ ++ ++++ ++++ ++++ +++ +++ ++ 200 + Контроль ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ Примітка: в таблиці наведені зведені дані, після висіву культур на 3-х чашках Петрі; "-" - ріст мікроорганзмів відсутній; "+"- поодинокі колонії; "++++" - суцільний ріст; З таблиці видно, що у результаті порівняння бактерицидної активності отриманих сполук по відношенню до грамнегативної бактерії Escherichia coli HB 101 було встановлено, що максимальну бактерицидну дію виявляє сполука IV, вже при концентрації 100ppm не росла ця культура. Крім того всі отримані сполуки при порівнянні з відомою бактерицидною речовиною алкамон ДС характеризувалися більш високою бактерицидною активністю, тобто при концентрації 200ppm не росла жодна культура. Результати визначення мінімальної пригнічувальної концентрації синтезованих сполук по відношенню до грамнегативних та грампозитивних бактерій наведені в таблиці 4. Таблиця 4 Мінімальна пригнічуюча концентрація синтезованих сполук по відношенню до грамнегативних та грампозитивних бактерій Культура Pseudomonas aeruginosa CCM 1961 Staphylococcus aureis CCM 209 І 160 120 II 120 100 Концентрація сполук, ppm III IV 180 100 140 50 алкамон ДС 195 195 Порівняльний аналіз МПК отриманих сполук з відомою бактерицидною речовиною (алкамон ДС) показав, що всі сполуки характеризуються більш високою бактерицидною активністю ніж алкамон ДС по відношенню до грамнегативних та грампозитивних бактерій. Перевагою отриманих речовин є більш висока бактерицидна активність по відношенню до грамнегативних та грампозитивних бактерій ніж відомої бактерицидної речовини алкамон ДС. Джерела інформації: 1. Патент ГДР №215708, Спосіб одержання епоксидних амінних адуктів, 21.01.1981p. 2. Заявка ФРН №3736995, Синтетична смола, що містить азотні групи та її призначення, 11.05.89р. 3. N. Destais, D. Ades, J.Saue. Polym. Bull., 2000, 44, 401. 4. Macromolec. Mater. Eng., 2001, 286, №2, p.63-87. 5. Радченко О.С., Степура Л.Г,, Фуртат 1-М., Михальський Л.О., Крамарєв С.О., Перспективність застосування четвертинних амонійних сполук для санації слизових оболонок та дезинфекції ран// Інфекційні хвороби. - 2002. №1. - С59-63. 6. Степура Л.Г., Радченко О.С., Фуртат І.М., Михальський Л.О., Бактерицидні властивості катіонних та інших поверхнево-активних речовин//Агроекологічний журнал. - 2002. - №4. - С.60-63. 7. Yauld J.P. Quantity and anality in the diagnosis of ururory troot infection// Brit. J. Urol. -1965. - 37. №1. - P.7-12. 8. Василевская И. А., Сергейчук М.Г., Згонник В.В., Фуртат И.М., Михальский Л. А. Усовершенствование метода бактериологического контроля в производстве лизина // Мікробіол.журн. - 1996. - 58, №5. - С.66-76.