Штамм frichosporon kasнiwayama-продудент речовини, що має стимулюючу дію на репаративні процеси шкіри, і спосіб одержання речовини, що має стимулюючу дію на репаративні процеси шкіри

Изобретение относится к микробиологической промышленности, в частности к производству лекарственных препаратов. Цель изобретения - разработка способа получения вещества, используемого для стимуляции репаративных процессов кожи, а также выявление штамма - продуцента вещества, обладающего стимулирующим действием на репаративные процессы кожи. В качестве продуцента используют штамм Trichosporon kashiwayama FERM'-P482i который характеризуется определенными признаками. Способ получения упомянутого вещества заключается в выращивании штамма FERM-P 4821 в питательной среде, содержащей % (мас./об):0,3 глюкозы, 0,5 снятого молока и 0 5 05 дрожжевого экстракта, при рН 4,0-6,0 и 20-ЗОС в течение 20 ч, затем культуральную жидкость фильтруют и отделяют фильтрат. Полученный фильтрат при необходимости концентрируют и/или высушивают, С полученным прапаратом можно готовить лечебные мази, косметические препараты. 1 н.э.п. сЬ-лы. S 3 1327791 Изобретение откосится к микробиологии, в частности к микробиологическому производству лекарственных средств. Цель изобретения - разработка способа получения вещества, используемого дли стимуляции репаративных процессов кожи8 и выявление штамма-продуцента, способного вырабатывать ве- і о щество, обладающее стимулирующим дей-* ствием на репаративные процессы кожи. Штамм Trichosporon kashiwayama депонирован в коллекции культур НИИ ферментации, Япония, под номером FERM-P 4821 и характеризуется следующими признаками. Морфологические признаки. Форма и размер (жидкая среда на солодовом экстракте Ж О . После культивирования в течение 3 суток при 25 С наблюдаются клетки, имеющие прямоугольную или овальную форму и размер (3-4) х (2-20)мкм, после проведения культивирования в течение 5 сут и более форма клеток становится нерегулярной и , наконец, , клетки становятся мицелиоидными• Образование псевдомицелия (культура на предметном стекле, культуральная среда - агар с картофельным экстрактом). Клетки псевдогифальные или псевдомицелиальные, имеют характерные зигзагообразные артроспоры, но без конидий . 15 20 25 30 35 Аскоспоры. Дскоспор клетки не имеют, Баллистоспоры, Баллистоспор клет- 40 ки не имеют. Культуральные признаки. Колония на агаровой культуральной среде со штриховой разводкой ( а г а ровая культуральчая среда на солодо- 45 вом экстракте МЧ') , Тусклая, белая, волосовидная и гру~ бая поверхность, очень мягкая, без подъемов, но с реснитчатой периферической частью. 50 Пленка на жидкой культуральной среде (жидкая культуральная среда на солодовом экстракте M S ' ) . Белая, волосовидная, хлопьевидная и прочная пленка. 55 На 50% (мас/мас) глюкозном агаре рост отсутствует, на 60% (мас/мас) агаровой среде с дрожжевым экстрактом не р а с т е т . ФИЧИППОГИЧРГК-НР Ферментация углеводов. Ке ферментируют глюкозу, галактозу, сахарозу, патетозу, трегалозу, рафкнозу и инулин. Ассимиляция источников углерода. D-глюкоза*, D-галактоза+ї мальтоза-, расЬиноза-, сахароза-, лактоза-, гтактат натрия*., D-ксилоза*, эритрит-, П-маннит+, L-сорбоза*, инозитол-, трегалоза-, D-арабиноза-, Ь-арабиноза-, сукцинат натрия+, цитрат натрия*, ацетат натрия*, инулин-, растворимый крахмал-, этанол*, глицерин*, целлобиоза-, (+: используется, ~: не используется), Использование нитратов: не используются. Использование нитритов: не используются. Использование этиламина гидрохлорида: не используется. Разложение глюкозида (арбутин)-: разлагается. Образование аналогов крахмала:не образуется, Образование пигмента: не образуется. Образование сложных эфиров: образуются . Реакция с лакмусовым молоком: не коагулирует. Потребность в витаминах: не треУстойчивость к соли: критическая концентрация 6-8% ( м а е . / о б ) . Оптимальная температура 25 С. Оптимальное значение рН 5 , 0 . Разложение мочевины: не р а з л а г а ется. Росг"при 37°С: не р а с т е т . Образование кислоты из глюкозы: не образуется. Устойчивость к циклогексимиду: резистентен. Жиры и масла р а з л а г а е т . 1 Выделяет при культивировании на среде, состоящей из 0,3% ( м а е . / о б . ) глюкозы, 0,5% ( м а е . / о б . ) снятого молока и 0,05% (мае./об) дрожжевого экстракта, при рН 4 , 0 - 6 , 0 при 20-30 С в течение 20 ч биологически а к т и в ное вещество, и фильтрат, содержащий данное вещество, имеет следующие свойства. Бесклеточный очищенный фильтрат кадосадочной жидкости культурального продукта содержит небольшие к о 3 132779 личества аминокислот, сахаридов и липидов. При проведении количественного анализа фильтрата оказалось, что суммарный азот составляет 0,0050,015%, а суммарный фосфор - 0,004 Характер и состояние. Фильтрат представляет собой прозрачную жидкость цветом от бесцветного до слабо желтоватого и имеет слабый запах. Пробы на подтверждение. 20 мл фильтрата упаривают на водяной бане до уменьшения объема приблизительно до 50 мл. Затем к концентрату добавляют 1 мл раствора нингидриновой пробы. После нагревания смеси в течение 30 мин жидкость преобретает фиолетовую окраску. 5 мл азотной кислоты добавляют к концентрату полученному проведением Упариванием по известной методике, и смесь кипятят в течение 20 мин. После охлаждения смеси ее нейтрализуют 25 10%-ным раствором гидроокиси натрия. Затем к смеси добавляют 2 мл раствора аммоний-молибдатной пробы. Если смесь нагревают, жидкость приобретает желтоватую окраску. Если к жид- 30 кости добавляют 10%-ный раствор гидроокиси натрия, она становится бесцветной. К 5 мл фильтрата добавляют 10 мг индоЛа и 2 мл хлористоводородной кислоты, и смесь встряхивают достаточное время. Когда смесь затем нагревают в течение 10 мин, жидкость становится крас ной. Физические характеристики: 40 Удельный вес 1,000-.1,015 Коэффициент преломления (п_ ) 1,330-1,340 рН (25°С) 45 4,5-5,5 Остаток после испарения,% 0,5-2,0 Содержание воды (согласно методу • 60 сушки при атмосферном давлении)% 98,7 Белки (коэффициент 6,25) Следы Содержание липидов 55 (согласно методу экстракции в аппарате Сокслета),% 0,2 Содержание волокон,% 0 1 Содержание золы,Я О, Содержание сахара,! 1,0 Суммарное содержание сухого вещества5 % (в пересчете на воду) 1,3 Содержание азота в аминоформе, мг,% 10 Кислотность по титрованию, число мл 1 н щелочи, оттитрованных для нейтрализации 100 г образца 0,6 Содержание азота в форме летучих оснований, Содержание мышьяка (в виде A s 2 O 3 ) Содержание тяжелых металлов (в виде Pb) Суммарное содержание ртути Содержание кадмия Содержание кальция, мг.% Содержание фосфора, мг.% Содержание муравьиной кислоты Содержание уксусной кислоты Содержание бутировой кислоты Содержание молочной кислоты, % He выявлено (предел детектирования 0,1 ч/мин Не выявлено (предел детектирования 1 ч/мин) Не выявлено (предел детектирования 0,01 ч/мин) Не выявлено (предел детектирования 0,01 ч/мин) 9,8 Не выявлено (предел детектирования 0,1%) Не выявлено (предел детектирования 0,01%) . Не выявлено (предел детектирования 0,01%) 0,06 327791 содержание лимонной кислоты,% Число жилых клеток E.coli Staphylococcus aureus Число грибов Число дрожжей Содержание пропионовой кислоты Содержание сорбиновой кислоты . 0,02 Менее 30 клеток на 1 мл 7-// м л /-// м л Содержание фолиевой кислоты 10 Не выявлено (предел детектирования 15 0,02 г/кг) Не выявлено(предел детектиро- 20 в а ния 0,005 г/кг) Содержание ниацина Суммарное содержание каротина детектирова- . . ния 0,03%) Не выявле-но (предел детектирования 1 мкг.%) Не выявлено (предел ,' детектирования, 0,03 мг.%) Не выявлено (предел детектировав ния 0,02 мг.%) Значение рН . . . Аминокислотный состав аминокислоты в 100 г образца Бензойная кислота, (цистин: метод окисг/кг 0,42 • : ления надмуравьиной 25 Сложный эфир п-гидрокислотой, триптофан: ксибензойной кислоты анализ с помощью Не выявлемикроорганизмов) но (предел Аргинин менее 0,01 детектироваменее 0,01 Лизин ния зо менее 0,01 Гистидин 0,005 г/кг) Фенилаланин Менее 0,01 Содержание витамиТирозин Менее 0,01 на Bj Не выявлено Менее 0,01 Лейцин (предел Менее 0,01 Изолейцин детектирова35 Менее 0,01 Метионин ния Менее 0,01 Валин 0,01 мг.%) Менее 0,01 Алании Содержание витамиМенее 0,01 Глицин на В, мг.% 0,02 Менее 0,01 Пролин 40 Глутаминовая кислота Менее 0,01 Суммарное содержание Серии . " Менее 0,01 витамина С Не выявлеТреонин Менее 0,01 но (предел Аспарагиновая кисдетектировалота , Менее 0,01 ния 2 мг.%) 45 Триптофан " • . Менее 0,01 Содержание витамиЦистин ^ Менее 0,01 на В, не выявлено Бесклеточная стерильная надосадоч(предел деная жидкость может быть использована тектировав в качестве дерматологического лекарния 5 мкг.%) 50 ственногс» аппарата и без концентрироСодержание витамина В Не выявлено вания. Однако предпочтительно кон(предел децентрировать бесклеточную стерильную тектированадосадочную жидкость. Кроме того, ния 0,05 мкг.%) „ возможно применение концентрата с высокой степенью концентрирования, Содержание пантогепревышающей 25, или сухого продукновой кислоты, та. Подобный концентрат, имеющий > мг.% 0,09 высокую степень концентрации или Содержание холина Не выявлено 8 32779 дерматит, предположительно вызван сухой продукт, может использоваться причинами, не связанными с данным в качестве дерматологического лекарлечением. Доля пациенток, для котоственного препарата. Кроме того, рых наблюдается значительное или умедерматологический препарат может быть ренное улучшение, составляет 80%. Крополучен смешиванием подобного конме того, у 60% из 365 женщин, у котоцентрата, сильного концентрата или рых состояние существенно улучшисухого продукта с кремом, мазевой лось, пятна на коже исчечлк полнососновой или другим носителем. тью. Результаты испытания на токсичность с использованием куриного эмб- ЇО Проба на излечение трещин кожи и риона показывают, бесклеточный мелких морщинок. стерильный концентрат (степень концентрирования 4) токсичностью не обДля банной пробы отбирают 962 женладает. Результаты кожной аллергищин из числа поступивших в дерматолоческой пробы на теле человека и прогические госпитали (150 женщин в возбы на непрерывное раздражение кожи расте 25-30 лет, 218 Ж Р Н Щ И Н в возчеловека показывают, что концентрат расте 30-35 лет, 248 женщин в возрассовершенно нетоксичен для кожи челоте 35-40 лет, 172 женщины в возрасвека. Результаты пробы на раздражете 40-50 лет и 174 женщины в возрасние слизистой оболочки глаза кролика 20 те свыше 45 лет). После промывания показывают, что концентрат не являкожи лица поры кожи открываются озоется раздражителем совсем. Резульном и паром, на кожу лица плотно нататы антибиотической пробы показывакладывают марлю, пропитанную концентют, что концентрат не содержит анратом (степень концентрирования 2) тибиотических веществ. 25 бесклеточной надосадочной жидкости и марлю покрывают лентой из пленки Дерматологический препарат оказыSaran-Wrap. Облучение инфракрасными вает лечебный эффект в отношении лучами проводят в течение 15-20'мин кожных пятен, потрескавшейся кожи, для улучшения проникания концентраконтактных дерматитов и обожженой 30 та в кожу. Обнаружено, что после кожи. одной обработки потрескавшаяся кожа Проба на излечение кожных пятен. значительно улучшилась у 698 женщин Отбирают 621 женщин, имеющих кож(73%), сравнительно улучшалась у ные пятна на лице, за исключением женщин (16%), состояние не изпациентов имеющих заболевание менилось у 72 женщин (7%) печени или гинекологические наруше35 и состояние не ухудшилось ни у одния, а также беременных женщин, поной из женщин, остается 36 женщин ступивших в дерматологические гос(4%). Учитвая тот факт, что растреспитали для излечения кожных пятен. кивание кожи развивается в конечном После промывания лица кожные поры открывают воздействием озона и пара,ина40 счете в мелкие морщинки, можно считать, что концентрат, являющийся область нахождения пятен наносят эффективным с точки зрения лечения марлю, пропитанную концентратом (стерастрескивания кожи, оказывает пень концентрирования 2) бесклеточпрофилактический эффект, препятствуя ной надосадочной жидкости. Нанесен45 образованию мелких морщинок. ную марлю покрывают лентой пленки марки Saran-Wrap и производят облучеПроба на лечебный эффект в отноние инфракрасными лучами для улучшешении контактных дерматитов. ния проникновения концентрата в кожу. Выбрана женщина, 21 год, страдаюЭту обработку проводят раз в неделю щая сыпью и жжением на веках обои продолжают в течение 3 мес.Обна50 их глаз, возникающими на следующий ружено, что состояние сильно улучшидень после смены теней для век лось у 363 женщин (58,4%), состояние фирма А на гени для век фирмы Б, сравнительно улучшилось у 122 жендиагноз - контактный дерматит. Дерщин (19,8%), никакого улучшения у матологом на пораженные участки на133 женщин (21,4%), состояние ухуд55 несена марля, пропьтанная концентрашилось у одной женщины (0,01%) и том (степень концентрирования 2) бесконтактный дерматит возник у остальклеточной надосадочной жидкости. ных двух женщин (0,03%). Контактный Не использовалось никаких стероид 9 1327791 1.0 пых препаратов, противовоспалительшом перемешиваемом ферментационном ных и антигистаминовых веществ.Пациаэротенке. Затем культивацию провоентке представлено около 20 мл кондят при 28°С в течение 70 ч в услоцентрата, концентрат наносят на 30 мин виях аэрации и перемешивания. Посл е дважды в сутки, т . е . утром и вечером, 5 завершения ферментации культу,Спустя 48 ч после начала лечения ральную жидкость пропускают через прекратилось жжение, а спустя 96 ч фильтровальный аппарат модели после начала лечения сыпь по сущестИ 293-16 производства фирмы (НайР ву исчезла. Спустя 1 неделю сыпь не гай Секухин Коге К.К." (фильтровальнаблюдается совсем. 10 ная бумага GL-90 производства фирПроба на лечение ожогов. мы "Toe Роси", 0,5 мкм) и через фильтЖеншина 47 лет, имеющая ожог, ровальный агрегат модели МР-293-4 возникший в результате обваривания производства той же фирмы (мембрангорячей водой, на наружной иасти ный фильтр-ТИ-2 производства фирмы левого предплечья (ожог I I степе- 15 "Toe Роси", 0,45 мкм) для удаления ни) с высыпанием и припухлостью велитвердых частиц и клеток. Полученчиной с ладонь, а также мелкими пуный фильтрат концентрируют в соответзырьками, обратилась к дерматологу ствии с методом использования мембспустя 1 ч после обваривания. Порараны обратного осмоса в аппарате моженный участок немедленно охлаждают 20 дели производства фирмы "БаЙоинджи1 проточной водой, на пораженный учасниринг Ко .' так, чтобы объем уменьток наносят марлю, пропитанную коншился до 200 л . Полученный концентцентратом (степень концентрирования 2) рат стерилизуют с использованием тепбесклеточной стерильной надосадочлообменника тарельчатого типа ной жидкости и на нее накладывают п е р " (производства фирмы "Иван Кикай Коге гаментную бумагу. Затем на пораженК . К . " ) , стерильно упаковывают в ный участок накладывают повязку. . • ".. стеклянные емкости и хранят в хоСпустя 24 ч обнаружено, что мелкие лодильнике (5 С ) . пузырьки совершенно исчезли, хотя П р и м е р 2. Стерилизованный высыпание и припухлость остались и - 0 концентрат, полученный в примере 1, 3 пациентка прекратила жаловаться на сушат вымораживанием и полученный боль. порошок смешивают со стерильной мазеМужчину 30 лет, имеющего ожог в вой основой с получением мази для результате обваривания горячей водь! кожи. на задней части правой ноги (ожог Ц 35 П р и м е р З . Косметический степени) с высыпанием и припухлоепрепарат получают введением 1 г с т е тью размером с куриной яйцо, обрабарилизованного концентрата, получентывают концентратом (степень концентного в примере 1, в косметическую рирования 2) бесклеточной стерильоснову, состоящую из 1 г стеариной надосадочной жидкости по методи- 40 новой кислоты, 7 г пчелиного воска, ке, описанной выше. Спустя 24 ч при4 г самоэмульгируемого глицерина мопухлость исчезла, хотя высыпание осностеарата, 30 г жидкого парафина, талось, и пациент прекратил жаловать0,1 г водного ланолина и 40 г очищенся на боль. ной воды, и пластифицированием смеси „, _ 45 в соответствии с традиционными метоТаким образом, концентрат оказы^ w w „„„ „ _ диками. Композицию разливают и упавает сильно выраженный лечебный ... ковывают в ампулы, и упакованные амэффект в отношении ожогов. п у л ы П р и м е р о в перемешиваемый направляют на^продажу. ферментационный аэротенк емкостью „ П р и м е р 4. Лекарственный пре5 1000 л загружают 800 л культураль° п а р а т л е ч е н и я к о ж н ы х заболеваний ной среды, имеющей описанный выше получают введением подходящих колич состав, и после стерилизации нагрева/ с т в пиридоксина гйдрохлорида нием и естественного охлаждения ї-оризанола, аплатоина, D L - ^ - T O K O эту культуральную среду инокулируют ,, ф е р о л а (витамина Е) и мятного масла „ •э-э в композицию, полученную в примере 3. с ч затравкой, образованной осуществле* нием предварительной культивации Ф о р м у л а и з о б р е т е н и я при 28°С в течение 30 ч в 10 л 1 .Штамм Trichosporon kashiwayama той же культуральной среды в небольFERK-P 4821 (Коллекция культур 11 1327791 '2 Япония) - продуцент вещества, ідей глюкозу 0,3% ( н а с . / о б ; , снятое обладающего стимулирующим действием молоко 0,5% ( м а е , о б ) , дрожжевой на репаративные процессы кожи. экстракт Us05% ( м а с . о б ) , при рН 2„ Способ получения вещества, об4 , 0 - 6 , 0 и температуре 2О-ЗО°С, в а э ладающего стимулирующим действием на < робных условиях, затем отделяют биоj репаративные процессы кожи, эаклюмассу в стерильных условиях и получающийся в том, что штамм T r i c h o s p o ченный стерильный фильтрат при необron kashiwayama FSRM-P 4821 выращиходимости концентрируют и/или высушивают в питательной среде, содержавают. Редактор Н.Киштулинец Заказ 3398/58 Составитель Г.Смирнова Техред Л.Олийнык Корректор А.Тяскс Тираж 499 Подписное В И П Государственного комитета СССР Н ИИ по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж-35,Раушская н а б . , д . 4/5 Производственно-полиграфическое предприятие, г . Ужгород, ул. Проектная, 4