Спосіб діагностики ризику невиношування вагітності

Спосіб діагностики ризику невиношування вагітності шляхом дослідження біологічних рідин, який відрізняється тим, що як біологічну рідину використовують кров, визначають в ній концентрацію ендогенного N-ацетилглюкозаміну (загального, вільного та зв'язаного), при цьому ризик невиношування вагітності діагностують при наступних концентраціях ендогенного N-ацетилглюкозаміну: загального - нижче 3,40ммоль/л, вільного - нижче 1,10ммоль/л та зв'язаного - нижче 2,30ммоль/л. Винахід відноситься до акушерства, гінекології, клінічної біохімії, зокрема до діагностики ризику невиношування вагітності шляхом визначення концентрації біологічних речовин, а саме ендогенного N-ацетилглюкозаміну, в сироватці крові вагітних. Визначення ризику невиношування вагітності за допомогою інформативних біохімічних методів дослідження є актуальним завданням сучасною лабораторної діагностики. Відомий спосіб визначення хоріонічного гонадотропіну (ХГЛ) в сироватці та плазмі крові людини, який використовується для спостереження за перебігом вагітності з метою своєчасного виявлення патології розвитку плоду. Основним недоліком способу можна вважати той факт, що рівень хоріонічного гонадотропіну є тільки маркером ризику, який не вказує на причину невиношування вагітності. Зазначений спосіб є досить дорогими і може виконуватися лише із застосуванням спеціального обладнання спеціально підготовленим персоналом. Завданням виноходу є створення нового способу діагностики ризику невиношування вагітності, в якому шляхом визначення у крові вагітних концентрації ендогенного N-ацетилглюкозаміну з ви сокою вірогідністю діагностують зазначений ризик. Поставлене завдання вирішується таким чином, що у способі діагностики ризику невиношування вагітності шляхом дослідження біологічних рідин винаходом передбачено використання крові у якості біологічної рідини, в якій визначають концентрацію ендогенного N-ацетилглюкозаміну і в залежності від неї діагностують ризик невиношування вагітності. Згідно з винаходом ризик невиношування вагітності діагностують при концентрації ендогенного N-ацетилглюкозаміну: - загального - нижче 3,40ммоль/л; - вільного - нижче 1,10ммоль/л; - зв'язаного - нижче 2,30ммоль/л Визначення концентрації ендогенного Nацетилглюкозаміну (загального, вільного та зв'язаного) в сироватці крові вагітних здійснюють на основі реакції взаємодії гексозамінових сполук з пара-діметиламінобензальдегідом у спиртовому середовищі. В пробу з сироваткою крові додають 10% розчин трихлороцтової кислоти. Осад, який утворюється, після центрифугування відділяють від надосадової рідини. Таким чином розділяють зв'язаний з білками ендогенний N-ацетилглюкозамін (осад) та вільний ендогенний N-ацетилглюкозамін (надо (19) UA (11) 77195 (13) C2 (21) 2004021130 (22) 17.02.2004 (24) 15.11.2006 (46) 15.11.2006, Бюл. № 11, 2006 р. (72) Шевченко Олег Ігоревич, Черних Валентин Петрович, Зупанець Ігор Альбертович, Грищенко Ольга Валентинівна, Зайченко Ганна Володимирівна, Пропіснова Вікторія Володимирівна, Сторчак Ганна Вадимівна (73) НАЦІОНАЛЬНИЙ ФАРМАЦЕВТИЧНИЙ УНІВЕРСИТЕТ (56) UA C 76564 15.12.2000 3 77195 4 садова рідина). Осад розчиняють він. розчині гідВинахід ілюструється наступними прикладами: роксиду калію, переносять до ампул, додають 25% Приклад 1 розчин хлорводневої кислоти, ампули герметично Визначення концентрації зв'язаного та вільнозапаюють, і гідролізують на водній лазні. Під час го ендогенного N-ацетилглюкозаміну в крові прогідролізації осаду відбувається вивільнення ендоводили наступним чином. генного N-ацетилглюкозаміну із зв'язків з білками. В амбулаторних умовах було взято пробу веГідролізати і надосадову рідину нейтралізують нозної крові у здорової невагітної жінки-донора. 40% розчином гідроксиду калію до слабо-лужної 0,5мл сироватки крові поміщали у центрифужну реакції середовища (рН=7-8). Нейтралізовані супробірку, додавали 5мл 10% розчину трихлороцміші піддають нагріванню на водній лазні з 3% тової кислоти для осадження білків. Перемішували розчином ацетилацетону для роз'єднання пірольта центрифугували 10хв. при 3000об/хв. Надосаних циклів, додають етиловий спирт та реактив дову рідину відділяли в окрему хімічну пробірку. Ерліха (п-диметиламінобензальдегід у спиртоДо осаду додавали 0,6мл 1н. розчину їдкого калію хлорводневокислому середовищі) і вимірюють на та перемішували до повного розчинення осаду. спектрофотометрі інтенсивність рожевоРозчин переносили в ампули, додавали 5мл 25% малинового забарвлення. Паралельно проводять соляної кислоти, запаювали. Розчин піддавали контрольний дослід з дистильованою водою. гідролізу протягом 3 годин при 100°С (на киплячій Концентрацію ендогенного Nводній лазні). Після закінчення гідролізу ампули ацетилглюкозаміну визначають за калібрувальним розкривали, вміст переносили у хімічні пробірки. графіком: зв'язаного - в пробах з осадом, вільного Гідролізат та надосадову рідину нейтралізува- в пробах з на-досадовою рідиною. Концентрацію ли 40% розчином їдкого натру до слабо-лужної загального N-ацетилглюкозаміну - за сумою зв'яреакції середовища (рН=7-8). заною та вільної фракції. 2мл нейтралізованої суміші переносили у проПеревагою запропонованого способу діагносбірку з притертою пробкою, додавали 1мл 3% розтики є його висока чутливість, доступність, дешечину ацетилацетону, щільно закривали пробкою і вина, зручність у виконанні, висока інформативнагрівали на киплячій водній бані протягом 20хв. ність. До охолодженої суміші додавали 3мл 99% Ендогенний N-ацетилглгокозамін є складовою етилового спирту та 1мл реактиву Ерліха і заличастиною сполучної тканини, міометрію, пупкового шали на 20-30хв. при кімнатній температурі до канатика, хрящу ембріона, стінки судин, мембран появи рожево-малинового забарвлення. слизової оболонки та швидко регенеруючих тканин Вимірювання оптичної густини проводили на [3, 4]. Сполучна тканина є невід'ємною складовою спектрофотометрі при λ=535нм в кюветах з товміометрію під час вагітності. В умовах вагітності щиною шару 1см, проти повітря. необхідність в ендогенному N-ацетилглюкозаміні Холоста проба: до 2мл дистильованної води різко підвищується у зв'язку з його високим спожидодавали 1мл 3% розчину ацетилацетону, нагріванням. Якщо організм жінки є здоровим, то провали на водній лазні, охолоджували, додавали цеси будови нової тканини та підвищеного викори3мл 99% етилового спирту та 1мл реактиву Ерстання N-ацетил-глюкозаміну врівноважуються ліха. процесами його синтезу. Розрахунок кількісного вмісту NВ умовах невиношування вагітності присутні ацетилглюкозаміну проводили за калібровочним явища порушення утворення високомолекулярних графіком після розрахунку: сполук за участю ендогенного NΕ=Е(проби)-Е(холоста) ацетилглюкозаміну, що призводять до послабленВміст N-ацетилглюкозаміну в сироватці крові ня стінки матки, до нездатності матки утримувати виражали у ммоль/л. плід і спонтанних абортів. Однією з причин цих Концентрація зв'язаного ендогенного Nпорушень є дефіцит ендогенного Nацетилглюкозаміну донора становила ацетилглюкозаміну. 3,66ммоль/л, вільного - 1,82ммоль/л, загального Недостатність ендогенного N5,48ммоль/л. ацетилглюкозаміну в організмі вагітної жінки, зниТаким чином, показана можливість визначення ження концентрації загального ендогенного Nконцентрації зв'язаного, вільного та загального ацетилглюкозаміну свідчить про нестачу цієї важендогенного N-ацетилглюкозаміну у здорових неливою складовою тканин в організмі взагалі та вагітних донорів, доказана відтворюваність цього можливість невиношування вагітності. методу, отримані дані відповідають значенням Порогові концентрації зв'язаного, вільного та норми, наданим в літературі [5,6]. загального ендогенного N-ацетилглюкозаміну виПриклад 2 значені шляхом статистичної обробки аналізів В умовах клініки було обстежено 40 вагітних з крові вагітних, виходячи з норми ендогенного Nдіагнозом "невиношування вагітності" та 40 вагітацетилглюкозаміну у здорових невагітних жінок. них з нормальним перебігом вагітності. АмбулатоАвторами вперше встановлено, що зниження рно було обстежено 20 донорів. Проведено досліконцентрації ендогенного N-ацетилглюкозаміну дження сироватки крові, визначено рівні має бути не нижче ніж 3,40ммоль/л для загальноендогенного зв'язаного, вільного та загального Nго, не нижче ніж 1,10ммоль/л для вільного, не ниацетилглюкозаміну. Дані досліджень представлено жче ніж 2,30ммоль/л для зв'язаного, в результаті в таблиці. чого одержані заявлені значення. 5 77195 6 Таблиця Концентрація ендогенного загального, вільного та зв'язаного N-ацетилглюкозаміну в сироватці крові у пацієнтів з нормальним перебігом вагітності та її невиношуванням Невагітні донори n=20 Вагітні з нормальним перебігом n=40 Вагітні з невиношуванням n=40 N-ацетилглюкозамін, загальний 5,300±0,663 4,528±0,685 р>0,05 2,791±0,492 р