Спосіб кріоконсервування органотипової культури сім’яників новонароджених поросят

Спосіб кріоконсервування органотипової культури сім'яників новонароджених поросят, що включає інкубацію у розчині кріопротектора диметилсульфоксиду і програмне заморожування з подальшим зануренням у рідкий азот, який відрізняється тим, що кріопротектор беруть у концентрації 10%, інкубацію проводять протягом 10 хв, а програмне заморожування здійснюють зі швидкістю 5°С/хв до температури -40°С. (19) (21) a200604455 (22) 20.04.2006 (24) 25.09.2007 (46) 25.09.2007, Бюл. № 15, 2007 р. (72) Божок Галина Анатоліївна, Лєгач Євген Іванович, Гуріна Тетяна Михайлівна, Губіна Ніна Федорівна, Бондаренко Тетяна Петрівна (73) ІНСТИТУТ ПРОБЛЕМ КРІОБІОЛОГІЇ І КРІОМЕДИЦИНИ НАЦІОНАЛЬНОЇ АКАДЕМІЇ НАУК УКРАЇНИ (56) UA A 40865, 15.08.2001. 3 80497 4 культури сім'яників новонароджених поросят, який тестостерон-ПР (Беларусь). Кількість гормону розби, за рахунок зміни концентрації кріопротектора, раховували на білок. Рівень базальної секреції тривалості інкубації та режиму охолодження, затестостерону в живильне середовище після інкубезпечив підвищення рівня секреції тестостерону. бації органотипової культури сім'яників протягом 1 Ця задача вирішується тим, що у способі кріогодини при 37°С становив 23,94±3,74нМоль/мг консервування органотипової культури сім'яників білку, що складало 94,02% від контролю (таблиновонароджених поросят, який включає інкубацію ця 1). у розчині кріопротектора ДМСО і програмне замоТак як ендокринні тканини характеризуються рожування з послідуючим зануренням у рідкий не тільки базальним, але й стимульованим гормоазот, згідно з винаходом, ДМСО беруть у концентнопоезом, то для того, щоб оцінити схоронність та рації 10%, інкубацію здійснюють протягом 10хв., а функціональну активність органотипової культури програмне заморожування проводять зі швидкістю сім'яників новонароджених поросят після кріокон5°С/хв до температури -40°С. сервування визначали секрецію тестостерону пісСпосіб кріоконсервування органотипової кульля додавання специфічного стимулятора - хоріонітури сім'яників новонароджених поросят, що прочного гонадотропіну (ХГ). Для цього після понується, дає можливість зберегти стероїдогенну розморожування органотипову культуру сім'яників базальну активність органотипової культури сім'япомішували в 2мл живильного середовища 199, ників новонароджених поросят на контрольному що містило 100Од/мл пеніциліну, 75мкг/мл канамірівні, а стимульовану - підвищити на 31,72% у поцину та стимулятор стероїдоге-незу ХГ. Інкубацію рівнянні з нативом. Крім того, спосіб дозволяє скопроводили протягом 1 години при 37°С. Рівень ХГротити та спростити процес кріоконсервування. стимульованої секреції тестостерону в живильне Спосіб пояснюється наступними прикладами. середовище після інкубації становив Приклад 1. Органотипову культуру отримува42Д9±8,99нМоль/мг білку, що складало 131,72 % ли з одного сім'яника новонародженого порося від контролю (таблиця 2). шляхом розрізання його на фрагменти розміром Приклад 2. Спосіб здійснювали аналогічно від 0,5 до 2мм3, культивували протягом 2 діб у 2 прикладу 1, за винятком того, що охолодження до мл живильного середовища 199 з додаванням температури -40°С проводили з різними швидко10% сироватки великої рогатої худоби, 100 Од/мл стями: 1°С/хв., 5°С/хв., 10°С/хв. та 50-60°С/хв. Репеніциліну та 75 мкг/мл канаміцину. Після 2 доби зультати наведено у таблицях 1 і 2, з яких видно, культивування органотипову культуру відмивали що найбільш близькими до контролю за параметвід середовища культивування, переносили у пларом зберігання базальної та стимульованої секрестикові контейнери для кріоконсервування об'ємом ції тестостерону є режим охолодження зі швидкіс2 мл, до неї додавали 1 мл кріоконсервуючого тю 5°С/хв. розчину, що містив живильне середовище 199 та Приклад 3. Спосіб здійснювали аналогічно 10% ДМСО, інкубували протягом 10 хв при темпеприкладу 1, за винятком того, що після культивуратурі 22°С, а далі здійснювали програмне замовання органотипову культуру помішували в розчирожування зі швидкістю 5 °С/хв до температури ни для інкубування, які містили 0, 5, 7, 10 та 15% 40°С, після чого занурювали у рідкий азот. Відігрів ДМСО на середовищі 199. Результати експеримездійснювали на водяній бані при 37°С до появи нту подані у таблиці 3, з якої видно, що ДМСО у рідкої фази. Видаляли ДМСО шляхом триразового концентрації 10% стимулює базальну секрецію відмивання у 10мл живильного середовища 199. тестостерону органотиповою культурою сім'яників Функціональну повноцінність органотипової кульновонароджених поросят. тури сім'яників оцінювали за здатністю виділення Приклад 4. Спосіб здійснювали аналогічно тестостерону в культуральне середовище. Секреприкладу 1, за винятком того, що тривалість інкуцію тестостерону клітинами органотипової культубаціїфрагментів в консервуючому розчині станори оцінювали до та після розморожування. Для вила 5, 10, 15, 30, 45 і 60 хв. Після відігрівання та цього органотипову культуру після видалення видалення кріопротек-тора в органній культурі кріопротектору помішували у 2мл живильного себуло проаналізовано кількість життєздатних клітин редовища 199, що містило 100Од/мл пеніциліну та за виключенням суправітального барвника трипа75мкг/мл канаміцину. Після інкубації протягом 1 нового синього. Кількість клітин підраховували у години відбирали пробу з живильного середовища камері Горяєва. Отримані результати наведені у та вимірювали рівень тестостерону радіоімунолотаблиці 4, з якої видно, що інкубація протягом 10 гічним методом з використанням тест-набору РИАхв дає найвищий рівень життєздатності клітин. 5 80497 6 Таблиця 1 Таблиця 3 Рівень тестостерону в живильному середовищі в залежності від швидкості охолодження Вміст тестостерону нМоль/мг білку % від контролю Умови експерименту Контроль (інтактна добова культура) Кріоконсервована швидкістю 1°С/хв Кріоконсервована швидкістю 5°С/хв Кріоконсервована швидкістю 10°С/хв Кріоконсервована зі швидкістю 40-60°С/хв 2зі зі зі ' 25,46±11,47 94,02 17,48±1,89 67,04 Таблиця 2 Рівень тестостерону в живильному середовищі у присутності ХГ в залежності від швидкості охолодження Умови експерименту Контроль (інтактна 2добова культура) Кріоконсервована зі швидкістю 1°С/хв Кріоконсервована зі швидкістю 5°С/хв Кріоконсервована зі швидкістю 10°С/хв Кріоконсервована зі швидкістю 40-60°С/хв Вміст тестостерону нМоль/мг білку % від контролю 20,5515,09 18,98±2,80 92,36 25,01±1,34 121,70 98,45±19,20 479,07 5,32±12,31 25,88 68,65 17,07±12,01 0%ДМСО 5% ДМСО 7% ДМСО 10% ДМСО 15% ДМСО 50,62 23,94±3,74 Умови експерименту 12,89±11,99 Рівень секреції тестостерону в залежності від концентрації ДМСО Вміст тестостерону нМоль/мг білку % від контролю 32,03±1,99 — 33,43±6,47 104,37 42,19±8,99 131,72 23,92±3,14 74,67 15,06±1,24 47,01 Комп’ютерна верстка В. Клюкін Таблиця 4 Життєздатність клітин органотипової культури сім'яників в залежності від тривалості інкубації Тривалість інкубації 5 хвилин 10 хвилин 15 хвилин 30 хвилин 45 хвилин 60 хвилин Життєздатність, % 94,412,3 95,213,6 76,812,4 37,510,9 18,311,9 17,912,3 Джерела інформації. 1. Гаврилюк Б.К., Сафронов В.П. Органотипическое культивирование тканей.- М.: Наука, 1983.С. 37-40. 2. Schatt S., Kim S.S., Gosden R. Spermatogenesis and steroidogenesis in mouse, hamster and monkey testicular tissue after cryopreservation and heterotopic grafting to castrated hosts // Reproduction.-2002.-V. 124.-P.339-346. 3. Kepoc B.A. Кріоконсервування фетотестикулярної тканини людини. Автореферат дисертації.... Харків, 2001.- 19с. 4. Устиченко В.Д., Алабедалькарим Н.М., Бондаренко Т.П. Влияние сохранения архитектоники ткани на криочувствительность надпочечных желез мышей и новорожденных поросят // Проблемы криобиологии.- 2003.- № 3.- С. 39-45. Підписне Тираж 26 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601