Спосіб флуоресцентної мікроскопії

Спосіб флуоресцентної мікроскопії, що включає застосування флуорохрому для забарвлення біологічного об'єкта в мікропрепараті, який відрізняється тим, що вторинну флуоресценцію забарвленого флуорохромом біологічного об'єкта збуджують падаючим на мікропрепарат з опакілюмінатора синім світлом та одночасно ініціюють поляризаційну флуоресценцію біологічного об'єкта прохідним поляризованим світлом, а потрібний рівень збалансованості різних за фізичною природою видів флуоресценції встановлюють за допомогою світлооптичної системи мікроскопа. Винахід стосується фізики, зокрема фізичної оптики і люмінесценції, і може бути використаний як метод лабораторного дослідження в біології, медицині і ветеринарії, зокрема при проведенні цитолюмінесцентного аналізу в імунології, гематології, онкології та ін. Відомий спосіб флуоресцентної мікроскопії, що включає застосування флуорохрому для забарвлення біологічного об'єкту в мікропрепараті [1]. За відомим способом, флуорохром застосовують або для безпосереднього забарвлення біологічного об'єкту, або у складі попередньо мічених флуорохромом імунних антитіл. За допомогою відомого способу здійснюють візуалізацію окремих мікроструктур біологічного об'єкту, наприклад, при виконанні клініко-лабораторних або імунологічних досліджень. Недоліком відомого способу є недостатня точність та інформативність, що випливає з того, що певні мікроструктури біологічного об'єкту, що підлягає дослідженню, в силу принципових особливостей відомого способу не реагують з міченими флуорохромом імунними антитілами, а відтак випадають з поля зору дослідника, із-за чого недо статньо точно відображають локалізацію на об'єкті мічених антитілами імунних комплексів. На противагу наведеному методичному прийому, безпосереднє суцільне забарвлення об'єкту флуорохромом унеможливлює візуалізацію специфічних мікроструктур: перш за все тих, які причетні до імунологічної взаємодії на поверхні біологічного об'єкту. В основу винаходу поставлено завдання вдосконалити відомий спосіб, в якому шляхом ініціювання процесу флуоресценції біологічного об'єкту одночасно двома принципово різними за походженням світловими потоками досягають підвищення роздільної здатності флуоресценції біологічного об'єкту, а отже підвищення точності та інформативності дослідження. При вирішенні технічного завдання було взято до уваги те, що в силу анізотропних властивостей багатьох молекулярних стр уктур біологічного об'єкту, наприклад, молекул ліпідів і нуклеїнових кислот, і притаманних їм властивостей рідких кристалів, останні підлягають візуалізації за допомогою методу поляризаційної флуоресценції [2]. При дослідженні специфічних імунологічних реакцій за (19) UA (11) 83147 (13) C2 (21) a200702201 (22) 01.03.2007 (46) 10.06.2008, Бюл.№ 11, 2008 р. (72) ВОЛКОВ КОСТЯНТИН СТЕПАНОВИЧ, UA, КОВАЛЬЧУК ОЛЕКС АНДР ЛЕОНІДОВИЧ, U A, ДЕМ'ЯНЕНКО ВАСИЛЬ ВАСИЛЬОВИЧ, UA, ЛІСНИЧУК НАТАЛІЯ ЄВГЕНІВНА, UA (73) ТЕРНОПІЛЬСЬКИЙ ДЕРЖАВНИЙ МЕДИЧНИЙ УНІВЕРСИТЕТ ІМЕНІ І.Я. ГОРБАЧЕВСЬКОГО, UA (56) RU 2005115052, 27.11.2006 RU 2128005, 27.03.1999 US 4777133, 11.10.1988 US 5371624, 06.12.1994 US 4320970, 23.03.1982 WO 8602730, 09.05.1986 Люминесцентный анализ в гастроэнтерологии/ В.А.Лисовский и др.- Л.:: Наука, 1984. - С. 64-67 3 83147 методом мічених флуорохромом антитіл, останні специфічно зв'язуються лише з імунологічно специфічними антитілами або імунними комплексами, залишаючи інтактними інші молекулярні структури. Останні саме й можуть бути візуалізованими за методом поляризаційної флуоресценції. Отже, комбінованим застосуванням одночасно двох видів флуоресценції біологічного об'єкту можна суттєво підвищити рівень точності дослідження та інформативності отриманих результатів. Виходячи з наведених міркувань, поставлене завдання вирішують тим, що у відомому способі флуоресцентної мікроскопії, що включає застосування флуорохрому для забарвлення біологічного об'єкту в мікропрепараті, відповідно до винаходу вторинну флуоресценцію забарвленого флуорохромом біологічного об'єкту збуджують падаючим на мікропрепарат з опак-ілюмінатора синім світлом, і одночасно ініціюють поляризаційну флуоресценцію біологічного об'єкту прохідним поляризованим світлом, а потрібний рівень збалансованості різних за фізичною природою видів флуоресценції встановлюють за допомогою світлооптичної системи мікроскопу. Перелік фігур. Фіг.1. С хема світлооптичної системи флуоресцентної мікроскопії: 1 - джерело світла; 2 - конденсорна система лінз; 3 - поляризатор; 4 - дзеркало; 5 - предметний столик; 6 - об'єктив; 7 - окуляр; 8 - запірний світлофільтр; 9 - джерело світла; 10 - конденсорна система лінз; 11 - теплофільтр; 12 - синій світлофільтр 13 - світло розподільна пластинка; 14 - аналізатор. Фіг.2. Вторинна флуоресценція біологічного об'єкту - гістологічного зрізу тканини кишки в результаті взаємодії з міченими флуорохромом специфічними антитілами. Фіг.3. Комбіноване світіння тканини кишки в мікропрепараті, ініційоване одночасно за принципом вторинної і поляризаційної флуоресценції. Спосіб здійснюють у такий спосіб. На тканинний мікропрепарат у вигляді гістологічного зрізу, частина поверхні якого зв'язана з флуорохромом (безпосередньо, чи у складі специфічних імунних антитіл), спрямовують світловий потік від джерела світла 9 (Фіг.1). Після проходження через конденсорну систему лінз 10 і теплофільтр 11 , світловий потік попадає на синій світлофільтр 12, і відбиваючись під прямим кутом від поверхні світлорозподільної пластинки 13 в опак-ілюмінаторі (на Фіг. не позначено), проходить далі через об'єктив 6 і падає на розміщений на предметному столику 5 мікропрепарат, збуджуючи в ньому вторинну флуоресценцію. Останню спостерігають в окулярі 7 за допомогою встановленого на ньому запірного світлофільтру 8. Для індукції поляризаційної флуоресценції світловий потік від джерела 1 спрямовують 4 через конденсорну систему лінз 2 на поляризатор 3. Відбитий від дзеркала 4, поляризований потік світла індукує поляризаційну флуоресценцію рідкокристалічних структур біологічного об'єкту у встановленому на предметному столику мікроскопа мікропрепараті, яку спостерігають через окуляр 7 із встановленим на ньому аналізатором 14. Користуючись світлооптичною системою мікроскопа, вибирають оптимальний відповідно до задачі дослідження баланс вторинної і поляризаційної флуоресценції біологічного об'єкту. Зокрема, яскравість вторинної флуоресценції регулюють величиною потоку збуджуючого світла від джерела 9, а потрібний рівень поляризаційної флуоресценції встановлюють зміною кута площини поляризації світла поворотом одного з поляризаційних світлофільтрів - поляризатора 3 або аналізатора 14, а також вибором величини потоку світла від джерела 1. Приклад. На гістологічний зріз тканини тонкої кишки на предметному склі попередньо нашарували і через 10хв змили згідно методики прямої реакції Кумбса мічені флуорохромом антитіла. Депарафінізацію гістологічного зрізу не проводили намірено з метою підвищення ілюстративності одночасного збудження в мікропрепараті двох видів флюресценції. Підготовлений до дослідження мікропрепарат помістили на предметний столик люмінесцентного мікроскопу. Спочатку налагодили вторинну флуоресценцію мікропрепарату, для чого світловий потік від відповідного джерела світла спрямували послідовно на конденсорну систему лінз, теплофільтр та синій світлофільтр. Відбитий від поверхні світлорозподільної пластинки світловий потік через об'єктив мікроскопа спрямували на мікропрепарат, а збуджену в ньому вторинну флуоресценцію спостерігали в окулярі через встановлений на ньому запірний світлофільтр. Далі для ініціювання поляризаційної флуоресценції світловий потік від джерела світла спрямували через конденсорну систему лінз і поляризатор на дзеркало і вже встановлений на предметному столику мікропрепарат. Картину поляризаційної флуоресценції рідкокристалічних структур у мікропрепараті спостерігали через окуляр мікроскопа із встановленим на ньому аналізатором. Користуючись світлооптичною системою мікроскопа, вибрали оптимальний баланс вторинної і поляризаційної флуоресценції біологічного об'єкту, зокрема, шляхом регулювання величини потоку збуджуючого світла - для вторинної флуоресценції, та зміною кута площини поляризації світла поворотом поляризатора - для поляризаційної флуоресценції. При порівняння двох картин флуоресцентної мікроскопії на фігура х 2-3 видно, що на відміну від монохромного (зеленого) світіння мічених антитілами структур тканини стінки кишки в мікропрепараті, визначеного за методом вторинної флуоресценції (Фіг.2), одночасне ініціювання світіння біологічного об'єкта в мікропрепараті за методом поляризаційної флуоресценції (Фіг.3) забезпечує високоточне зображення інтактних в імунологічному аспекті тканинних структур (таких, що не вступають у реакцію з міченими антитілами). Таким чином отримані результати містять інформацію про розподіл 5 83147 імунологічно активних і інтактних локусів тканини, що досліджується, одночасно в одному й тому ж мікропрепараті. Таким чином, запропонований спосіб забезпечує ви щий, ніж за способом-прототипом, рівень роздільної здатності флуоресцентного дослідження біологічного об'єкта, а отже точніший і інформативніший флуоресцентний аналіз в цілому. Запропонований спосіб знайде застосування в лабораторній практиці, а також при проведенні Комп’ютерна в ерстка В. Клюкін 6 експериментальних досліджень у різних галузях науки і техніки. Джерела інформації, які слід взяти до уваги: 1. Люминесцентный анализ в гастроэнтерологии. Л: Наука, 1984. - 236с. 2. T.P.Burghardt and D.Axelrod. Total internal reflection/fluorescence photobleaching recovery study of serum albumin adsorption dynamics/ Biophys J. 1981, March; 33(3): 455-467. Підписне Тираж 26 прим. Міністерство осв іт и і науки України Держав ний департамент інтелектуальної в ласності, вул. Урицького, 45, м. Київ , МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислов ої в ласності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601