Спосіб імунофлуоресцентного маркування поверхневих антигенів, зафіксованих на скельцях адгерентних клітин в культурі з використанням моноклональних антитіл для флуоресцентної мікроскопії

Спосіб імунофлуоресцентного маркування поверхневих антигенів, зафіксованих на скельцях адгерентних клітин у культурі, що полягає у використанні моноклональних антитіл та детекції результатів флуоресцентною мікроскопією, який відрізняється тим, що без використання хімічних фіксаторів клітини закріплюються на скельцях одночасно з блокуванням рецепторів імуноглобулінів. Спосіб відноситься до медицини та біології, а саме до лабораторної справи, та може бути використаний в лабораторіях клітинного та тканинного культивування, імунологічних лабораторіях для проведення досліджень на культурах адгерентних клітин. Основними підходами визначення поверхневих антигенів клітин є методи прямої та непрямої імунофлуоресценції з використанням моноклональних антитіл [7, 9, 10,]. Ці методи були розроблені первісно для роботи з клітинами крові, які не є адгерентними, та передбачають роботу з клітинними суспензіями. При роботі з адгерентним типом клітин у суспензії виникає явище утворення клітинних конгломератів за рахунок адгезивних молекул на поверхні клітин, особливо при проведенні непрямого варіанту маркування, коли час проведення реакції значно збільшується. Основним підходом у імунофлуоресцентному маркуванні адгерентних клітин в культурі для флуоресцентної мікроскопії є проведення реакції з моноклональними антитілами на фіксованих препаратах клітин, які вирощували на предметних або покровних скельцях [2, 5]. Цей метод передбачає фіксацію препаратів клітин хімічними фіксаторами: параформальдегідом, або метанолом та ацетоном, глутаровим альдегідом [2], або метанолом [5] та є найбільш близьким аналогом запропонованого способу. цифічного зв'язування поверхневих структур клітини з моноклональними антитілами, що зумовлює появу високого рівня фонової флюоресценції, оскільки фіксація спиртами та альдегідами має певні вади При фіксації альдегідними фіксаторами джерелом фонової флуоресценції можуть бути вільні альдегідні групи, які зв'язують антитіла [11], спиртові та альдегідні фіксатори здатні руйнувати та маскувати антигени [1, 3, 5, 12] Аутофлуоресценція, яка є природним явищем для деяких молекул клітини, виникає у діапазоні збудження від 350 до 500nm, що співпадає з діапазоном збудження найбільш розповсюджених флуоресцентних барвників (FITC, TRITC, Hoechst, РЕ, РКН). Посилення природного рівня аутофлуоресценції за рахунок фіксації [4] призводить до помилок при оцінюванні результатів реакції, в тому числі і у реакції з ізотоп-специфічним контролем. Але постановка прямого та особливо непрямого варіанту іммунофлуоресцентного маркування адгерентних клітин у культурі на скельцях без фіксації утруднено, тому що, по-перше1 час постановки реакції, особливо при непрямому варіанті, є достатньо довгим (до 1,5 години), по друге: розчини моноклональних антитіл містять цитотоксичні речовини, наприклад азід натрію. Все це, як правило, призводить до відкріплення клітин, переходу культури у стан клітинної суспензії та утворення конгломератів. Основним недоліком існуючого способу є посилення аутофлуоресценції та можливість неспе Задача запропонованого способу - уникнути фіксацію хімічними фіксаторами, закріпити культивовані клітини на скельці та максимально можливо ю ю 00 8551 скоротити час проведення реакції Поставлена задача вирішується за рахунок використання покритих ПОЛИ-І_-ЛІЗІНОМ скелець згідно методиці для фіксації неадгерентних клітин [2, 10] з виключенням етапу фіксації спиртами та альдегідами та одночасним блокуванням імуноглобулінових рецепторів Спосіб використовується таким чином Ізоляція, культивування та пасирування адгерентних клітин проводиться за загальноприйнятою методикою [8] При пасируванні монослой клітин знімають без ферментативним способом для уникнення пошкодження поверхневих структур, використовуючи розчин, який містить 1% Трітон-Х-100, Ю т М EDTA та 25тМ Трю-НСІ, рН7 5 [6], або готовий розчин для без ферментативного зняття клітин [Non-enzymatic Cell Dissociation Solution, Sigma, США] Клітинну суспензію одноразово промивають фосфатно-сольовим буферним розчином (PBS) шляхом центрифугування при 1000об/хв 5-7 хвилин Далі клітини двічі промивають у холодному (+4°) комплексному розчині DPBS [Dulbecco's Phosphate Buffered Saline Solution с 2% інактивованої FBS (Fetal Bovine Serum) и 0,09% азідом натрію] при тих же умовах центрифугування Осад ресуспендують у холодному DPBS Кінцева концентрація клітин повинна складати 1,5-2млн клітин в 1мл Далі 200мкл клітинної суспензії наносять на знежирені предметні скельця, які попередньо були оброблені полі-L лізином (Мг 30-70кД у концентрації 100мкг/мл у розчині PBS), промиті у розчині PBS та підсушені Краплю клітинної суспензії наносять у попередньо підготовлений на скельці за допомогою плівки Parafilm осередок або за допомогою склографа із зворотної сторони скельця відмічають ділянку для внесення суспензії Рекомендується на одному скельці проводити одне дослідження для запобігання змішування розчинів антитіл Далі скельця з клітинними суспензіями витримують 30-40 хвилин при 37°С що фіксує клітини на скельці та забезпечує етап блокування рецепторів імуногпобулінів на поверхні клітин для попередження неспецифічного зв'язування з антитілами за рахунок інкубацм клітин у комплексному розчині DPBS Після фіксації скельця промивають у розчині PBS, який наносять в осередок та обережно зливають, підтримуючи за край скельця Далі наносять розчини моноклональних антитіл у концентраціях, які рекомендує фірма-виробник При прямому варіанті методу, після інкубації з першими антитілами, скельця тричі промивають розчином PBS, а при використанні непрямого маркування після триразового промивання у розчині PBS, клітинна суспензія інкубується з другими антитілами, концентрації яких та час інкубації слід витримувати за рекомендаціями фірми-виробника Комп'ютерна верстка М Мацело Етапи фіксації та інкубації слід проводити у вологій камері Далі скельця тричі миють у розчині PBS, знімають плівку та підсушують Для проведення мікроскопи на скельця наносять Юмкл 50% розчину гліцерину, який готують на 3,7% параформальдегіду, накривають покровним скельцем, запаюють парафіном або лаком для НІГТІВ та ураховують результати Джерела інформації прийняті до уваги 1 Benoliel Anne-Mane, Kahn-Perles В , Imbert J , Verrando P Insuhne stimulates haptotactic migration of human epidermal keratinocytes through activation ofNF-kB transcription factor J of Cell Science 1997, 110 2089-2097 2 Cell Adgesion Protocol Manual 1st ed BD Biosciences Pharmmgen, 10975, Torreyana Road, San Diego, CA 92121 - September, 2001 - 53p. http //www bdbiosciences com/pdfs/manuals/0181014-7Apdf 3 Fluorescent microscopy of living cell in culture, ed by Yu-Li Wang, D Lansing Taylor - Academic press, San Diego CA,1989 - Part A - ЗЗЗр 4 Fluorescent microscopy of living cell in culture, ed By Yu-Li Wang, D Lansing Taylor - Academic press, San Diego,CA,1989 - Part В - 503p 5 Julio E Cells Cell Biology A Laboratory Handbook, 2nd ed - Academic press, San Diego,CA,1997 - V o l 2 -533p 6 Patricia Rousselle, Gregory P Lunstrum, Douglas R Keene, and Robert E Burgeson Kalinin An Epithelium-Specific Basement Membrane Adhesion Molecule That Is a Component of Anchoring Filaments The Journal of Cell Biology 1991,Volume 114' 567-576 7 Введение в современную иммунологию понятие об иммунитете и методы оценки состояния клеточного иммунитета/ Учебное пособие под ред академика АМН СССР, проф К П Кашкина-Москва ЦИУВ -1992 -34с 8 Гаврилюк Б К , Рочев Ю А , Николаева Т И Культура клеток и реконструкция ткани (на примере кожи) - Пущине ОНТИ НЦБИ АН СССР, 1988 123с 9 Иммунологические методы/ Под ред Ґ Фримеля, пер с нем - М Медицина, 1987 -472с 10 Иммуноцитохимия и моноклональные антитела в онкогематологии/ Под общ ред Пинчука В Г , Глузмана Д Ф , АН УССР Ин-т проблем онкологии им Р Е Кавецкого - Киев Наук думка, 1990 -232с 11 Микроскопическая техника Руководство для врачей и лаборантов/ Под ред Д С Саркисова и Ю Л Перова - Москва Медицина, 1996 - 544с 12 Молекулярная клиническая диагностика Методы/ Под ред С Херрингтона и Дж Макги Москва Пер с англ Мир,1999 -558с Підписне Тираж 26 прим Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності вуп Урицького, 45, м Київ, МСП, 03680, Україна ДП "Український інститут промислової власності", вул Глазунова, 1, м Київ-42, 01601