Штам enterococcus raffinosus 42-д для використання в тест-системах для видової ідентифікації ентерококів за біохімічними ознаками

Штам Enterococcus raffinosus для використання як позитивного контролю в тест-системах для видової ідентифікації ентерококів за біохімічними ознаками, депонований в депозитарії ДУ "Інститут епідеміології та інфекційних хвороб ім. Л. В. Громашевського АМН України" за № 42-Д. UA (21) a201005386 (22) 05.05.2010 (24) 25.07.2011 (46) 25.07.2011, Бюл.№ 14, 2011 р. (72) МИРОНЕНКО ЛЮДМИЛА ГРИГОРІВНА, ПЕРЕТЯТКО ОЛЕНА ГЕОРГІЇВНА, В'ЯЛИХ ЖАННА ЕДУАРДІВНА, БОЖКО МАРИНА ГЕННАДІЄВНА, БАЛУТА ІГОР МИРОНОВИЧ, МІЗІН ВАСІЛЬ ВАСИЛЬОВИЧ, КРЕСТЕЦЬКА СВІТЛАНА ЛЕОНІДІВНА, КАЗМІРЧУК ВІКТОР ВОЛОДИМИРОВИЧ (73) ДЕРЖАВНА УСТАНОВА "ІНСТИТУТ МІКРОБІОЛОГІЇ ТА ІМУНОЛОГІЇ ІМ. І.І. МЕЧНИКОВА АМН УКРАЇНИ" (56) GEN-Probe. Enterococcus culture identification test, November 2, 2001. 102843 Rev.J. Знайдено в інтернет. Facklam R.R. and Collins M.D. “Identification of enterococcus species isolated from human infections by a conventional test scheme”, Journal of clinical microbiology, Apr. 1989, p. 731-734. Lindsay M. et al.:”Comparison of enterococcus raffinosus with enterococcus avium on the basis of penicillin susceptibility, penicillin-binding protein analysis, and high-level aminoglycoside resistance”, Antimicrobial agents and chemotherapy, Vol. 35, No. 7, July 1991, p. 1408-1412. Brtkova A. et al.:”Characterization of enterococci of animal and environmental origin using phenotypic method and comparison with PCR based method”, Veterinarni Medicina, 55, 2010 (3):97-105. C2 2 (19) 1 3 95392 ідентифікацію 12 штамів. Оцінка результатів тесту здійснюється візуально: за таблицею "Інтерпретація результатів" з використанням кольорової шкали та/або кольорових реакцій контрольних штамів. При цьому, використання контрольних штамів дозволяє, певним чином, підвищити об'єктивність оцінки та контролювати функціональність тестсистеми. Як позитивний контроль в EN-COCCUStest виробником рекомендується референтний штам Enterococcus raffinosus CCM4216, [Collins M.D. Enterococcus raffinosus sp.nov., Enterococcus solitarius sp.nov.and Enterococcus pseudoavium sp.nov. [Text] / Collins, M. D., Facklam, R. R., Farrow, J. A.E., Williamson, R… // FEMS Microbiol.Lett.-1989. - V57. - P.283-288ISSN:1574-6968], що є прототипом винаходу, яка заявляється. Він характеризується широким спектром біохімічної активності та дає позитивну реакцію з більшістю субстратів тестсистеми (за винятком аргініну). В склад набору ENCOCCUStest, доступного на вітчизняному ринку, цей штам не входить, оскільки експортно-імпортні операції з біологічним матеріалом вимагають дотримання складних та вартісних процедур. Штам депоновано в багатьох національних та міжнародТ них колекціях (ССМ 4216 = АТСС 49427=CCUG29292=DSM5633=JCM8733=LMG128 88=NCIMB12901=NCTC12192), однак в Україні не депоновано. Складність та вартість процедури 4 трансферу поряд з необхідністю періодичного оновлення культури, робить його придбання для окремої клініко-діагностичної лабораторії в Україні економічно недоцільним, що ускладнює використання тест-системи. Культурально-морфологічні та фізіологобіохімічні особливості Факультативно анаеробні, каталазо-негативні грам-позитивні коки розміром (0,60,6-1,5) мкм, в мазках розташовуються окремо, парами або ланцюжками. Спор та капсул не утворюють, нерухомі. При вирощуванні на поверхні середовища "Ентерококагар" колонії світло-рожевого кольору, правильної округлої форми діаметром 0,7-1,0 мм, з гладкою, випуклою поверхнею та рівним краєм. В рідких поживних середовищах утворюють однорідну каламуть. Здатний рости при температурі (10-45)°С, температурний оптимум -37 °C. Оптимальне для росту значення рН 6,3-6,6. Росте при 40 % жовчі, при 6,5 % NaCl, при рН 9,6. Не гідролізує аргінін, ескулін та гіпурат. Ферментує вуглеводи з утворенням молочної кислоти без продукування вуглекислого газу. Зброджує сахарозу, лактозу, мелібіозу, рафінозу, гліцерол, сорбітол, манітол, арабінозу, D-глюкозу, мелецитозу, рибозу, сорбозу, D-арабітол, L-арабітол, D-манозу, саліцин, трегалозу. Не ферментує ксилол, інулін. Таблиця 1. Біохімічні властивості Е. raffinosus за результатами дослідження з використанням EN-COCCUStest (температурний оптимум 37 °C). Тести Н ARG G SOE + F ARA + Е MAN + Примітки: ARG - аргінін, SOE - сорбоза, ARA арабіноза, MAN - манітол, SOR - сорбітол, MLB мелібіоза, RAF - рафіноза, MLZ - мелецитоза, "+" позитивний результат, "-" - негативний результат. В основу винаходу поставлено задачу ізолювати, охарактеризувати та депонувати в Україні новий штам Е. raffinosus, що, за спектром біохімічної активності, є придатним для використання як референтний в тест-системах для ідентифікації представників роду Enterococcus. Поставлене завдання вирішено використанням штаму, ізольованого у 2006 році в бактеріологічній лабораторії Міської дитячої поліклініки № 13 м. Харкова, з кишечнику дитини з синдромом дисбактеріозу. В філії Музею мікроорганізмів на базі ДУ "Інститут мікробіології та імунології ім. І. І. Мечникова АМН України" штам ідентифіковано як Е. raffinosus. Спосіб одержання штаму. Штам культивовано в поживному середовищі "Ентерококагар" (Росія) шляхом пересівів з окремих колоній 1-2 рази на тиждень з подальшою витримкою в термостаті при 37±0,5 °C. Кінцеве клонування штаму проведено двадцятьма пасажами з окремих колоній. В процесі виконаних пасажів ре D SOR + С MLB + В RAF + А MLZ + тельно вивчено біохімічні властивості проміжних культур ентерококу і підтверджено їх стабільність протягом року. Культурально-морфологічні та фізіологобіохімічні особливості. Морфологія: грампозитивні коки розміром (0,60,6-1,5) мкм, в мазках розташовуються окремо, парами або ланцюжками. Спор та капсул не утворюють, нерухомі. Культуральні властивості: росте при температурі (10-45)°С, температурний оптимум - 37 °C; оптимальне для росту значення рН 6,3-6,6; при вирощуванні на поверхні середовища "Ентерококагар" колонії світло-рожевого кольору правильної округлої форми, діаметром 0,7-1,0 мм, з гладенькою, випуклою поверхнею, рівним краєм; у бульйоні утворюють однорідну каламуть. Фізіолого-біохімічні властивості: факультативний анаероб, каталазонегативний; росте в присутності 40 % жовчі, 6,5 % NaCl, рН 9,6; не гідролізує аргінін, ескулін та гіпурат; зброджує вуглеводи з утворенням молочної кислоти без продукування вуглекислого газу; зброджує сахарозу, лактозу, мелібіозу, рафінозу, гліцерол, сорбітол, манітол, арабінозу, D-глюкозу, мелецитозу, рибозу, сорбо 5 95392 зу, D-арабітол, L-арабітол, D-манозу, саліцин, трегалозу; не ферментує ксилол та інулін. Умови зберігання Для довгострокового зберігання штаму необхідна його ліофілізація, що може бути виконано за стандартною технологією. Тимчасове зберігання штаму ентерококу до місяця включно можливо проводити у пробірках з середовищем МПА під шаром вазелінової олії в рефрижераторі з температурою у діапазоні від +2 до +5 °C. Спосіб, умови та склад середовища для культивування штаму. Для одержання культури з ліофілізованого матеріалу здійснюють регідратацію шляхом додавання 5 мл фізіологічного розчину хлориду натрію або поживного середовища. Після цього матеріал серійно розводять по 1 мл в рядах з 9 пробірками по 9 мл, середовища в кожній і витримують в термостаті з щоденною перевіркою протягом 4 днів. Відомості про депонування: штам Enterococcus raffinosus депоновано у Депозитарії ДУ "Інститут епідеміології та інфекційних хвороб ім. Л. В. Громашевського АМН України" за номером 42 -Д 22 березня 2010 року. Можливість здійснення винаходу підтверджує нижче наведений приклад використання штаму, що заявляється. ПРИКЛАД Визначення якості тест-системи ENCOCCUStest виробництва Pliva-Lachema Diagnostika (Чехія): контроль функціональності набору та якості проведення видової ідентифікації ентерококів з використанням штаму Enterococcus raffinosus42-Д як позитивного контролю. Чисті культури контрольних штамів виду Enterococcus raffinosus42-Д, висівають на кров'я 6 ний агар для отримання ізольованих колоній та інкубують при 37 °C протягом 18-24 годин. Подальша послідовність дій проводиться згідно з інструкцією по використанню набору ENCOCCUStest виробництва Pliva-Lachema Diagnostika (Чехія). Приготування суспензій мікроорганізмів із визначеною концентрацією мікробних клітин проводили за допомогою електронного приладу DensiLa-Meter (PLIVA-Lachema a.s., Чехія) за шкалою McFarland згідно з інструкцією. З поверхні агарових середовищ стерильним фізіологічним розчином змивають культуру та доводять до двох одиниць оптичного стандарту щільності за McFarland. Водночас здійснюють посів суспензії культури для перевірки її чистоти та ростових властивостей. Інкубують при температурі 37 °C протягом 24 годин. Суспензію ретельно струшують та вносять по 0,1 мл в лунки одного ряду пластинки. Після інокуляції в лунки колонки Н (тест на аргінін) додають 2 краплі парафінового масла. Закривають пластинку, розміщують в поліетиленовому пакеті, та інкубують при температурі (35-37)°С протягом 24 годин, після чого здійснюють оцінку результатів тестів. Тест-система може вважатися придатною до використання якщо профіль біохімічної активності референтного штаму Enterococcus raffinosus відповідає стандарту, а саме аргінін - негативний тест (жовтий або світло-помаранчевий колір), сорбоза, арабіноза, манітол, сорбітол, мелібіоза, рафіноза, мелецитоза - позитивний тест (жовтий або світлопомаранчевий колір). Отримані дані наведено в табл. 2. Таблиця 2. Біохімічні властивості Е. raffinosus42-Д за результатами дослідження з використанням EN-COCCUStest (температурний оптимум 37 °C). Тести Н ARG G SOE + F ARA + Е MAN + Примітки: ARG - аргінін, SOE - сорбоза, ARA арабіноза, MAN - манітол, SOR - сорбітол, MLB мелібіоза, RAF - рафіноза, MLZ - мелецитоза, "+" позитивний результат, "-" - негативний результат. Наведені результати підтверджують можливість здійснення корисної моделі, оскільки за па Комп’ютерна верстка І.Скворцова D SOR + С MLB + В RAF + А MLZ + раметрами, які оцінюються в тест-системі ENCOCCUStest, штам Enterococcus raffinosus42-Д ідентичний штаму Enterococcus raffinosus CCM4216. Підписне Тираж 23 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601