Спосіб поліпшення здоров’я рослин

Реферат: Винахід належить до способу поліпшення здоров'я рослин, забезпечення рослини дикамбою або продуктом DMO-опосередкованого метаболізму дикамби, у кількості, яка поліпшує здоров'я рослини у порівнянні з рослиною того ж генотипу, але яка не була забезпечена дикамбою або продуктом його DMO-опосередкованого метаболізму, де рослина забезпечена дикамбою або продуктом його DMO-опосередкованого метаболізму є трансгенною рослиною, що містить трансген, який кодує дикамбамонооксигеназу (DMO). UA 102507 C2 (12) UA 102507 C2 UA 102507 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 ОПИС Передумови винаходу Дана заявка заявляє пріоритет Тимчасової Заявки США із серійним № 60/852308, поданої 16 жовтня 2006 року, повне розкриття якої включено в дану заявку за допомогою посилання. Галузь винаходу Даний винахід стосується, в основному, галузі сільського господарства. Конкретніше, даний винахід стосується способів поліпшення здоров’я рослин шляхом нанесення гербіциду дикамби і/або її метаболітів або аналогів на рослини. Опис попереднього рівня техніки Дикамба (3,6-дихлор-о-анісова кислота або 3,6-дихлор-2-метоксибензойна кислота; Фіг. 7), активний інгредієнт у гербіцидах, таких як Banvel® (BASF), Clarity® (BASF) і Vanquish® (Syngenta), є високоактивним гербіцидом. Хоча точний механізм її дії неясний, виявилося, що вона діє як регулятор росту рослин (наприклад, Grossmann 2000). Її застосування призводить, серед іншого, до неконтрольованого росту, кучерявості і скручування листя, ушкодження хлоропласта і прямих фітотоксичних ефектів. Вважають, що деякі такі ефекти викликані синтезом етилену, що є пусковим механізмом підвищення біосинтезу абсцизової кислоти, ще одного рослинного гормону. Таким чином, дисбаланс рівнів рослинних гормонів, як виявилося, лежить в основі токсичних ефектів. Було виявлено, що дикамбамонооксигеназа (DMO), сприяє толерантності до дикамби шляхом розкладання її до 3,6-дихлорсаліцилової кислоти (DCSA; 3,6-DCSA; Фіг. 7) у бактеріях (наприклад, Herman et al, 2005; Патент США № Publ. 20060168700; U.S. 7,022,896). Ген DMO у результаті використовували для надання толерантності до дикамби в сої та інших рослинах (наприклад, Weeks et al, 2006). Ці нові толерантні до дикамби сільськогосподарські культури уможливлюють застосування дикамби для сільськогосподарських культур, що раніше були надзвичайно чутливі до будь-якого впливу дикамби, зокрема, дводольні рослини, такі як бавовник, канола (canola - Can(ada) o(il) l(ow) a(cid), різновид ріпаку) і соя культурна. Патент США № 7230163 описує спосіб підвищення врожайності сільськогосподарських культур шляхом нанесення синтетичного ауксину для рослини. Однак проблема здоров’я рослин, наприклад, опірність біотичному або абіотичному стресу, не торкається, також як і ефект метаболітів застосовуваного ауксину. Оскільки in planta метаболізм, як правило, є непередбаченим, тобто не можна пророчити на підставі відомих із рівня техніки традиційних застосувань дикамби (наприклад, для зернових культур, що не експресують ген DMO), до якого результату можуть призвести метаболіти при застосуванні дикамби для нових толерантних до дикамби сільськогосподарських культур, що експресують DMO, або ефекти таких метаболітів у рослині. Авторами даного винаходу було виявлено, що в цих DMO-експресуючих сільськогосподарських культурах DMO виявляє дію з детоксикації дикамби та утворює метаболіти дикамби, включаючи DCSA. Несподівано, авторами даного винаходу також було виявлено, що такий DCSA метаболіт має ефекти, сприятливі для здоров’я рослин. Відповідно, даний винахід спрямований, серед іншого, на способи поліпшення здоров’я рослин із використанням метаболітів дикамби, включаючи DCSA, та одержуваних у результаті рослин, насіння і врожаїв. Такі поліпшення здоров’я рослин забезпечують підвищену опірність рослин проти біотичного (наприклад, комахи, гриби, віруси, нематоди та інші патогени) і абіотичного стресів (наприклад, посуха, холод, озон, дефіцит поживних речовин у ґрунті), призводячи в результаті до підвищення врожайності і поліпшення якості сільськогосподарських культур, і всі вони будуть мати велику користь для сільського господарства. Короткий опис малюнків На Фіг. 1 показана індукція PR2 у різні точки часу після обробки DMO-рослин за допомогою дикамби. На Фіг. 2 показана індукція PR2 при різних нормах застосування дикамби і DCSA через 24 години після обробки у двох незалежних трансгенних лініях сої. На Фіг. 3 показаний ефект обробки рослин бавовнику Pythium ultimum у присутності або за відсутності 3,6-DCSA. На Фіг. 4 показаний ефект обробки рослин бавовнику Xanthomonas campestris pv. malvacearum у присутності або за відсутності 3,6-DCSA. На Фіг. 5 показана відсутність несприятливого ефекту на врожайність та інші агрономічні характеристики при забезпеченні гена DMO у сої. На Фіг. 6 показаний ефект на врожайність при нанесенні дикамби шляхом оббризкування. На Фіг. 7 показані хімічні структури дикамби і 3,6-DCSA. Короткий опис винаходу 1 UA 102507 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 В одному аспекті даний винахід забезпечує спосіб поліпшення здоров’я рослини, що включає забезпечення рослини дикамбою або продуктом її DMO-опосередкованого метаболізму або її аналогом, у кількості, що поліпшує здоров’я рослини в порівнянні з рослиною такого ж генотипу, яка не була забезпечена дикамбою або продуктом її DMO-опосередкованого метаболізму або її аналогом. В одному варіанті втілення даний винахід забезпечує спосіб поліпшення здоров’я рослини, що включає контактування рослини з дикамбою або продуктом її DMO-опосередкованого метаболізму для забезпечення рослини продуктом DMOопосередкованого метаболізму дикамби в кількості, що поліпшує здоров’я рослини, у порівнянні з рослиною такого ж генотипу, яка не була забезпечена дикамбою або продуктом її DMOопосередкованого метаболізму, де рослина, що контактує з дикамбою, включає DMO. В одному варіанті втілення винаходу рослина знаходиться на рослинницькій ділянці. Спосіб також може включати випадки, коли рослина піддається біотичному або абіотичному стресу до, одночасно з цим, або після забезпечення рослини дикамбою або продуктом її DMOопосередкованого метаболізму або її аналогом. Спосіб також може додатково включати стадію ідентифікації рослини, що потребує поліпшення здоров’я рослини, до забезпечення рослини дикамбою або продуктом її DMO-опосередкованого метаболізму або її аналогом. В одному варіанті втілення ідентифікація рослини, що потребує поліпшення здоров’я рослини, включає ідентифікацію рослини, що включає щонайменше перший симптом, що є показником біотичного або абіотичного стресу. У конкретних варіантах втілення винаходу симптом вибраний із групи, що включає низькорослість, втрату функції фотосинтезу, перокиснення ліпідів, акумуляцію активних форм кисню, підвищений вміст вільних радикалів і нейротизацію тканин (яку також називають “алергічною реакцією”). У конкретному варіанті втілення винаходу, рослина демонструє симптом низькорослості. Рослина, ідентифікована як така, що потребує поліпшення здоров’я, може являти собою незрілу рослину в стадії вегетативного росту і чутливу до захворювань або до росту бур’янів. У конкретних варіантах втілення винаходу, рослина являє собою сою в стадії росту VE до V3, бавовник у стадії до формування першої коробочки, або зернову культуру, до стадії або що знаходиться в стадії росту VE до VT. Рослина, здоров’я якої поліпшують відповідно до даного винаходу, може мати ризик бути підданою або знаходитися під дією абіотичного стресу. Приклади абіотичного стресу включають осмотичний стрес, вплив жари або холоду, окисний стрес і дефіцит поживних речовин. У конкретному варіанті втілення винаходу, рослина має ризик бути підданою або знаходитися під дією осмотичного стресу, такого як стрес, викликаний засухою. В іншому варіанті здійснення винаходу, рослина має ризик бути підданою або знаходитися під дією окисного стресу, такого як у результаті застосування гербіциду або в результаті присутності озону на рівні, що може зашкодити рослині. Цю рослину також можна визначити як таку, що має ризик бути підданою або знаходиться під дією біотичного стресу. Приклади біотичного стресу включають грибкове захворювання, таке як іржа сої, вірусне захворювання, бактеріальне захворювання, нашестя комах-шкідників, нематодна інвазія і нашестя бур’янів. В одному варіанті втілення винаходу рослина має ризик бути підданою або знаходитися під дією стресу, викликаного грибковим захворюванням. У конкретному варіанті втілення винаходу рослина має ризик бути підданою або знаходитися під дією стресу, викликаного іржею сої. В іншому варіанті здійснення винаходу рослина має ризик бути підданою або знаходитися під дією стресу, викликаного нашестям бур’янів. Нашестя бур’янів є причиною стресу в сільськогосподарських культур, особливо молодих рослин, таких як соя аж до стадії росту V3-V4. У способі за даним винаходом можна підвищити стійкість рослини до окисного стресу. Спосіб за даним винаходом також може включати забезпечення популяції рослин дикамбою або продуктом її DMO-опосередкованого метаболізму або її аналогом для поліпшення здоров’я рослин, наприклад, за допомогою метаболізму дикамби до DCSA. При застосуванні дикамби можна використовувати норму її нанесення, що не є гербіцидною, але при цьому є корисною для здоров’я рослин, завдяки метаболізму дикамби до DCSA або іншого продукту метаболізму дикамби або DCSA у рослинах. У способі за даним винаходом продукт DMO-опосередкованого метаболізму можна визначити як один або декілька з 3,6-DCSA, 3,5-DCSA або 3-CSA, або метаболітів 3,6-DCSA, 3,5-DCSA і 3-CSA. Дикамба, застосовуваний продукт DMO-опосередкованого метаболізму, або метаболіт, може бути гербіцидним. Рослина може включати трансген, який кодує DMO. Застосовуваний продукт або метаболіт застосовуваного продукту також може бути негербіцидним. В одному варіанті втілення винаходу використовують норму витрати на ділянці від близько 0,0025 фунтів на акр (ф/а) до близько 9 ф/а, включаючи від близько 0,25 ф/а до 2 UA 102507 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 близько 1,5 ф/а дикамби, включаючи, наприклад, від близько 0,25 ф/а до близько 1 ф/а, від близько 0,5 ф/а до близько 1,5 ф/а і від близько 0,5 ф/а до близько 1 ф/а, а також менші і більші кількості і всі граничні значення в рамках зазначеного діапазону, такі як близько 0,005 ф/а, близько 0,01 ф/а, близько 0,025 ф/а, близько 0,05 ф/а, близько 0,15 ф/а, близько 0,175 ф/а, близько 2 ф/а, близько 4 ф/а, близько 7 ф/а і близько 12 ф/а. В іншому варіанті здійснення винаходу використовують від близько 0,0025 ф/а до близько 12 ф/а DCSA, включаючи, наприклад, від близько 0,25 ф/а до близько 4 ф/а, від близько 0,5 ф/а до близько 6 ф/а і від близько 4 ф/а до близько 12 ф/а, а також менші і більші кількості і всі граничні значення в рамках зазначеного діапазону, включаючи близько 0,005 ф/а, близько 0,01 ф/а, близько 0,025 ф/а, близько 0,05 ф/а, близько 0,15 ф/а, близько 0,175 ф/а, близько 0,25 ф/а, близько 0,5 ф/а, близько 1 ф/а, близько 3 ф/а, близько 5 ф/а, близько 8 ф/а, близько 12 ф/а, близько 15 ф/а і близько 20 ф/а. У деяких варіантах втілення даного винаходу дикамбу або продукт DMOопосередкованого метаболізму можна застосовувати неодноразово, а також при не-гербіцидній нормі застосування. У конкретних варіантах втілення винаходу DCSA забезпечують для рослини, включаючи будь-яку її частину, шляхом нанесення дикамби на рослину і забезпечуючи можливість продукування DCSA у результаті метаболізму в рослині. У такий спосіб досягається сприятливий для здоров’я рослин ефект безпосереднього нанесення дикамби. Альтернативно, DCSA або інший продукт метаболізму дикамби можна вводити безпосередньо. Рослина, що використовується в одному варіанті здійснення винаходу, може включати трансген, що кодує DMO. Рослина може являти собою дводольну рослину. Приклади дводольних рослин включають люцерну, боби, буряк, броколі, капусту, канолу, моркву, цвітну капусту, селеру, китайську капусту, бавовник, огірок, баклажан, льон, земляну грушу, латук, люпин, диню, горох, перець, земляний горіх, картоплю, гарбуз звичайний, редьку, ріпак, шпинат, сою, гарбуз великоплідний столовий, цукровий буряк, соняшник, помідор і кавун звичайний. У деяких варіантах втілення винаходу, рослину вибирають із групи, що включає бавовник, канолу або рослину із сімейства бобових, таку як соя або люцерна. У конкретному варіанті втілення винаходу, рослина являє собою сою (Glycine max). В іншому варіанті здійснення винаходу, рослина являє собою рослину бавовнику (Gossypium sp., таку як G. hirsutum). У деяких варіантах втілення винаходу рослина може являти собою однодольну рослину. Приклади однодольних рослин включають ячмінь, кукурудзу, цибулю-порей, цибулю, рис, сорго, цукрову кукурудзу, пшеницю, жито, просо, цукрову тростину, овес, тритикале, просо прутоподібне і газонну траву. У деяких варіантах втілення винаходу, рослина може являти собою зернову культуру (Gramineae), таку як кукурудза (Zea mays). У конкретному варіанті втілення винаходу, рослина являє собою кукурудзу. Рослина також може бути визначена як толерантна до гербіциду, вибраного з групи, що складається з гліфосату, глуфосинату, 2,4-D, ізоксафлутолу, дикамби і сульфонілсечовини, включаючи будь-яку їхню комбінацію, і її можна обробляти будь-яким із таких гербіцидів. У деяких варіантах втілення винаходу, рослина є толерантною до гліфосату і сульфонілсечовини, або до глуфосинату і сульфонілсечовини. У деяких інших варіантах втілення винаходу, рослина є толерантною до гліфосату і дикамби. У конкретному варіанті втілення винаходу, рослина є толерантною до дикамби, завдяки присутності трансгену, що виявляє дію з детоксикації дикамби. В іншому конкретному варіанті втілення винаходу, рослина не включає трансген, що виявляє дію з детоксикації дикамби. В іншому аспекті, даний винахід забезпечує спосіб підвищення врожайності рослини, що включає контактування рослини з кількістю дикамби або продуктом DMO-опосередкованого метаболізму дикамби, ефективною для підвищення врожайності рослини в порівнянні з рослиною такого ж генотипу, вирощуваною у таких же умовах, але яка не контактувала з дикамбою або продуктом DMO-опосередкованого метаболізму дикамби. Рослина може знаходитися на рослинницькій ділянці. Спосіб може, крім того, включати контактування популяції рослин із дикамбою або продуктом її DMO-опосередкованого метаболізму. Продукт DMO-опосередкованого метаболізму може являти собою 3,6-DCSA, 3,5-DCSA або 3-CSA, або метаболіт 3,6-DCSA, 3,5-DCSA або 3-CSA, такий як DCGA (5-OH DCSA; DC-гентизинова кислота). У конкретних варіантах втілення способу, рослина може містити трансген, що кодує DMO. Рослина може являти собою, наприклад, дводольну або однодольну рослину, описану в даній заявці. Рослина також може бути визначена як толерантна до гербіциду, вибраного з групи, що складається з гліфосату, глуфосинату, 2,4-D, мезотріону, тіазопіру, ізоксафлутолу, бромоксинілу, атразину, флуазифопу-P і сульфонілсечовин/імідазолінонів, включаючи будь-яку їхню комбінацію, і її можна обробляти будь-яким із таких гербіцидів. 3 UA 102507 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Інший варіант втілення даного винаходу включає спосіб поліпшення здоров’я насіння, що включає контактування насіння з дикамбою або продуктом її DMO-опосередкованого метаболізму, використовуваного в кількості, що поліпшує здоров’я насіння у порівнянні з насінням такого ж генотипу, що не контактувало з дикамбою або продуктом її DMOопосередкованого метаболізму. Ще в одному аспекті, даний винахід забезпечує спосіб одержання 3,6-DCSA, що включає контактування популяції рослин на рослинницькій ділянці з дикамбою, де рослини включають трансген, що кодує DMO. Детальний опис винаходу Відповідно до даного винаходу, забезпечуються способи поліпшення здоров’я рослин, включаючи підвищення опірності рослин до захворювань, надання рослині підвищеної стійкості до окисного стресу і/або підвищення врожайності рослини. Здоров’я рослин та інші переваги забезпечення дикамбою або метаболітом дикамби, таким як 3,6-DCSA або DCGA (5-OH DCSA; DC-гентизинова кислота), є особливо незвичайними, зважаючи на те, що дикамба звичайно є високотоксичною для багатьох видів рослин. “Дикамба” стосується 3,6-дихлор-o-анісової кислоти або 3,6-дихлор-2-метоксибензойної кислоти (FIG. 7) та її кислот і солей. Її солі включають солі ізопропіламіну, диглікоаміну, диметиламіну, калію і натрію. Приклади комерційних композицій дикамби включають, без обмеження, Banvel™ (у вигляді DMA солі), Clarity® (у вигляді DGA солі, BASF), VEL-58-CS-11™ і Vanquish™ (у вигляді DGA солі, BASF). Даний винахід тому стосується, в одному аспекті, незвичайного відкриття, що обробка за допомогою дикамби дикамба-резистентної рослини, що включає трансген дикамбамонооксигеназу (DMO), забезпечує поліпшення здоров’я рослини. Такі зв’язані зі здоров’ям переваги можуть включати, наприклад, опірність рослини до біотичного та абіотичного стресу. У конкретних варіантах втілення винаходу, дикамбу, 3,6-DCSA (див., наприклад, Фіг. 7), та її аналоги можна використовувати для досягнення одного або декількох пов’язаних зі здоров’ям переваг, вибраних з опірності до захворювань, опірності до окисного стресу і врожайності. В інших варіантах втілення винаходу, такі обробки можуть індукувати відповідь рослини, що звичайно називають “Системною набутою стійкістю” (“SAR”). Дикамба, 3,6-DCSA, DCGA та інші продукти DMO-опосередкованого метаболізму дикамби, і субстрати DMO можуть, таким чином, індукувати поліпшення здоров’я рослин. “Продукт DMOопосередкованого метаболізму дикамби” може включати 3,6-DCSA, продукт метаболізму 3,6DCSA або його аналог. Білки, що продукуються у відповідь на застосування дикамби або DCSA, можуть безпосередньо мати антимікробну активність (наприклад, білок патогенезу, такий як хітиназа) або можуть мати іншу функцію, яка є потенціатором одного або декількох із наступних: поліпшення здоров’я рослин, опірність до захворювань, опірність до окисного стресу і підвищена врожайність. Таким чином, один аспект даного винаходу являє собою спосіб одержання 3,6-DCSA або DCGA, що включає контактування популяції рослин на рослинницькій або рільницькій ділянці з дикамбою. Рослини можуть являти собою трансгенні рослини, що включають трансген DMO. У деяких аспектах даного винаходу, рослина може контактувати з продуктом in planta DMOопосередкованого метаболізму дикамби, таким як 3,6-DCSA або DCGA, так, щоб рослина демонструвала підвищену опірність до стресу в порівнянні зіншою ідентичною рослиною, яку не піддавали контактуванню з дикамбою або продуктом DMO-опосередкованого метаболізму дикамби. В одному варіанті втілення винаходу, рослину можна визначити як таку, що не містить DMO трансген і як таку, що контактувала з не-гербіцидним продуктом DMO-опосередкованого метаболізму дикамби, таким як 3,6-DCSA. Було виявлено, наприклад, що рослини бавовнику, що контактували з 3,6-DCSA, переживають інокуляцію патогенними для цієї рослини ооміцетами Pythium ultimum, які за таких самих умов убивають інші ідентичні рослини, вирощувані в таких самих умовах, але які не контактували з 3,6-DCSA. В іншому аспекті, рослина може контактувати з дикамбою, 3,6-DCSA, DCGA і/або іншими продуктами DMO-опосередкованого метаболізму in planta, що надає підвищену стійкість до окисного стресу. Такий стрес може бути екологічним або, наприклад, може бути викликаний присутністю гербіциду, патогену або іншого агента, такого як озон. В одному варіанті втілення винаходу, стійкість до окисного стресу підвищують таким чином, щоб активність рослини, пов’язана з фотосинтезом, не знижувалася під дією окисного стресу або була менш піддана його впливу. Активність, пов’язану з фотосинтезом, можна визначити способами, добре відомими з рівня техніки, наприклад, шляхом вимірювання переносення електронів через фотосистеми I і/або II (наприклад, Peterson and Arntzen, 1982; Allen and Holmes, 1986). В іншому варіанті здійснення винаходу, ріст, розвиток, цвітіння або врожайність рослини не схильні, або 4 UA 102507 C2 5 10 менш схильні, до шкідливого впливу окисного стресу, якщо рослину піддавали контакту з дикамбою, 3,6-DCSA або іншим продуктом DMO-опосередкованого метаболізму дикамби. Ще в одному варіанті втілення винаходу ефект окисного стресу, що викликає омертвіння, знижується. У конкретних варіантах втілення винаходу, рослину, оброблену відповідно до даного винаходу, можна визначити як вирощувану на рослинницькій ділянці. Під “рослинницькою ділянкою” мається на увазі середовище вирощування, у якому сільськогосподарську рослину звичайно вирощують у полі у виробничих цілях, включаючи виробництво насіння, на відміну від лабораторної теплиці. В інших варіантах втілення винаходу, популяцію рослин можна визначити як вирощувану на рослинницькій ділянці та оброблену відповідно до даного винаходу. Рослина, оброблена відповідно до даного винаходу, може являти собою незрілу рослину, що знаходиться в стадії вегетативного росту, і чутливу до захворювань або пресу бур’янів, таку як соя в стадії росту VE до V3-V4. Рослина також може знаходитися в більш пізній стадії росту. Хімічна структура 3,6-DCSA являє собою наступну (I): 15 20 25 30 35 40 45 50 Аналог 3,6-DCSA можна визначити, наприклад, як заміщену бензойну кислоту і її біологічно прийнятні солі, де заміщення в бензойній кислоті може включати моно-, ди-, три-, або тетразаміщення в 3-, 4-, 5- і/або 6-положеннях. Замісники можуть бути вибрані, наприклад, із таких: нижчі алкільні групи, що включають від 1 до 4 атомів вуглецю; галогени фтор, хлор, бром або йод; аміногрупа, де атом азоту може нести 0, 1 або 2 однакові або такі, які відрізняються одна від одної, нижчі алкільні групи, що включають від 1 до 4 атомів вуглецю кожна; нітрогрупа; формільна група; ацетильна група; гідроксиметильна група; метоксикарбонільна група; гідроксильна група; алкілтіо-, алкілсульфокси або алкілсульфонільна група, де алкільна група складається з 1-4 атомів вуглецю, або моно-, ди- або трифторметильна група. Біологічно прийнятні солі включають солі зі звичайними лужними металами натрієм і калієм, лужноземельними металами магнієм або кальцієм, цинком або амонієм, або простими алкіламонієвими катіонами, такими як моно-, ди-, три- або тетраметиламонієві катіони. Продукт DMO-опосередкованого метаболізму може бути кон’югований із глюкозидом, який може бути гідролізований назад до аглікону, для модуляції, наприклад, пролонгування, корисної для здоров’я дії. У деяких варіантах втілення винаходу, передбачається кон’югація з цукром, таким як, серед інших, глюкоза, галактоза або маноза. В інших варіантах втілення винаходу, передбачається кон’югація з амінокислотою (необмежуючі приклади якої включають аланін, лейцин, аспартат або глутамат). У наступному аспекті, застосування або присутність дикамби або 3,6-DCSA, або іншого продукту DMO-опосередкованого метаболізму надає рослині властивість підвищеної врожайності, у порівнянні з врожайністю рослини такого ж генотипу, яка не контактувала з дикамбою або 3,6-DCSA, або іншим продуктом DMO-опосередкованого метаболізму, але вирощувалася в таких самих умовах. У деяких варіантах втілення винаходу, рослина може являти собою, серед іншого, рослину сої, бавовнику, ріпаку або кукурудзи. В іншому аспекті, рослина може контактувати молекулою не-гербіцидного попередника, яка перетворюється в SAR-індукуючий метаболіт в організмі рослини. У деяких варіантах втілення винаходу, рослина може включати трансген DMO, і одержуваний у результаті кодований DMO може перетворювати молекулу попередника в SAR-індукуючий метаболіт. У конкретних варіантах втілення винаходу, 2-метокси,3,5-дихлорбензойна кислота або 2-метокси,3-хлор бензойна кислота можуть бути нанесені на рослину і перетворені за допомогою DMO у 3,5DCSA або 3-CSA, відповідно, з одержанням будь-якої однієї або декількох наступних переваг: поліпшення здоров’я рослини, підвищена опірність рослини хворобам, підвищена стійкість рослини до окисного стресу і/або підвищення агрономічної врожайності рослини. Способи за даним винаходом можна використовувати, в одному варіанті втілення винаходу, у зв’язку з дводольними (dicot) сільськогосподарськими культурними рослинами. Необмежуючі приклади таких дводольних рослин включають люцерну, боби, буряк, броколі, капусту, канолу, моркву, цвітну капусту, селеру, китайську капусту, бавовник, огірок, баклажан, латук, диню, 5 UA 102507 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 горох, перець, земляний горіх, картоплю, гарбуз звичайний, редьку, ріпак, шпинат, сою, гарбуз великоплідний столовий, цукровий буряк, соняшник, помідор і кавун звичайний. У деяких варіантах втілення винаходу, дводольна рослина являє собою сою, бавовник або ріпак. В інших варіантах втілення винаходу, способи за даним винаходом можна використовувати у зв’язку з однодольними сільськогосподарськими культурними рослинами, включаючи, але не обмежуючись цим, ячмінь, кукурудзу, цибулю-порей, цибулю, рис, сорго, цукрову кукурудзу, пшеницю, жито, просо, цукрову тростину, овес, тритикале, просо прутоподібне і газонну траву. Умови біотичного та абіотичного стресу для сільськогосподарських культур можуть включати, наприклад, засуху, тінь, грибкове захворювання, вірусне захворювання, бактеріальне захворювання, нашестя комах-шкідників, нематодну інвазію, нашестя бур’янів, вплив холодних температур, вплив жари, осмотичний стрес, окисний стрес, знижену кількість азоту в поживних речовинах, знижену кількість фосфору в поживних речовинах і високу густоту рослин. Такі умови можуть бути несприятливими для рослини, які шкідливо впливають на метаболізм, ріст і/або розвиток рослини. Способи за даним винаходом можна використовувати для контролю, або профілактики лікування широкого ряду хвороб рослин. Способи за даним винаходом включають профілактичне інгібування і терапевтичне лікування інфекції, що викликана патогенними для рослин організмами. Патогени рослин можна класифікувати за їхнім життєвим циклом стосовно рослини-хазяїна, такі класифікації включають облігатних паразитів, факультативних паразитів і факультативних сапрофітів. Облігатні паразити можуть виживати і розмножуватися тільки при одержанні харчування з живих рослинних клітин, і знаходяться в безпосередньому контакті з цими клітинами, приклади облігатних грибкових паразитів рослин включають, але не обмежуються цим, члени з Uredinales (іржасті гриби), Ustilaginales (сажкові гриби), Erysiphales (збудники справжньої борошнистої роси) і Oomycetes (збудники водяної плісняви і несправжньої борошнистої роси). Факультативні паразити являють собою організми, що, в основному, виживають як сапрофіти на продуктах інших організмів або мертвих організмів, але можуть стати паразитичними при сприятливих умовах. Факультативні сапрофіти являють собою організми, що, як правило, виживають як паразити рослин, але можуть виживати як сапрофіти за відсутності сприйнятливої рослини-хазяїна. Спосіб за даним винаходом можна використовувати для контролю, або профілактики лікування інфекції, що викликана широким рядом патогенів рослин, які включають облігатних паразитів, факультативних паразитів і факультативних сапрофітів, що включають, але не обмежуються цим, таких: гриби аскоміцети, такі як з роду Venturia, Podosphaera, Erysiphe, Monilinia, Mycosphaerella і Uncinula; гриби базидіоміцети, такі як із роду Hemileia, Rhizoctonia і Puccinia; Fungi imperfecti, такі як з роду Botrytis, Helminthosporium, Rhynchosporiurn, Fusarium (тобто F. monoliforme), Septoria, Cercospora, Alternaria, Pyricularia, Pseudocercosporella (тобто P. herpotrichoides) і Verticilliυm; гриби ооміцети, такі як роду Phytophthora (тобто P. parasitica. P. medicaginis. P. megasperma), Peronospora (тобто P. tabacina), Bremia, Pythium і Plasmopara; а також інші гриби, такі як Scleropthora macrospora, Sclerophthora rayissiae, Sclerospora graminicola, Peronosclerospora sorghi, Peronosclerospora philippinensis, Peronosclerospora sacchari і Peronosclerospora maydis, Physopella zeae, Cercospora zeae-maydis, Colletotrichum graminicola, Gibberella zeae, Exserohilum turcicum, Kabatiella zeue і Bipolaris maydis, можуть викликати захворювання, яке контролюють, запобігають або лікують способами за даним винаходом. Особливо переважні патогени включають, але не обмежуються цим: Puccinia, Rhizoctonia, GGT (Gaeumannomyces graminis var. tritici), жовту іржу злаків, Phakopsora sp. включаючи P. pachyrhizi (що викликає азіатську іржу сої), види Fusarium, види Verlicillium, такі як V. dahliae, Cercospora zeae-maydis (що викликає сіру плямистість листів), види Phytophthora та іржу кукурудзи. Таким чином, хвороби, які контролюють, запобігають або лікують включають, наприклад, хвороби рослин люцерни, такі як коренева гниль (Phytophora medicaginis, P. megasperma); рослин рису, такі як пірикуляріоз рису (Pyricularia oryzae), плямистість листя (Helminthosporhim oryzae, Cochliobolus miyabeanus), що викликана грибом Helminthosporium, хвороба Bakanae (Gibberella fujikuroi), загнивання паростків (Rhizopus oryzae), гниль листової піхви (Rhizoctonia solani) і т.д.; хвороби вівса, такі як корончата іржа (Puccinia coronata) і т.д.; хвороби ячменя, такі як справжня борошниста роса (Erysiphe graminis), опік (Rhynchosporium secalis), плямистість (Cochliobolus sativus), жовта плямистість листя (Helminthosporium grаmineum, Pyrenophora grаmineum), сітчаста плямистість (Pyrenophora teres), тверда сажка (Tilletia caries), летюча сажка (Ustilago nuda) і т.д.; хвороби пшениці, такі як справжня борошниста роса (Erysiphe graminis), утворення лусочок – плямистість (Leptosphaeria nodorum, Septoria nodorum), жовта іржа (Puccinia striiformis), сніжна гниль (Typhula incarnata), яку викликає Typhula, очкова плямистість (Pseudocercosporella herpotrichoides), сніжна пліснява (Calonectria graminicola, Fusarium nivale), 6 UA 102507 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 стеблова іржа (Puccinia graminis), чорна гниль (Typhula ishikariensis), парша (Gibberella zeae), листова іржа (Puccinia recondita, Puccinia triticina), смугастість (Helminthosporium grаmineum), тверда сажка (Tilletia caries), точкова плямистість листів (Septoria tritici), летюча сажка (Ustilago tritici) і т.д.; хвороби газонної трави, такі як сіра плямистість листів (Pyricularia grisea) і т.д.; хвороби кукурудзи, такі як іржа кукурудзи, випрівання (Pythium debaryanum) і т.д.; хвороби жита, такі як пурпурна сніжна пліснява (Fusarium nivale) і т.д.; хвороби бавовнику, такі як кільчасте в’янення (V. dahliae), хвороба паростків (Pythium ultimum, Colletotrichum gossypii, Pythium sp.; Rhizoctonia solani, Thielaviopsis sp.), бактеріальна гниль (X. campestris pv. malvacearum) і т.д.; хвороби картоплі, такі як фітофтороз (Phytophthora infestans) і т.д.; хвороби рослин тютюну, такі як несправжня борошниста роса (Peronosporf tabacina), прикоренева гниль (Phytophthora parasitica var), захворювання септорія (Cercospora nicotianae) і т.д.: хвороби цукрового буряка, такі як плямистість листя (Cercospora beticola), випрівання (Pythium debaryanum, Rhizoctonia solani, Pythium aphanidermatum) і т.д.; хвороби перцю овочевого солодкого, такі як сіра пліснява (Botrytis cinerea) і т.д., хвороби квасолі звичайної, такі як сіра пліснява (Botrytis cinerea), гниль насіння (склеротіальне гниття; Sclerotinia sclerotiorum), яке викликане Sclerotinia, очковая плямистість (Corticium rolfsii) і т.д.; хвороби бобів, такі як справжня борошниста роса (Erysiphe polygoni, Sphaerotheca fuliginea), іржа (Uromyces fabae, Uromyces phaseoli), сіра пліснява (Botrytis cinerea) і т.д.; хвороби земляного горіха, такі як охряна зональна плямистість (Mycosphaerella arachidicola) і т.д.; хвороби капусти, такі як мокра гниль (Rhizoctonia solani) і т.д.; хвороби огірка, такі як справжня борошниста роса (Sphaerotheca fuliginea), стеблова гниль (Fusarium oxysporum), клейка стеблова гниль (Mycosphaerella melonis), несправжня борошниста роса (Pseudoperonospora cubensis), сіра пліснява (Botrytis cinerea), склеротіальна гниль насіння (Sclerotinia sclerotiorum), антракноз (Colletotrichum lagenarium), мокра гниль (Fusarium oxysporum, Pythium aphanidermatum, Rhizoctonia solani) і т.д.; хвороби Komatsuna (тобто Brassica rapa var.), такі як викликана Alternaria темна плямистість (Ahernaria brassicicola), кила хрестоцвітих (Plasmodiophora brassicae) і т.д.; хвороби селери, такі як точкова плямистість листів (Septoria apii) і т.д.; хвороби редьки, такі як жовтозілля (Fusarium oxysporum) і т.д., хвороби помідора, такі як фузаріозне в’янення (Fusarium oxysporum), прикоренева гниль (Phytophthora infestans), кільцева плямистість листів (Alternaria solani), сіра пліснява (Botrytis cinerea), плямистість листів (Phytophthora capsici), чорна гниль (Alternaria tomato) і т.д.; хвороби баклажана, такі як коричнева гниль (Phytophthora capsici), патогени, що викликають фузаріозне в’янення, наприклад, кільчасте в’янення (Verticillium albo-atrum. V. dahliae) і т.д., хвороби китайської капусти, такі як чорна гниль (Alternaria japonica), кила хрестоцвітих (Plasmodiophora brassicae) і т.д.; хвороби солодкого перцю, такі як прикоренева гниль (Phylophthora capsici), сіра пліснява (Botrytis cinerea) і т.д.; хвороби латуку, такі як сіра пліснява (Botrytis cinerea) і т.д., хвороби плодів цитрусових, такі як гниль шкірки і стебла (Diaporthe citri) і т.д., хвороби груш, такі як парша (Venturia nashicola), чорна гниль (Alternaria kikuchiana), японська іржа груш (Gymnosporangium haraeanum), коричнева плямистість (збудник Stemphylium vesicarium) і т.д.; хвороби винограду, такі як несправжня борошниста роса (Plasmopara viticola), сіра пліснява (Botrytis cinerea), парша (Elsinoe ampelina), що гниє, і т.д.; хвороби персика, такі як кучерявість листя (Taphrina deformans), парша (Cladosporium carpophilum), листова плямистість, що утворює пустоти (Mycosphaerella cerasella) і т.д., хвороби яблунь, такі як справжня борошниста роса (Podosphaera leucotricha), парша (Venturia inaequalis), сіра пліснява (Botrytis cinerea), чорна гниль (Botryosphaeria obtusa), коричнева плямистість (Gymnosporangium yamadae), біла коренева гниль (Rosellinia necatrix), плямистість листів (Alternaria mali), що викликана Alternaria, і т.д.; та інші хвороби зернових, плодових і овочевих культур, таких як олійний ріпак, соняшник, морква, перець, суниця, диня, плід ківі, цибуля, цибуля-порей, солодка картопля, інжир, ume, спаржа, хурма, соя, квасоля променева, кавун звичайний, crown daisy, шпинат, чай і т.д. Також включені хвороби, які викликають віруси, бактерії і нематоди, такі як, серед іншого, вірусні мозаїчні хвороби (наприклад, які викликані вірусом мозаїки тютюну, вірусом мозаїки сої, вірусом мозаїки люцерни або вірусом мозаїки огірка), які викликані вірусом карликовості сої і вірусом крапчастості бобових стручків; хвороби, які викликані бактеріями, включаючи, серед іншого, Pseudomonas syringae pvs., наприклад, P. syringae pv. glycinea, P. syringae pv. coronafaciens; Xanthomonas campestris pvs., наприклад, X. campestris pv. glycines; Xanthomonas oryzae; Xanthomonas translucens; Xanthomonas axonopodis pv. malvacearum (бактеріальна гниль бавовнику); Eiwinia spp. і включаючи Pantoea spp.; і Clavibacter spp., а також хвороби, які викликані нематодами, такими як, серед іншого, Meloidogyne incognita, Pratylenchus penetrans, Xiphinema sp. і Heterodera sp. В одному варіанті втілення винаходу, біотичний стрес для сільськогосподарської культури являє собою іржастий гриб (Basidiomycete). Деякі іржасті хвороби рослин, що мають важливе 7 UA 102507 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 значення для сільського господарства, включають, без обмеження, хвороби, які викликані Puccinia sp., такі як іржа зернових, збудником якої є Puccinia coronata, Puccinia graminis, Puccinia striiformis, Puccinia sorghi, Puccinia polysora і P. recondita; іржа, збудником якої є Gymnosporangium sp.; сірянка сосни веймутової, збудником якої є Cronartium ribicola; кавова іржа, збудником якої є Hemileia vastatrix; та іржасті хвороби, збудником яких є Uromyces sp. У конкретному варіанті втілення винаходу, сільськогосподарська культура являє собою сою, і біотичним стресом для сільськогосподарської культури є іржа сої, збудником якої є Phakopsora sp. У деяких аспектах даного винаходу, дикамбу або 3,6-DCSA можна забезпечувати або наносити на рослину окремо або в сполученні з іншим гербіцидом або іншим активним інгредієнтом. Нанесення іншого гербіциду можна здійснювати до, одночасно або після нанесення дикамби, 3,6-DCSA або іншого продукту DMO-опосередкованого метаболізму дикамби. “Нанесення на рослину” також може включати нанесення дикамби, 3,6-DCSA або іншого продукту DMO-опосередкованого метаболізму дикамби на насіння. “Здоров’я” насіння можна вимірювати, наприклад, на підставі відсотка проростання, часу проростання, стійкості паростків до хвороб або стресів, потужності паростків або за одержаним врожаєм на корені. Одержання таких композицій для використання в зв’язку з даним винаходом буде очевидно фахівцям у даній галузі у світлі даного розкриття. Ці композиції типово включають, на додаток до активного інгредієнта, такі компоненти, як поверхнево-активні речовини, тверді або рідкі носії, розчинники і зв’язуючі. Приклади поверхнево-активних речовин, які можна використовувати для нанесення на рослини, включають солі лужних металів, лужноземельних металів або амонієві солі ароматичних сульфонових кислот, наприклад, лігно-, фенол-, нафталін- і дибутилнафталінсульфонової кислоти, і жирних кислот арилсульфонатів, алкілових ефірів, лаурилових ефірів, сульфатів жирних спиртів і сульфатів гліколевих ефірів жирних спиртів, конденсати сульфірованого нафталіну і його похідних із формальдегідом, конденсати нафталіну або нафталінсульфонових кислот із фенолом і формальдегідом, конденсати або фенолу фенолсульфонової кислоти з формальдегідом, конденсати фенолу з формальдегідом і сульфітом натрію, поліоксіетиленоктилфеніловий ефір, етоксилований ізооктил-, октил- або нонілфенол, трибутилфенілполігліколевий ефір, поліалкіларилові спирто-ефірні суміші, ізотридециловий спирт, етоксиловану рицинову олію, етоксиловані триарилфеноли, солі фосфатованих триарилфенолетоксилатів, поліглікольефіраацетат лаурилового спирту, складні ефіри сорбіту, відпрацьовані розчини сульфіту або метилцелюлози, або суміші таких речовин. Звичайно, у випадку використання поверхнево-активної речовини, її кількість складає від близько 0,25% до 1,0% мас. і, в основному, від близько 0,25% до 0,5% мас. В одному варіанті втілення винаходу, дикамбу можна забезпечувати в сполученні з гліфосатом. Вислів “у сполученні з”має на увазі, що дикамбу можна наносити одночасно або до або після гліфосату. Завдяки синергізму, цей варіант втілення можна використовувати для зменшення кількостей будь-якого з цих гербіцидів із досягненням такого самого рівня активності, що дає застосування тільки одного з цих гербіцидів. Наприклад, даний винахід може включати нанесення менше ніж 1x норми гліфосату і/або дикамби щодо стандартної норми, зазначеної виробником. Приклади відповідних норм застосування гліфосату і дикамби включають, крім 1x норм, від близько 0,25x-0,95x кожного гербіциду, конкретно включаючи близько 0,5x, 0,6x, 0,7x, 0,8x, 0,85x, 0,9x і 0,95x кожного гербіциду і всі комбінації їхніх похідних, а також вищі норми, такі як 0,97x і 0,99x. У деяких варіантах втілення, що стосуються здоров’я рослин, може бути бажаним використання індивідуальних нанесень дикамби в цих кількостях. Альтернативно, можна використовувати 1x і вищі норми застосування, у світлі того, що було виявлено, що навіть високі норми застосування дикамби не заподіюють істотної шкоди рослинам, що містять DMO трансген. Норми застосування 1x встановлені виробником комерційно доступної гербіцидної композиції і відомі фахівцям у даній галузі. Наприклад, етикетка для Fallow Master™, суміші гліфосату і дикамби зі співвідношенням гліфосат:дикамба близько 2:1, рекомендує норми застосування від близько 451 г/га (311 ао г/га гліфосату:140 ао г/га дикамби) до 621 ао г/га (428 ао г/га гліфосату:193 ао г/га дикамби), залежно від видів бур’янів і висоти бур’янів. Гліфосат також можна застосовувати в сполученні з 3,6-DCSA. Сприятливі ефекти для здоров’я рослин можна одержати за допомогою контактування рослин або частин рослин із дикамбою шляхом використання дикамби для боротьби з бур’янами. Або можна забезпечувати не-гербіцидну норму дикамби для сільськогосподарської культури, що, проте, призводить до сприятливих для здоров’я ефектів. Дикамбу або 3,6-DCSA, або аналог 3,6-DCSA, або її продукт, який може бути утворений через DMO-опосередкований метаболізм дикамби, можна застосовувати поза межами типового 8 UA 102507 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 вікна застосування для боротьби з бур’янами, наприклад, варіюючи час нанесення, стадію росту сільськогосподарської культури і/або бур’янів або норму застосування, відповідно до тих знань, які мають фахівці в даній галузі. Рослина, ідентифікована як та, що потребує поліпшення здоров’я, може являти собою незрілу рослину в стадії вегетативного росту і чутливу до захворювань або до росту бур’янів, таку як рослина сої в стадії росту VE до V3 або V4. Рослина сої також може бути в пост-V4 стадії росту. Рослина також може являти собою рослину кукурудзи в стадії росту до або такій як VE-V3, V7, V10, V15 або VT. Рослина кукурудзи також може бути в пост-вегетативній стадії росту. Рослина також може являти собою рослину бавовнику в стадії вегетативного росту, такій як до цвітіння, включаючи наприклад, до стадії або на стадії росту появи паростків, першого справжнього листа, першого вегетативного бічного пагона, першої плодоносної гілки або утворення 1 коробочки (плодової бруньки). Рослина бавовнику також може бути в такій стадії росту як цвітіння або розвиток насінної коробочки. Стадія росту рослини також може визначатися по днях після посадки. “Дикамба” стосується 3,6-дихлор-o-анісової кислоти або 3,6-дихлор-2-метоксибензойної кислоти, та її кислот і солей. Її солі включають ізопропіламінові, диглікоамінові, диметиламінові, калієві і натрієві солі. Приклади комерційних композицій дикамби включають, без обмеження, Banvel™ (у вигляді DMA солі), Clarity® (у вигляді DGA солі), VEL-58-CS-11™ і Vanquish™ (у вигляді DGA солі, BASF). “Гліфосат” стосується N-фосфонометилгліцину і його солей. Гліфосат є комерційно доступним у різних композиціях. Приклади таких композицій гліфосату включають, без обмеження, композиції, що продає Monsanto Company як гербіциди ROUNDUP®, ROUNDUP® ULTRA, ROUNDUP® ULTRAMAX, ROUNDUP® CT, ROUNDUP® EXTRA, ROUNDUP® BIACTIVE, ROUNDUP® BIOFORCE5, RODEO®, POLARIS®, SPARK® і ACCORD®, усі з яких містять гліфосат у вигляді його ізопропіламонієвої солі, ROUNDUP® WEATHERMAX, що містить гліфосат у вигляді його калієвої солі; гербіциди ROUNDUP® DRY і RIVAL®, які містять гліфосат у вигляді його амонієвої солі; ROUNDUP® GEOFORCE, який містить гліфосат у вигляді його натрієвої солі; і гербіцид TOUCHDOWN®, який містить гліфосат у вигляді його триметилсульфонієвої солі. У деяких варіантах втілення, даний винахід може стосуватися використання трансгена DMO. В одному аспекті даного винаходу, DMO може кодуватися послідовністю нуклеїнових кислот, вибраною з групи, що складається з: a) послідовності нуклеїнових кислот, що кодує поліпептид SEQ ID NO:1;b) послідовності нуклеїнових кислот, що включає послідовність SEQ ID N0:2; і c) послідовності нуклеїнових кислот, що кодує поліпептид із щонайменше 90% ідентичністю послідовності з поліпептидом SEQ ID NO: 1, де зазначений поліпептид має активність дикамбамонооксигенази і включає цистеїн у положенні, що відповідає амінокислоті 112 у SEQ ID NO:1. В іншому аспекті, послідовність нуклеїнових кислот може кодувати поліпептид із щонайменше 90% ідентичністю послідовності з поліпептидом SEQ ID NO:1, який має активність дикамбамонооксигенази і включає триптофан у положенні, що відповідає амінокислоті 112 у SEQ ID NO: 1. У таких варіантах втілення, може забезпечуватися ДНК вектор, що включає DMOкодуючу нуклеїнову кислоту, описану в даній заявці, функціонально зв’язаний із промотором. Промотор може бути функціональним у рослинній клітині. У деяких варіантах втілення винаходу, послідовність нуклеїнових кислот, що кодує дикамбамонооксигеназу, може бути функціонально зв’язаною з хлоропласт-перехідним пептидом (CTP). В інших варіантах втілення даний винахід може стосуватися використання трансгена, який надає толерантність до гліфосату, такого як CP4 EPSPS. Послідовність такого гена можна знайти, наприклад, у патенті США RE39247, який включений у дану заявку за допомогою посилання. DMO, що мають здатність до розкладання дикамби, а також гени резистентності до гліфосату або інших гербіцидів, можна легко одержати та аналізувати їхню активність відповідно до стандартних способів. Такі послідовності також можна ідентифікувати способами, відомими з рівня техніки, наприклад, із придатних організмів, включаючи бактерії, що розкладають гербіциди (Патент США № 5445962; Cork and Krueger, 1991; Cork and Khalil, 1995). Один спосіб виділення DMO або іншої послідовності являє собою спосіб шляхом гібридизації нуклеїнових кислот, наприклад, із використанням бібліотеки, сконструйованої з організмуджерела, або за допомогою RT-PCR із використанням мРНК з організму-джерела і праймерів на основі послідовностей, що розкриваються. Даний винахід тому охоплює використання нуклеїнових кислот, які гібридизуються в жорстких умовах із DMO, що кодує послідовність, описану в даній заявці. Фахівцям у даній галузі зрозуміло, що умови можуть бути менш жорсткими шляхом збільшення концентрації солі і зниження температури. Таким чином, умовами гібридизації можна легко маніпулювати, і, як правило, це питання вибору в залежності від бажаних результатів. Прикладом умов високої жорсткості є такі умови: 5X SSC, 50% формаміду і 42C. Шляхом проведення промивання в таких умовах, наприклад, протягом 10 9 UA 102507 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 хвилин, можна видалити ті послідовності, які не гібридизувались із конкретною цільовою послідовністю в цих умовах. Варіанти також можна синтезувати хімічним шляхом, наприклад, із використанням відомих полінуклеотидних послідовностей DMO, відповідно до способів, добре відомих із рівня техніки. Наприклад, послідовності ДНК можна синтезувати методом фосфорамідитної хімії в автоматичному ДНК синтезаторі. Хімічний синтез має ряд переваг. Зокрема, хімічний синтез є бажаним, оскільки кодони, переважні для хазяїна, у яких буде експресуватися послідовність ДНК, можна використовувати для оптимізації експресії. Не усі з кодонів мають потребу в зміні для одержання поліпшеної експресії, але переважно щонайменше ті кодони, які рідко використовуються в організмі хазяїна, заміняють на переважні для хазяїна кодони. Високі рівні експресії можна одержати шляхом заміни кодонів на переважні для хазяїна кодони. Кодонові переваги багатьох клітин-хазяїнів відомі (PCT WO 97/31115; PCT WO 97/11086; EP 646643; EP 553494; і Патенти США №№: 5689052; 5567862; 5567600; 5552299 і 5017692). Кодонові переваги інших клітин-хазяїнів можна вивести за допомогою способів, відомих із рівня техніки. Також, із використанням хімічного синтезу послідовність молекули ДНК або кодованого нею білка легко можна змінити, щоб наприклад, оптимізувати експресію (наприклад, виключити вторинні структури мРНК, які втручаються в транскрипцію або трансляцію), додати унікальні сайти рестрикції в зручних точках і здійснити делецію сайтів розщеплення протеазою. Можна здійснити модифікацію і зміни послідовності поліпептиду білка, наприклад, послідовностей DMO, представлених у даній заявці, зі збереженням при цьому ферментативної активності. Далі випливає обговорення, що стосується змін амінокислот білка для створення еквівалентного або навіть поліпшеного, модифікованого поліпептиду і відповідних кодуючих послідовностей. Відомо, наприклад, що можна заміщати деякі амінокислоти в структурі білка іншими амінокислотами без помітної втрати здатності до інтерактивного зв’язування зі структурами, такими як сайти зв’язування в молекулах субстрату. Оскільки саме інтерактивна здатність і природа білка визначає таку біологічну функціональну активність білка, можна здійснити деякі заміщення амінокислотних послідовностей у послідовності білка і, звичайно, у кодуючій послідовності ДНК, що лежить у його основі, з одержанням, проте, білка з подібними властивостями. Таким чином, передбачається, що є можливим здійснення різних змін у послідовностях пептидів DMO, описаних у даній заявці, або інших гербіцидо-стійких поліпептидів і відповідних кодуючих послідовностях ДНК без помітної втрати їхньої біологічної корисності або активності. При здійсненні змін варто враховувати індекс гідрофобності амінокислот. Важливе значення індексу гідрофобності амінокислот у наданні білку інтерактивної біологічної функції є загальновизнаним у даній галузі техніки (Kyte et al, 1982). Загальновизнано, що відносний гідрофобний характер амінокислоти вносить свій внесок у вторинну структуру утвореного білка, що, у свою чергу, визначає взаємодію цього білка з іншими молекулами, наприклад, ферментами, субстратами, рецепторами, ДНК, антитілами, антигенами і подібними. Кожна амінокислота має присвоєний їй індекс гідрофобності на підставі гідрофобності і характеристик заряду амінокислот (Kyte et al, 1982), наприклад: ізолейцин (+4,5); валін (+4,2); лейцин (+3,8); фенілаланін (+2,8); цистеїн/цистин (+2,5); метіонін (+1,9); аланін (+1,8); гліцин (0,4); треонін ( 0,7); серин (0,8); триптофан (0,9); тирозин (1,3); пролін (1,6); гістидин (3,2); глутамат (3,5); глутамін (3,5); аспартат (3,5); аспарагін (3,5); лізин (3,9); і аргінін (4,5). Із галузі техніки відомо, що амінокислоти можуть бути заміщені іншими амінокислотами, що мають подібний індекс або показник гідрофобності, і при цьому в результаті одержують білок з аналогічною біологічною активністю, тобто одержують при цьому еквівалентний із погляду його біологічної функції білок. При здійсненні таких змін, заміщення амінокислот, гідрофобні індекси яких знаходяться в межах 2, є переважними, гідрофобні індекси яких знаходяться в межах 1, є особливо переважними, і гідрофобні індекси яких знаходяться в межах 0,5, є ще більш переважними. Із галузі техніки також відомо, що заміщення схожих амінокислот можна ефективним чином здійснювати на підставі гідрофільності. Патент США № 4554101 вказує, що найбільша локальна середня гідрофільність білка, обумовлена гідрофільністю його суміжних амінокислот, співвідноситься з біологічною властивістю цього білка. Як це детально описано в Патенті США № 4554101, амінокислотним залишкам були присвоєні такі показники гідрофільності: аргінін (+3,0); лізин (+3,0); аспартат (+3,01); глутамат (+3,01); серин (+0,3); аспарагін (+0,2); глутамін (+0,2); гліцин (0); треонін (0,4); пролін (0,51); аланін (0,5); гістидин (0,5); цистеїн (1,0); метіонін (1,3); валін (1,5); лейцин (1,8); ізолейцин (1,8); тирозин (2,3); фенілаланін (2,5); триптофан (3,4). Повинно бути зрозумілим, що одна амінокислота може заміщати іншу амінокислоту, що має близький показник гідрофільності, і при цьому можна одержувати 10 UA 102507 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 біологічно еквівалентний білок. При таких змінах заміщення амінокислот, показники гідрофільності яких знаходяться в межах 2, є переважним, показники гідрофільності яких знаходяться в межах 1, є особливо переважним, і показники гідрофільності яких знаходяться в межах 0,5, є ще більш переважним. Приклади заміщень, з урахуванням зазначених вище характеристик, добре відомі фахівцям у даній галузі і включають: аргінін і лізин; глутамат і аспартат; серин і треонін; глутамін і аспарагін; і валін, лейцин і ізолейцин. Можна здійснювати експресію ДНК конструкції, що включає послідовність CTP, функціонально пов’язану з послідовністю DMO, у досліджуваній системі, такій як протопласти, транзиторно або стабільно трансформовані рослинні клітини, шляхом функціонального зв’язування їх із промотором, функціональним у рослинах. Приклади, що описують такі промотори, включають Патент США № 6437217 (промотор RS81 кукурудзи), Патент США № 5641876 (промотор актину рису; OsActl), Патент США № 6426446 (промотор RS324 кукурудзи), Патент США № 6429362 (промотор PR-I кукурудзи), Патент США № 6232526 (промотор A3 кукурудзи), Патент США № 6177611 (конститутивні промотори кукурудзи), Патенти США №№ 5322938, 5352605, 5359142 і 5530196 (промотор 35S), Патент США № 6433252 (промотор олеозину L3 кукурудзи), Патент США № 6429357 (промотор актину 2 риси, а також інтрон 2 рису), Патент США № 5837848 (корінь-специфічний промотор), Патент США № 6294714 (світлоіндуковані промотори), Патент США № 6140078 (соль-індуковані промотори), Патент США № 6252138 (патоген-індуковані промотори), Патент США № 6175060 (індуковані дефіцитом фосфору промотори), Патент США № 6388170 (наприклад, PClSV промотор), PClSV промотор SEQ ID NO:41, Патент США № 6635806 (промотор гамма-коіксину) і Патент США № 7151204 (промотор альдолази хлоропласта кукурудзи). Додаткові промотори, які можуть бути корисними, включають промотор нопалінсинтази (NOS) (Ebert et al, 1987), промотор октопінсинтази (OCS) 2007/081527 (який переноситься на пухлино-індукуючих плазмідах Agrobacterium tumefaciens), колімовірусні промотори, такі як промотор вірусу мозаїки цвітної капусти (CaMV) 19S (Lawton et al, 1987), промотор CaMV 35S (Odell et al, 1985), промотор вірусу мозаїки ранника шишкуватого 35S (Walker et al, 1987), промотор сахарозасинтази (Yang et al, 1990), промотор генного комплексу R (Chandler et al, 1989) і промотор гена хлорофіл a/b-зв’язуючого білка і т.д.. У даному винаході особливо корисними можуть бути такі промотори, як CaMV35S з енхансерними послідовностями (e35S; Патенти США №№ 5322938; 5,352,605; 5359142; і 5530196), FMV35S (Патенти США №№ 6051753; 5378619), колімовірусної хлорозної смугастості земляного горіха (PClSV; Патент США № 5850019), At.Act 7 (Accession # U27811), AtANT1 (Патентна заявка США № 20060236420), FMV.35S-EF1a (Патентна заявка США № 20050022261), eIF4A10 (Accession # X79008) і AGRtu.nos (GenBank Accession V00087; Depicker et al, 1982; Bevan et al, 1983), цитозольної триозафосфатізомерази рису (OsTPI; Патент США № No. 7132528) і гена 15 актину рису (OsActl5; Патентна заявка США № 2006-0162010). 5 UTR, який функціонує як трансльована лідерна послідовність, являє собою генетичний елемент ДНК, розташований між послідовністю промотору гена і кодуючою послідовністю, може бути включений між промотором і CTP-DMO послідовністю. Трансльована лідерна послідовність присутня в цілком процесованій мРНК вверх від послідовності початку трансляції. Трансльована лідерна послідовність може впливати на процесинг первинного транскрипта до мРНК, стабільність мРНК або ефективність трансляції. Приклади трансляційних лідерних послідовностей включають, серед інших, лідерні послідовності білків теплового шоку кукурудзи і петунії (Патент США № No. 5362865), лідерні послідовності білків оболонки вірусів рослин, лідерні послідовності rubisco рослин, GmHsp (Патент США № 5659122), PhDna (Патент США № 5362865), AtAntl, TEV (Carrington and Freed, 1990) і AGRtunos (GenBank Accession V00087; Bevan et al, 1983). (Turner and Foster, 1995). У даному винаході 5 UTR, які можуть бути особливо корисними, включають GmHsp (Патент США № 5659122), PhDna (Патент США № 5362865), AtAntl, TEV (Carrington and Freed, 1990), OsActl (Патент США № 5641876), OsTPI (Патент США № No. 7132528), OsActl5 (Публікація США № 20060162010) і AGRtunos (GenBank Accession V00087; Bevan et al, 1983). 3 нетрансльована послідовність, 3 ділянка термінації транскрипції або ділянка поліаденілювання, означає молекулу ДНК, зв’язану з, і розташовану вниз від структурної полінуклеотидної молекули, і включає полінуклеотиди, які забезпечують сигнал поліаденілювання та інші регуляторні сигнали, здатні впливати на транскрипцію, процесинг мРНК або експресію генів. Функції сигналу поліаденілювання в рослинах полягають у тому, що він викликає приєднання поліаденілатнуклеотидів до 3 кінця попередника мРНК. Послідовність поліаденілювання може походити з природного гена, із різних генів рослин або із T-ДНК генів. Ці послідовності можуть бути включені вниз від послідовності CTP-DMO. Прикладом 3 ділянки термінації транскрипції є ділянка 3 нопалінсинтази (nos 3; Fraley et al, 1983). Було описане 11 UA 102507 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 використання різних 3 нетрансльованих ділянок (Ingelbrecht et al, 1989). Молекули поліаденілювання з гена Pisum sativum Rbc2 (Ps.Rbc2-E9; Coruzzi et al, 1984), AGRtu.nos (Genbank Accession E01312), E6 (Accession # U30508) і TaHsp17 (ген низькомолекулярного білка теплового шоку пшениці; Accession # X13431) можуть бути особливо корисними для використання в зв’язку з даним винаходом. Крім елементів експресії, описаних вище, може знадобитися інтрон, вбудований між промотором і 3 UTR, для експресії ділянки, що кодує, зокрема, в однодольних рослинах. “Інтрон” стосується полінуклеотидної молекули, яка може бути виділена або ідентифікована із вставної послідовності геномної копії гена, і може бути, у загальному вигляді, визначений як ділянка, вирізана в ході процесингу мРНК до трансляції. Альтернативно, інтрони можуть бути одержані синтетичним шляхом. Інтрони самі можуть містити суб-елементи, такі як цис-елементи або енхансерні домени, які впливають на транскрипцію функціонально пов’язаних генів. “Рослинний інтрон” являє собою інтрон природного або неприродного походження, що є функціональним у рослинних клітинах. Рослинний інтрон можна використовувати як регуляторний елемент для модуляції експресії функціонально зв’язаного гена або генів. Послідовність молекули полінуклеотиду в трансформаційній конструкції може включати інтрони. Інтрони можуть бути гетерологічними стосовно транскрибованої послідовності молекули полінуклеотиду. Приклади інтронів включають інтрон актину кукурудзи (Патент США № 5641876), інтрон HSP70 кукурудзи (ZmHSP70; Патент США № 5859347; Патент США № 5424412) та інтрон TPI рису (OsTPI; Патент США № No. 7132528) і є корисними для практичного здійснення даного винаходу. Відповідно до даного винаходу, можна використовувати будь-який із відомих із рівня техніки способів уведення трансгенних конструкцій у рослини (див., наприклад, Miki et al, 1993). Вважається, що придатні способи для трансформації рослин включають, власне кажучи, будьякий спосіб, за допомогою якого ДНК можна вводити в клітину, такий як шляхом електропорації, як проілюстровано в Патенті США №№. 5384253; мікропроекторного бомбардування, як проілюстровано в Патентах США №№ 5015580; 5550318; 5538880; 6,160,208; 6399861; і 6403865; Agrobacterium-опосередкованої трансформації, як проілюстровано в Патентах США №№ 5635055; 5824877; 5591616; 5981840; і 6384301; і трансформації протопласта, як проілюстровано в Патенті США №№ 5508184. За допомогою застосування таких способів, як зазначені вище, клітини практично будь-яких видів рослин можуть бути стабільно трансформовані, і ці клітини можуть розвиватися в трансгенні рослини. Способи, які можуть бути особливо корисними в контексті трансформації бавовнику, розкриті в Патентах США №№ 5846797, 5159135, 5004863 і 6624344. Способи для трансформації рослин Brassica, зокрема, розкриті, наприклад, у Патенті США № 5750871; і способи для трансформації сої розкриті, наприклад, у Zhang et al, 1999, Патенті США № 6384301 і Патенті США № 7002058. Способи для трансформації кукурудзи розкриті, наприклад, у WO9506722. Деякі необмежуючі приклади рослин, які можна використовувати у зв’язку з даним винаходом, включають люцерну, ячмінь, боби, буряк, броколі, капусту, моркву, канолу, цвітну капусту, селеру, китайську капусту, кукурудзу, бавовник, огірок, сухі боби, баклажан, фенхель, садові боби, гарбуз пляшковий, цибуля-порей, латук, диню, овес, окру, цибулю, горох, перець, гарбуз звичайний, земляний горіх, картоплю, гарбуз звичайний, редьку, рис, сорго, сою, шпинат, гарбуз великоплідний столовий, цукрову кукурудзу, цукровий буряк, соняшник, просо прутоподібне, помідор, кавун звичайний і пшеницю. Після здійснення доставки екзогенної ДНК у клітини реципієнта, наступні стадії в генеруванні трансгенних рослин, як правило, стосуються ідентифікації трансформованих клітин для подальшого культивування і регенерації рослини. Для поліпшення здатності ідентифікації трансформантів може знадобитися використання селективно обумовленого або обумовленого скринінгом маркерного гена з трансформуючим вектором, одержаним відповідно до даного винаходу. У цьому випадку, як правило, здійснюють оцінку потенційно трансформованої клітинної популяції, піддаючи клітини впливу селективного агента або агентів, або здійснюють скринінг клітин на бажані ознаки маркерного гена. Клітини, які виживають після впливу на них селективного агента, або клітини, які були оцінені як позитивні в скринінговому аналізі, можна культивувати в середовищі, яке підтримує регенерацію рослин. Будь-яке придатне середовище для культивування рослинної тканини, наприклад, середовище MS або N6 (Murashige і Skoog, 1962; Chu et al, 1975), може бути модифіковане шляхом включення додаткових речовин, таких як регулятори росту. Тканину можна підтримувати на основному середовищі з регуляторами росту доти, поки не буде одержана достатня кількість тканини, щоб почати роботу з регенерації рослини, або після повторних раундів селекції ручним способом доти, поки морфологія тканини не стане 12 UA 102507 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 придатною для регенерації, типово щонайменше 2 тижня, потім тканину переносять у середовище, що сприяє утворенню пагонів. Культури переносять періодично доти, поки не буде відбуватися достатнє утворення пагонів. Після завершення утворення пагонів їх переносять у середовище, що сприяє утворенню коренів. Після того, як корені були в достатньому ступені сформовані, рослини можна переносити в ґрунт для їхнього подальшого росту і дозрівання. Для підтвердження присутності екзогенної ДНК або “трансгена(трансгенів)” у регенерованих рослинах можна здійснити різні аналізи. Такі аналізи включають, наприклад, “молекулярнобіологічні” аналізи, такі як сазерн- і нозерн-блотинг і ПЛР; “біохімічні” аналізи, такі як детекція присутності білкового продукту, наприклад, за допомогою імунологічного методу (аналізи ELISA і вестерн-блотинг) або ферментативної функції; аналізи частин рослини, такі як аналізи листя або коренів; а також за допомогою аналізу фенотипу цілої регенерованої рослини. Після здійснення введення трансгена в рослину, цей ген можна вводити в будь-яку рослину, яка за своєю статтю є сумісною з першою рослиною, шляхом схрещування, без необхідності будь-якої безпосередньої трансформації іншої рослини. Тому термін “потомство”, як він використовується в даній заявці, означає потомство будь-якого покоління вихідної рослини, одержане відповідно до даного винаходу, де таке потомство включає певну конструкцію ДНК, одержану відповідно до даного винаходу. “Трансгенна рослина”, таким чином, може бути будьякого покоління. “Схрещування” рослини для одержання рослинної лінії, що має один або більше доданих трансгенів або алелей у порівнянні з вихідною рослинною лінією, як розкривається в даній заявці, визначається як прийоми, які в результаті забезпечують уведення конкретної послідовності в рослинну лінію шляхом схрещування вихідної лінії з донорною рослинною лінією, яка включає трансген або алель за даним винаходом. Для досягнення цього, можна, наприклад, здійснити наступні стадії: (a) висаджування насіння першої (вихідної лінії) і другої (донорної рослинної лінії, яка включає бажаний трансген або алель) батьківських рослин; (b) вирощування насіння першої і другої батьківських рослин до одержання рослин із квітками; (c) запилення квітки першої батьківської рослини пилком другої батьківської рослини; і (d) збір насіння, одержаного від батьківської рослини, що має запилену квітку. Немодифіковані і модифіковані молекули білків і відповідні до них молекули нуклеїнових кислот, що забезпечують стійкість до одного або декількох гербіцидів, добре відомі з рівня техніки. Наприклад: a) послідовності, що кодують стійкість до гліфосату, включають 5-енолпірувілшикимат-3фосфатсинтази (EPSPS; Патент США № 5627061, Патент США № RE39247, Патент США № 6040497, Патент США № 5094945, WO04074443 і WO04009761), гліфосат оксидоредуктазу (GOX; Патент США № 5463175), гліфосат декарбоксилазу (WO05003362 і Патентна заявка США № 20040177399) і гліфосат-N-ацетилтрансферазу (GAT; Патентна публікація США № 20030083480), які надають стійкість до гліфосату; b) дикамбамонооксигеназа (DMO, кодовану ddm), що надає стійкість до ауксин-подібних гербіцидів, таких як дикамба (Публікації патентних заявок США №№ 20030115626, 20030135879; Wang et al, 1996; Herman et al, 2005); c) фосфінотрицинацетилтрансфераза (bar), що надає стійкість до фосфінотрицину або глуфосінату (Патент США № 5646024, Патент США № 5561236, Європейський патент № 275957; Патент США № 5276268; Патент США № 5637489; Патент США № 5273894); d) дегалогеназа 2,2-дихлорпропіонової кислоти, що надає стійкість до 2,2-дихлорпропіонової кислоти (Dalapon) (WO9927116); e) ацетооксикислотна синтаза або ацетолактатсинтаза, що надають стійкість до інгібіторів ацетолактатсинтази, таких як сульфонілсечовина, імідазолінон, триазолопіримідин, піримідилоксибензоати і фталід (Патент США № 6225105; Патент США № 5767366, Патент США № 4761373; Патент США № 5633437; Патент США № 6613963; Патент США № 5013659; Патент США № 5141870; Патент США № 5378824; Патент США № 5605011); f) галоарилнітрилаза (Bxn) для надання стійкості до бромоксинілу (WO8704181A1; Патент США № 4810648; WO8900193A); g) модифікована ацетил-кофермент A-карбоксилаза для надання стійкості до циклогенсандіону (сетоксідим) і арилоксифеноксипропіонату (галоксифоп) (Патент США № 6414222); h) дигідроптероатсинтаза (sul І) для надання стійкості до сульфонамідних гербіцидів (Патент США № 5597717; Патент США № 5633444; Патент США № 5719046); і) поліпептид фотосистеми II 32 кДа (psbА) для надання стійкості до триазинових гербіцидів (Hirschberg et al., 1983); j) антранілатсинтаза для надання стійкості до 5-метилтриптофану (Патент США № 4581847); k) синтаза дигідропіколінової кислоти (dapА) для надання стійкості аміноетилцистеїну 13 UA 102507 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 (WO8911789); 1) фітоендесатураза (crtІ) для надання стійкості до піридазинонових гербіцидів, таких як норфлуразон (JP06343473); m) гідроксифенілпіруватдіоксигеназа для надання стійкості до циклопропілізоксазолових гербіцидів, таких як ізоксафлутол (WO 9638567; U.S. 6268549); n) модифікована протопорфіриногеноксидаза I (protox) для надання стійкості до інгібіторів протопорфіриногеноксидази (Патент США № 5939602); і o) арилоксіалканоатдіоксигеназа (AAD-I) для надання стійкості до гербіциду, що містить арилоксіалканоатну групу (WO05107437). Приклади таких гербіцидів включають феноксіауксини (такі як 2,4-D і дихлорпроп), піридилоксіауксини (такі як флуроксипір і триклопір), арилоксифеноксипропіонати (AOPP) інгібітори ацетил-кофермент A-карбоксилази (ACCase) (такі як галоксифоп, хізалофоп і диклофоп) і 5-заміщені інгібітори феноксіацетатпротопорфіріногеноксидази IX (такі як пірафлуфен і флуміклорак). ПРИКЛАДИ Наступні приклади включені для ілюстрації варіантів втілення даного винаходу. Фахівцям у даній галузі повинно бути зрозумілим, що технічні прийоми, що розкриваються в прикладах, які наведені нижче, являють собою технічні прийоми, які були відкриті авторами даного винаходу як справно працюючі при здійсненні даного винаходу. Однак фахівцям у даній галузі, у світлі даного розкриття, повинно бути зрозумілим, що можна здійснювати різні зміни в конкретних варіантах втілення винаходу, які розкриваються в даній заявці, і при цьому одержувати подібний або аналогічний результат, без відхилення від концепції, суті та обсягу даного винаходу. Конкретніше повинно бути зрозумілим, що деякі речовини, які є як хімічно, так і фізіологічно спорідненими, можна використовувати для заміщення речовин, описаних у даній заявці, з одержанням при цьому подібних або аналогічних результатів. Усі такі подібні заміщення і модифікації, що є очевидними для фахівців у даній галузі, розглядаються як такі, що знаходяться в межах суті, обсягу і концепції даного винаходу, як це визначено доданою формулою винаходу. ПРИКЛАД 1 Одержання трансгенної сої, що містить ген DMO Трансгенні рослини сої, що включають DMO-кодуючий трансген, одержували шляхом Agrobacterium-опосередкованої трансформації тканини соєвих бобів із сортів культурної рослини Thorne, NE3001 і A3525 із використанням стандартних процедур (наприклад, Патент США № 6384301, Патент США № 7002058 або Zhang et al, 1999) із бінарним вектором, що містить DMO-кодуючий полінуклеотид, який кодує поліпептид із SEQ ID NO:1. ПРИКЛАД 2 Індукція білка патогенезу, що бере участь в опірності захворюванням, за допомогою дикамби і DCSA Трансгенне і контрольне насіння сої (сорту культурної рослини Thorne, NE3001, A3525) висаджували в пластмасові 3,5-дюймові квадратні горщики, що містять Redi-earth™ (ScottsSierra Horticultural Products Co., Marysville, Ohio). Горщики поміщали на повстяне сплетення з капілярами в лотки для зрошування зі скловолокна 35 дюймів×60 дюймів (88,9 см×152,4 см) для зрошування зверху і/або знизу протягом усього періоду дослідження, щоб підтримувати вологість ґрунту, оптимальну для росту рослин, і вносили добриво Osmocote® (14-14-14, що повільно вивільняється; Scotts-Sierra Horticultural Products Co., Marysville, Ohio) при нормі 3 внесення 100 г/фут для підтримування росту рослин протягом усього періоду дослідження в теплиці. Рослини вирощували в теплицях при денній/нічній температурі 29°/21°C при відносній вологості в межах 15%-50% для імітації умов вирощування, таких як умови теплого сезону кінця весни. Забезпечували мінімальний 14-годинний період освітленості з додатковим світлом близько 600 мкЕ (мікро-Ейнштейн), якщо це необхідно. Дослідження здійснювали за схемою рандомізованих блоків, рандомізованих за кількістю від 4 до 6 повторів кожної обробки. Усі нанесення гербіцидів здійснювали за допомогою розбризкувача з використанням плоскої віялоподібної насадки Teejet® 9501E (Spraying Systems Co, Wheaton, IL) з установкою тиску 2 повітря мінімум 24 ф/дюйм (фунтів на квадратний дюйм), або 165 кПа (кілопаскалей)). Насадку, що розбризкує, тримали на відстані близько 16 дюймів вище верхівки рослинного матеріалу для оббризкування. Оббризкування здійснювали в об’ємі 10 галонів на акр, або 93 літри на гектар. Нанесення здійснювали, коли рослини досягали стадії V-3. Трансгенні види, що мають трансген DMO у своєму геномі, вирощували та обробляли дикамбою (Clarity®, BASF) при нормі витрати 1 ф/акр на пост-V3 стадії. Зразки листя збирали через 0, 3, 8, 24, 48, 72 годин після обробки (HAT) і заморожували для наступного аналізу. В 14 UA 102507 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 іншому експерименті DMO-вмісні рослини оббризкували або дикамбою, або DCSA при нормі витрати 0,25 ф/акр, 0,5 ф/акр і 1 ф/акр і збирали зразки тканини через 24 години після обробки. РНК екстрагували та аналізували методом нозерн-блотингу з використанням PR-2, тобто -1,3глюканази, у ролі зонда. PR-2 являє собою білок патогенезу, відомий як такий, що розкладає мембрани грибів і, таким чином, забезпечує захист проти грибкових патогенів (Патент США № 5670706). Зразки тканин подрібнювали в пробірках Falcon™ (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ) із використанням рідкого азоту і кульок зі скла/металу. Субзразки відбирали в пробірки Епендорфа. Використовували міні набір рослинної РНК для екстракції РНК, відповідно до протоколу виробника (Qiagen, Valencia, CA). Концентрацію РНК визначали за допомогою вимірювання оптичної густини (OD) при 260 і 280 нм. П’ять мкг (мікрограм) РНК осаджували шляхом додавання 1/10 об’єму 3M ацетату натрію і 2,5 об’єму 100% етанолу і пробірки зберігали при 20ºC протягом 48 годин. Пробірки центрифугували протягом 20 хвилин при 4°C і супернатант зливали. Додавали в пробірки семидесятивідсотковий етанол і обережно ресуспендували РНК, що знаходиться в пробірках. Пробірки потім центрифугували протягом 3,5 хвилин і одержаний після центрифугування осад, що містить РНК, сушили протягом від близько 30 до 60 хвилин і ресуспендували в 15 мкл навантажувального буфера, (гелевий навантажувальний буфер, II від Ambion, Austin, TX) за допомогою швидкого перемішування із завихренням і змішування. Зразки РНК і РНК маркери (RNA ladder; Invitrogen, Carlsbad, CA) денатурували при 65°C протягом 10 хвилин і витримували на льоді аж до їхнього завантаження в гель, одержаний з 1% агарози і 2% формальдегіду в 1x MOPS буфері. Гель аналізували при 17 В протягом 16 годин у 1x MOPS буфері та забарвлювали етидійбромідом для візуального спостереження зразків і маркерів РНК у гелі. Гель промивали протягом 30 хвилин у воді для видалення етидійброміду з наступними двома промиваннями в 20x SSC (NaCl і цитрат натрію), кожне протягом 15 хвилин. Зразки і маркери РНК наносили у вигляді плями на мембрану (Nytran® PLUS, Midwest Scientific, Valley Park, MO) із використанням системи швидкого перенесення вниз (Turblotter™ і blotting stack, Whatman-Schleicher & Schuell; Florham Park, NJ) протягом 5-6 годин. Мембрани промивали водою, піддавали УФ поперечному зшиванню і клали на папір для висушування. Мембрани попередньо гібридизували в 15 мл теплого буфера DIG Easy Hyb (Roche, Penzberg, Germany) при 50ºC протягом 30 хвилин. PR-2 зонд мітили за допомогою DIG і синтезували з використанням набору для синтезу DIG зонда за допомогою ПЛР відповідно до інструкцій виробника (Roche), кип’ятили протягом 5 хвилин і охолоджували на льоді перед додаванням до теплого 15 мкл DIG Easy Hyb буферу. Гібридизацію здійснювали протягом ночі при 50ºC. РНК блот промивали двічі в умовах високої жорсткості протягом 5 хвилин і 15 хвилин, у 2x SSC і 0,1% SDS розчині при кімнатній температурі. Потім йшли ще два промивання кожне протягом 30 хвилин у 0,5x SSC і 0,1% розчині SDS при 68°C. Блот потім промивали в 1x промивальному буфері (Roche) протягом 2 хвилин і блокували з використанням блокувального реагенту (Roche) протягом від 30 хвилин до 3 годин при кімнатній температурі при помірному струшуванні. Блот переносили в 30 мл розчину DIG антитіл (75 мОд/мл, Roche) на 30 хвилин. Незв’язані антитіла видаляли за допомогою 3 промивань, по 15 хвилин кожне, із використанням 1x промивального буфера. Блот урівноважували в 1x буфері для детекції (Roche) протягом 3 хвилин. Готовий для використання CDP-STAR (динатрій 2-хлор-5-(4-метоксиспіро{1,2-діоксетан-3,2-(53,7 хлор)трицикло[3,3,1,1 ]декан}-4-іл)-1-фенілфосфат; Roche) додавали до блоту, уміщеного в м’який контейнер для детекції. Контейнер герметично закривали та експонували на плівку BIOMAX (Kodak) протягом 1,5 годин. Фіг. 1 показує індукцію PR2 у різних точках часу після обробки за допомогою дикамби. Пік індукції попадав на 48 годин. Індукція PR2 була відсутня в рослинах, які не були оброблені дикамбою. Фіг. 2 показує індукцію PR2 при різних нормах застосування дикамби і DCSA через 24 години після обробки в двох незалежних трансгенних лініях сої. Індукція PR2 була відсутня в рослинах, які не були оброблені дикамбою або DCSA або які були оброблені тільки водою. ПРИКЛАД 3 DCSA забезпечує стійкість до грибкових захворювань Десятиденні паростки бавовнику Roundup Ready® Flex (Event MON 88913; U.S. Publ. 20060059590) оббризкували сумішшю Roundup Weather Max® (Monsanto, St. Louis, MO) і 3,6DCSA (BASF). Контрольні рослини оббризкували тільки водою. Паростки бавовнику кожної з цих обробок інокулювали Pythium ultimum шляхом занурення паростків у суспензію для інокуляції через 24 години після оббризкування. Рослини, що використовували як позитивний контроль, не обробляли оббризкуванням і не інокулювали P. ultimum. Як показано на Фіг. 3, паростки 15 UA 102507 C2 5 10 15 20 25 30 35 бавовнику, що інокулювали P. ultimum, але які не були оброблені сумішшю Roundup Weather Max® (Monsanto, St. Louis, MO) і 3,6-DCSA, гинули в результаті зараження P. ultimum протягом 10 днів після інокуляції. Однак зараження P. ultimum не було встановлено в рослинах, що одержували суміш Roundup Weather Max® (Monsanto, St. Louis, MO) і 3,6-DCSA. Рослини бавовнику, оброблені сумішшю Roundup® і DCSA, були такими самими здоровими як рослини, не інокульовані P. ultimum. Результати показують, що комбінована обробка Roundup Ultra Max і DCSA знижувала рівень зараження P. Ultimum, коли рослини були інокульовані Pythium через 24 години після обробки за допомогою DCSA. ПРИКЛАД 4 DCSA забезпечує стійкість до бактеріальних захворювань У цьому прикладі двотижневі рослини бавовнику оббризкували DCSA, тоді як контрольні рослини одержували тільки оббризкування водою. Рослини інокулювали бактеріальним патогеном гнилі (Xanthomonas campestris pv. malvacearum) приблизно через 24 години після нанесення спрею DCSA, використовуючи метод інокуляції за допомогою зубочистки. Як показано на Фіг. 4, на рослинах бавовнику, які інокулювали бактеріальним патогеном, але які не оббризкували DCSA, з’являлися некротичні плями, типові симптоми бактеріальної гнилі. Однак рослини бавовнику, які одержували DCSA, нанесений на них за 24 години до інокуляції бактеріальним патогеном, демонстрували тільки локалізовані ураження (HR відповідь) і ніякого збільшення симптомів бактеріальної гнилі. Результати цього експерименту вказують на те, що нанесення DCSA зменшувало бактеріальну інфекцію на рослинах бавовнику, коли їх інокулювали бактеріальним патогеном через 24 години після оббризкування за допомогою DCSA. ПРИКЛАД 5 Дикамба або DCSA підвищує стійкість сої до окисного стресу Для цього прикладу рослини вирощували, як описано в наведеному вище прикладі. Трансгенні і нетрансгенні рослини сої, у геномі яких є присутнім ген DMO, обробляли або за допомогою параквату (Paraquat) (Gramoxone®; Syngenta) для створення окисного стресу, або за допомогою дикамби з наступною обробкою за допомогою Paraquat на стадії V3. Дикамбу використовували при нормі нанесення 1 ф/акр або 1120 г ао/га. Паракват наносили при нормі 30, 70, або 200 г ао/га. Рослини потім оцінювали на ураження паракватом шляхом візуальної оцінки ураження у визначений день після обробки (DAT), оцінюючи ураження за шкалою від 0 до 100 відсотків щодо необроблених контрольних рослин, при цьому нуль означав відсутність ураження і 100% – “повне” ураження або загибель. Дані збирали та аналізували з використанням придатних статистичних методів. Таблиця 1 показує, що значно зменшене ураження Паракватом спостерігали на 4 DAT при всіх трьох нормах застосування, випробуваних на рослинах сої, що мають ген DMO і оброблених дикамбою за 24 години до нанесення Параквату. Таблиця 1 Відсоток ураження нетрансгенних або трансгенних рослин сої, оброблених паракватом або оброблених дикамбою з наступною обробкою паракватом, на стадії V-3. % ураження представлений у вигляді середніх порівняльних показників, одержаних методом ANOVA (стосовно обробки паракватом). Однакові букви означають відсутність статистичної різниці на рівні р=0,05 Рослина N3001 DMO-соя 462 DMO-соя 462 DMO-соя 469 DMO-соя 469 40 Обробка 30 г 32,5 33,3 16,7 30,8 15 6 Паракват Паракват Дикамба, потім Паракват Паракват Дикамба, потім Паракват LSD a a b a b Паракват (г ао/га) 70 г 200 г 50,8 a 75 48,3 a 74,2 26,7 b 51,7 49,2 a 76,7 29,2 b 50 6,7 6,3 a a b a b В іншому експерименті ефект зовнішнього нанесення DCSA випробували на одержувані від цієї переваги для захисту рослин сої від ураження окисним стресом, що викликається Паракватом. Різні кількості DCSA наносили за 24 години до нанесення параквату для визначення будьякої взаємозалежності між кількістю DCSA, що наносять, і одержуваним ступенем захисту від 16 UA 102507 C2 5 10 окисного стресу, виміряним як зменшення % ураження, як описано вище. Різні рівні дикамби також окремо наносили для перевірки цієї гіпотези. Таблиця 2 показує, наприклад, що нанесення або дикамби, або DSCA забезпечувало захист проти окисного стресу, що викликався наступним нанесенням параквату. Трансгенні рослини, що контактували тільки з паракватом, показали ступінь ураження близько 75%, тоді як трансгенні рослини, що контактували з різними кількостями дикамби або DSCA, із наступною обробкою паракватом, на диво, показали зниження рівня ураження. Крім того, зниження рівня ураження підсилювалося зі збільшенням норм застосування як дикамби, так і DCSA. Рослини, які використовували в цьому експерименті, були трансгенними. Ефект дикамби є результатом in planta конверсії дикамби в DCSA або наступного метаболізму, тоді як ефект DCSA має місце завдяки DCSA як такому або завдяки його метаболітам. Таблиця 2 Відсоток ураження трансгенних рослин сої, оброблених паракватом або оброблених дикамбою або DCSA з наступною обробкою паракватом, на стадії V-3. % ураження представлений у вигляді середніх порівняльних показників, одержаних методом ANOVA Трансгенна лінія 462-1-21 462-1-21 469-13-19 469-13-19 15 20 25 30 Обробка Дикамба DCSA Дикамба DCSA % ураження на 5 DAT Контроль з використанням тільки параквату 100 г ао/га 75,83 75,83 77,50 77,50 % ураження на 5 DAT при різних нормах застосування Дикамба або DCSA з наступним 100 г ао/га параквату 280 г/га 561 г/га 1120 г/га 65,00 66,67 51.67 50,83 54,17 53,33 45,83 48,33 45,83 49,17 40,83 43,33 ПРИКЛАД 6 DCSA підвищує стійкість бавовнику до окисного стресу Чотири різних сорти культурних рослин бавовнику, зазначених у Таблиці 3, вирощували в 4дюймових горщиках протягом двох тижнів. Ці рослини бавовнику або оббризкували DCSA (BASF) при нормі 1 ф/а (454 г/а), або не оббризкували (відсутність нанесення DCSA, як контроль). Експериментальні рослини (оброблені DCSA і необроблені) оббризкували паракватом (Gramoxone®; Syngenta) при нормах нанесення 30 г/га, 70 г/га і 100 г/га через 24 години після нанесення DCSA, щоб стимулювати окисний стрес. Рослини, що використовували як позитивний контроль, не одержували ніякої хімічної обробки (не застосовували ні DCSA, ні Gramoxone). Усі рослини потім оцінювали на ураження паракватом шляхом візуальної оцінки через два дні після обробки (DAT) за допомогою Gramoxone®, оцінюючи ураження за шкалою від 0 до 100 відсотків стосовно необроблених контрольних рослин, при цьому нуль означав відсутність ураження, а 100% – “повне” ураження або загибель рослини. Цей же експеримент повторювали на двох різних стадіях росту бавовнику (стадії 2 вузликів і стадії 5 вузликів). Результати цих експериментів, наведені в Таблиці 3, показують, що ураження, що викликала Gramoxone, значно зменшувалося, коли чотири різновиди RR бавовнику були попередньо оброблені DCSA (24 години) на двох різних стадіях росту (стадії 2 вузликів і стадії 5 вузликів). Зниження симптомів ураження не залежало від тих двох стадій росту бавовнику, що були випробувані. Подібні результати одержували з нетрансгенним сортом культурної рослини бавовнику ST474. 17 UA 102507 C2 Таблиця 3 Відсоток ураження зазначених різновидів рослини бавовнику, оброблених паракватом або оброблених DCSA з наступною обробкою паракватом Необроблений контроль Gramoxone (30 г ао/га) DCSA (1ф/акр) + Gramoxone (30 г ао/га) Gramoxone (70 г ао/га) DCSA (1ф/акр) + Gramoxone (70 г ао/га) Gramoxone (100 г ао/га) DCSA (1ф/акр) + Gramoxone (100 г ао/га) 5 10 15 ST4646B2RF 0 31,5 ST3273B2RF 0 35 ST4575BR 0 37,5 ST6622RF 0 42,5 8,5 6 12,5 7,5 42,5 50 42,5 50 20 32,5 30 35 70 50 65 70 45 45 40 50 ПРИКЛАД 7 Підвищення врожайності шляхом нанесення дикамби на рослини Перевагу DSCA, пов’язану з підвищенням врожайності, випробували шляхом вирощування нетрансгенних і трансгенних рослин і нанесення дикамби на трансгенні рослини і збирання насіння. Насіння нетрансгенної і трансгенної сої висаджували приблизно на початку сезону вирощування на ділянках, розташованих у різних місцях, під час самих по можливості сприятливих умов для росту, таких як вологість ґрунту, температура і глибина посадки. По всій ділянці насіння висівали, використовуючи план досліду за схемою розщепленої ділянки, з обробками дикамбою як ефектами, що стосуються ділянки в цілому, і трансгенними лініями як ефектами, що стосуються розщепленої ділянки. Деталі плану були такими: 6 ділянок, 2 повторності/ділянку, 2 ряди/ділянку, довжина ряду 12 футів (+3 фути прохід), 9 насінин/фут, 108 насінин/ряд, 5 трансгенних ліній (трансгенні лінії 1-4 і п’ята трансгенна лінія, що була сегрегуючою); і 4 обробки, як показано нижче в Таблиці 4. У цілому, для посадки використовували 240 ділянок на 6 ділянках (40 на ділянку). Таблиця 4 Детальні дані чотирьох обробок дикамбою у застосуванні до трансгенної сої Обробка 1 2 3 4 20 25 30 Дикамба 0 1,5 ф ао/акр 0 1,5 ф ао/акр 1 нанесення Стадія рослини н/в Передсходова (Pre) н/в Передсходова (Pre) Дикамба 0 0 1,5 ф ао/акр 1,5 ф ао/акр 2 нанесення Стадія рослини н/в н/в Післясходова (Post; V3-4) Післясходова (Post; V3-4) Чотири нетрансгенних крайніх ряди засіювали на всіх ділянках, на яких проводили дослідження, із використанням відомої комерційної лінії, такої як A3525. Були застосовані оптимальні практичні міри для вирощування і догляду, відомі з рівня техніки. Застосовувалися максимальні міри боротьби зі шкідниками і боротьби з хворобами, у міру необхідності, для запобігання несприятливих ефектів застосування дикамби. Поле зрошували в міру необхідності, відповідно до стандартної практики. Результати, наведені на Фіг. 5, показують, що присутність трансгена DMO у сої не чинить ніякого негативного впливу на врожайність або інші агрономічні ефекти за відсутності обробки дикамбою. На відміну від цього, як показано на Фіг. 6, у 4/5 видів і 13/15 обробок оббризкування за допомогою дикамби показало підвищену або еквівалентну врожайність у порівнянні з необробленими контролями. Це говорить про сприятливий вплив на врожайність, що є результатом поліпшеного здоров’я рослин, завдяки DCSA, продукованому in vivo у результаті дії DMO на дикамбу. ПРИКЛАД 8 Забезпечення багатьох переваг шляхом експресії генів толерантності до дикамби і гліфосату та обробки рослин гліфосатом і дикамбою 18 UA 102507 C2 5 10 15 20 Було виявлено, що ген толерантності до гліфосату, такий як CP4 EPSPS, забезпечує толерантність до гліфосатуі поліпшує здоров’я рослин шляхом забезпечення резистентності до різних патогенів, включаючи Phakopsora pachyrizi і Phakopsora meibomiae, які є збудниками іржі сої, що досягається безпосередньою дією гліфосату на такі патогенні гриби (WO05102057). У даному випадку, було показано, що DMO 81527 забезпечує толерантність до дикамби і поліпшує здоров’я рослин шляхом зниження викликаного патогенами та окисного стресів. Інші переваги можуть бути одержані шляхом об’єднання цих двох генів в одній рослині за допомогою молекулярних способів і розмноження, і обробки рослин гліфосатом і дикамбою. Це збільшує число опцій, доступних для тих, хто займається вирощуванням рослин, залежно від вимог ринку та екологічних вимог. ПРИКЛАД 9 Боротьба з кореневими нематодами бавовнику (RKN; Meloidogyne incognita) за допомогою DCSA Несподівано було виявлено, що DCSA контролює галоутворення, підвищує висоту рослини і зменшує кількість яєць, утворених нематодою у рослинах бавовнику (ST474) (Таблиця 5). Десяти-чотирнадцятиденні рослини бавовнику обробляли DCSA при нормі застосування 1ф/а (454 г/а) за 24 години до їхнього зараження яйцями RKN. Рослини бавовнику, що були оброблені DCSA, показали відсутність або незначне галоутворення (0,6 проти 2,6), поліпшену висоту рослини (19,8 см проти 16,9 см) і зменшену кількість яєць (4575 проти 6425) у порівнянні з рослинами, що не були оброблені DSCA. Ріст рослин кількість галоутворень і кількість яєць вимірювали через 45 днів після зараження. Оцінку галоутворення здійснювали за шкалою 0-5, де 0=відсутність видимого галоутворення і 5=сильне галоутворення. Таблиця 5 Контроль RKN шляхом обробки бавовнику DCSA Рослина 1 2 3 4 5 6 7 8 Середнє Стандартна похибка 25 30 35 Тільки RKN RKN + DCSA Неінокульований контроль RKN RKN RKN Висота Кількість Оцінка Висота Кількість Оцінка Висота Кількість Оцінка рослини яєць/ гало- рослини яєць/ гало- рослини яєць гало(см) горщик утворення (см) горщик утворення (см) утворення (0-5) (0-5) (0-5) 15,9 2,160 2 25,4 8,160 0 21,0 0,0 0,0 20,3 5,120 2 25,4 9,120 0 18,4 0,0 0,0 12,1 9,480 3 25,4 5,200 0 19,7 0,0 0,0 20,3 5,600 3 22,2 3,720 2 20,3 0,0 0,0 15,2 2,800 3 17,8 3,360 1 14,0 0,0 0,0 15,2 15,400 2 14,0 3,040 1 20,6 7,680 3 15,9 1,800 0 15,2 3,160 3 12,7 2,200 1 16,9 6,425 2,6 19,8 4,575 0,6 18,7 0,0 0,0 1,1 1,557 0,2 1,9 962 0,3 1,0 0,0 0,0 ПРИКЛАД 10 DCSA забезпечує захист проти Verticillium Несподівано було виявлено, що DCSA забезпечує захист рослин бавовнику проти Verticillium dahliae, збудника такої хвороби бавовнику, як в’янення (Таблиця 6). Рослини бавовнику сортів ST6611, BOLLGARD 2, ROUNDUP READY FLEX інокулювали помірним штамом (DPL) або вірулентним штамом (King) Verticillium методом занурення паростків. Паростки на стадії першого справжнього листка витягали з горщиків, один дюйм (2,54 см) коренів відрізали, паростки занурювали в суспензію спор на одну хвилину і потім пересаджували назад у горщики. Ці штами були виділені та одержані від Dr. Terry Wheeler (Texas A&M University, TX USA). DCSA застосовували при нормі 1 ф/а, а гліфосат (ROUNDUP WEATHERMAX, Monsanto) при нормі 0,75 ф/а за 24 години до інокуляції. Захист проти Verticillium визначали за шкалою оцінки тяжкості захворювання 1-9: де оцінка 1 означає здорову рослину, а оцінка 9 означає загибель рослини в результаті захворювання, а також вимірювали за кількістю рослин, що вижили, з 10 інокульованих рослин. Застосування DCSA забезпечувало захист як проти помірного, так і сильного штаму Verticillium dahliae. Інокульовані рослини 19 UA 102507 C2 бавовнику, що були оброблені DCSA, показали нижчі оцінки і вищий показник виживаності в порівнянні з інокульованими контрольними рослинами, що не були оброблені DCSA. Таблиця 6 Контроль Verticillium шляхом нанесення DCSA на бавовник Verticillium (штам DPL) Оцінка Оцінка Обробка тяжкості виживаності (обробки) ураження (1- рослини (із 10 9) рослин) Немає 1 10 Інокульований 5 8 контроль Гліфосат 2 10 DCSA 1 10 DCSA + 2 10 гліфосат 5 10 15 20 25 30 35 40 Verticillium (штам King) Оцінка Оцінка Обробка тяжкості виживаності (обробки) ураження рослини (із 10 (1-9) рослин) Немає 1 10 Інокульований 9 0 контроль Гліфосат 3,5 10 DCSA 2 10 DCSA + 3 гліфосат Усі з композицій і/або способів, що розкриваються і заявлені у даній заявці, можуть бути одержані і здійснені без зайвого експериментування у світлі даного розкриття. Хоча композиції і способи за даним винаходом були описані як переважні варіанти втілення винаходу, фахівцям у даній галузі повинно бути зрозумілим, що можуть бути варіанти в застосуванні до композицій і/або способів і стадій або послідовності стадій способу, описаного в даній заявці, без відступу від концепції, суті та обсягу даного винаходу. Конкретніше, повинно бути зрозумілим, що деякі речовини, які є як хімічно, так і фізіологічно спорідненими, можна використовувати для заміщення речовин, описаних у даній заявці, з одержанням при цьому подібних або аналогічних результатів. Усі такі подібні заміщення і модифікації, що є очевидними для фахівців у даній галузі, розглядаються як такі, що знаходяться в межах суті, обсягу і концепції даного винаходу, як це визначено доданою формулою винаходу. ПОСИЛАЛЬНА ЛІТЕРАТУРА Посилальні документи, перераховані нижче, включені в дану заявку за допомогою посилання у тому ступені, у якому вони доповнюють, пояснюють, забезпечують передумови або розкривають методику, технічні прийоми і/або композиції, використовувані в даній заявці. Патент США № 4554101; Патент США № 5004863; Патент США № 5015580; Патент США № 5017692; Патент США № 5159135; Патент США № 5445962; Патент США № RE39247; Патент США № 5322938; Патент США № 5352605; Патент США № 5359142; Патент США № No. 5362865; Патент США № 5378619; Патент США № 5384253; Патент США № 5424412; Патент США № 5508184; Патент США № 5530196; Патент США № 5538880; Патент США № 5550318; Патент США № 5552299; Патент США № 5567600; Патент США № 5591616; Патент США № 5635055; Патент США № 5641876; Патент США № 5659122; Патент США № 5567862; Патент США № 5670706; Патент США № 5689052; Патент США № 5824877; Патент США № 5837848; Патент США № 5846797; Патент США № 5850019; Патент США № 5859347; Патент США № 5981840; Патент США № 6051753; Патент США № 6140078; Патент США № 6160208; Патент США № 6175060; Патент США № 6177611; Патент США № 6232526; Патент США № 6252138; Патент США № 6294714; Патент США № 6384301; Патент США № 6388170; Патент США № 6399861; Патент США № 6403865; Патент США № 6426446; Патент США № 6429357; Патент США № 6429362; Патент США № 6433252; Патент США № 6437217; Патент США № 6624344; Патент США № 6635806; Патент США № 7002058; Патент США № 7022896; Патент США №. 7132528; і Патент США № No. 7151204 Патентна публікація США 20030115626; Патентна публікація США 20050050587; Патентна публікація США 20050022261; Патентна публікація США 20060030488; Патентна публікація США 20060162010; Патентна публікація США 20060168700; Патентна публікація США 20060236420. Allen and Holmes, In: Photosynthesis: Energy transduction, 103-141, IRL Press, Oxford, 1986. Bevan et al, Nature, 304:184-187, 1983. Carrington and Freed, J. of Virology 64:1590-1597, 1990. Chandler et al, Plant Cell, 1:1175-1183, 1989. Chu et al. Scientia Sinica 18:659, 1975. 20 UA 102507 C2 5 10 15 20 25 30 Cork and Khalil, Adv. Appl. Microbiol, 40:289-321, 1995. Coruzzi et al, EMBO J., 3:1671-1679, 1984. Depicker et al, J. Mol. Appl. Genet. 1:561-573, 1982. Εbert et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84:5745-5749, 1987. Європейський патент 553494 Європейський патент 646643 Frederick et al, Mycology, 92:217-227, 2002. Grossmann, Trends Plant Sci. 5:506-508, 2000. Herman et al, J. Biol. Chem. 280:24759-24767, 2005. Hirschberg et al, Science, 222:1346-1349, 1983 Ingelbrecht et al, Plant Cell, 1:671-680, 1989. Kyte and Doolittle, J. Mol Biol, 157(l):105-132, 1982. Lawton et al, Plant Mol Biol 9:315-324, 1987. Miki et al, In: Methods in Растении Molecular Biology and Biotechnology, Glick and Thompson (Eds.), CRC Press, 67-88, 1993. Murashige and Skoog, Physiol Plant 15:473-497, 1962. Odell et al, Nature, 313:810-812, 1985. Заявка PCT WO 05/102057A2 Заявка PCT WO 97/11086 Заявка PCT WO 97/31115 Заявка PCT WO95/06722 Peterson and Arntzen, In: Methods in Chloroplast Molecular Biology, 985-1014, Elsevier Science Publications, B.V., Amsterdam, 1982. Turner and Foster, Molecular Biotech., 3:225, 1995. VanGessel and Majek, 2005, 2005 Soybean Weed Management Guide: for Delaware and New Jersey, University of Delaware and Rutgers University Walker et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84:6624, 1987. Weeks et al, "Genetic Engineering of Tobacco, Tomato, Arabidopsis and Soybean Plants for Tolerance to Treatment with the Herbicide Dicamba, " Soy/2006, 11th Biennial Conference on the Molecular и Cellular Biology of Soybean, (abstr.), University of Nebraska-Lincoln, Lincoln, NE, 2006. Yang and Russell, Proc. Natl Acad. Sci. USA, 87:4144-4148, 1990. Zhang et al, Plant клітини, Tissue and Organ Culture, 56: 37-46, 1999. 21 UA 102507 C2 22 UA 102507 C2 23 UA 102507 C2 24 UA 102507 C2 ФОРМУЛА ВИНАХОДУ 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 1. Спосіб поліпшення здоров'я рослини або популяції рослин, що включає забезпечення рослини дикамбою або продуктом DMO-опосередкованого метаболізму у кількості, яка поліпшує здоров'я рослини в порівнянні з рослиною такого ж генотипу, але яка не була забезпечена дикамбою або продуктом її DMO-опосередкованого метаболізму, де рослина забезпечена дикамбою або продуктом її DMO-опосередкованого метаболізму є трансгенною рослиною, що містить трансген, який кодує дикамбамонооксигеназу. 2. Спосіб за п. 1, що включає забезпечення рослини 3,6-DCSA або його аналогом у кількості, яка поліпшує здоров'я рослини в порівнянні з рослиною такого ж генотипу, але яка не була забезпечена 3,6-DCSA або його аналогом. 3. Спосіб за п. 1, де рослина знаходиться на рослинницькій ділянці. 4. Спосіб за п. 1, що додатково включає забезпечення можливості для рослини піддаватися біотичному або абіотичному стресу до, одночасно або після забезпечення рослини продуктом DMO-опосередкованого метаболізму або продуктом її DMO-опосередкованого метаболізму або його аналогом. 5. Спосіб за п. 1, що додатково включає стадію ідентифікації рослини, що потребує поліпшення здоров'я рослини, до забезпечення рослини дикамбою або продуктом її DMO-опосередкованого метаболізму або його аналогом. 6. Спосіб за п. 5, де ідентифікація рослини, що потребує поліпшення здоров'я, включає ідентифікацію рослини, що включає щонайменше перший симптом, який є показником біотичного або абіотичного стресу. 7. Спосіб за п. 6, де симптом вибраний із групи, що включає низькорослість, втрату функції фотосинтезу, перокиснення ліпідів, акумуляцію активних форм кисню, підвищення вмісту вільних радикалів і некротизацію. 8. Спосіб за п. 1, де рослина має ризик бути підданою або знаходитися під дією абіотичного стресу. 9. Спосіб за п. 8, де абіотичний стрес вибраний із групи, що включає осмотичний стрес, вплив спеки або холоду, окисний стрес і дефіцит поживних речовин. 10. Спосіб за п. 1, де рослина має ризик бути підданою або знаходитися під дією біотичного стресу. 11. Спосіб за п. 10, де біотичний стрес вибраний із групи, що включає грибкове захворювання, вірусне захворювання, бактеріальне захворювання, нашестя комах-шкідників, нематодну інвазію і нашестя бур'янів. 12. Спосіб за п. 11, де біотичний стрес являє собою іржу сої, кільчасте в'янення, бактеріальну гниль, захворювання паростків або зараження кореневими нематодами. 13. Спосіб за п. 1, де стійкість до окисного стресу в рослині підвищується. 14. Спосіб за п. 1, який додатково характеризується тим, що включає забезпечення популяції рослин зазначеною дикамбою або продуктом її DMO-опосередкованого метаболізму, або його аналогом для поліпшення здоров'я рослин. 15. Спосіб за п. 1, де продукт DMO-опосередкованого метаболізму являє собою 3,6-DCSA, 3,5DCSA, DCGA або 3-CSA, або метаболіт 3,6-DCSA, 3,5-DCSA, DCGA або 3-CSA. 16. Спосіб за п. 1, де продукт DMO-опосередкованого метаболізму являє собою аналог 3,6DCSA. 17. Спосіб за п. 1, де рослина включає трансген, який кодує DMO. 18. Спосіб за п. 1, де продукт не є гербіцидним. 19. Спосіб за п. 4, що включає обробку зазначеної ділянки від близько 0,25 ф/а до близько 1,5 ф/а дикамби. 20. Спосіб за п. 4, що включає обробку зазначеної ділянки від близько 0,25 ф/а до близько 12 ф/а DCSA. 21. Спосіб за п. 1, де рослина не включає трансген, який кодує DMO. 22. Спосіб за п. 1, де рослина являє собою дводольну рослину. 23. Спосіб за п. 1, де дводольна рослина вибрана з групи, що включає люцерну, боби, буряк, броколі, капусту, моркву, цвітну капусту, селеру, китайську капусту, бавовник, огірок, баклажан, льон, латук, люпин, диню, горох, перець, земляний горіх, картоплю, гарбуз звичайний, редьку, ріпак, шпинат, сою, гарбуз великоплідний столовий, цукровий буряк, соняшник, помідор і кавун звичайний. 24. Спосіб за п. 1, де рослина являє собою однодольну рослину. 25 UA 102507 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 25. Спосіб за п. 24, де однодольна рослина вибрана з групи, що включає ячмінь, кукурудзу, цибулю-порей, цибулю, рис, сорго, цукрову кукурудзу, пшеницю, жито, просо, цукрову тростину, овес, тритикале, просо прутоподібне і газонну траву. 26. Спосіб за п. 1, де рослина додатково характеризується як толерантна до гербіциду, вибраного з групи, що складається з гліфосату, глуфосинату, 2,4-D, мезотріону, тіазопіру, ізоксафлутолу, бромоксинілу, атразину, флуазифопу-P і сульфонілсечовин/імідазолінонів. 27. Спосіб за п. 26, що додатково включає контактування рослини щонайменше з одним іншим гербіцидом, вибраним із зазначеного гліфосату, глуфосинату, 2,4-D, мезотріону, тіазопіру, ізоксафлутолу, бромоксинілу, атразину, флуазифопу-P і сульфонілсечовин/імідазолінонів. 28. Спосіб за п. 27, де контактування щонайменше з одним іншим гербіцидом відбувається до контактування з дикамбою або продуктом її DMO-опосередкованого метаболізму. 29. Спосіб за п. 27, де контактування щонайменше з одним іншим гербіцидом відбувається одночасно з контактуванням із дикамбою або продуктом її DMO-опосередкованого метаболізму. 30. Спосіб за п. 27, де контактування щонайменше з одним іншим гербіцидом відбувається після контактування з дикамбою або продуктом її DMO-опосередкованого метаболізму. 31. Спосіб за п. 27, що включає контактування рослини з гліфосатом. 32. Спосіб за п. 2, де рослина знаходиться в стадії вегетативного росту. 33. Спосіб за п. 32, де рослина являє собою сою в стадії росту VE-V4. 34. Спосіб підвищення врожайності рослини, що включає контактування рослини, яка містить ген, що кодує дикамбамонооксигеназу, з кількістю дикамби або продуктом DMOопосередкованого метаболізму дикамби, включаючи DCSA, ефективною для підвищення врожайності рослини в порівнянні з рослиною такого ж генотипу, що вирощують у таких самих умовах, але яка не контактувала з дикамбою або продуктом DMO-опосередкованого метаболізму дикамби. 35. Спосіб за п. 34, де рослина знаходиться на рослинницькій ділянці. 36. Спосіб за п. 34, який додатково характеризується тим, що включає контактування популяції рослин із зазначеною дикамбою або продуктом її DMO-опосередкованого метаболізму. 37. Спосіб за п. 34, де продукт DMO-опосередкованого метаболізму являє собою 3,6-DCSA, 3,5DCSA або 3-CSA, або метаболіт 3,6-DCSA, 3,5-DCSA або 3-CSA. 38. Спосіб за п. 34, де продукт DMO-опосередкованого метаболізму являє собою аналог DCSA. 39. Спосіб за п. 34, де продукт є гербіцидним, і де рослина включає трансген, що кодує DMO. 40. Спосіб за п. 34, де продукт не є гербіцидним. 41. Спосіб за п. 35, що включає обробку зазначеної ділянки від близько 0,25 ф/а до близько 1,5 ф/а дикамби. 42. Спосіб за п. 35, що включає обробку зазначеної ділянки від близько 0,25 ф/а до близько 12 ф/а DCSA. 43. Спосіб за п. 34, де рослина являє собою дводольну рослину. 44. Спосіб за п. 43, де дводольна рослина вибрана з групи, що включає люцерну, боби, буряк, броколі, капусту, моркву, цвітну капусту, селеру, китайську капусту, бавовник, огірок, баклажан, льон, латук, люпин, диню, горох, перець, земляний горіх, картоплю, гарбуз звичайний, редьку, ріпак, шпинат, сою, гарбуз великоплідний столовий, цукровий буряк, соняшник, помідор і кавун звичайний. 45. Спосіб за п. 34, де рослина являє собою однодольну рослину. 46. Спосіб за п. 45, де однодольна рослина вибрана з групи, що включає ячмінь, кукурудзу, цибулю-порей, цибулю, рис, сорго, цукрову кукурудзу, пшеницю, жито, просо, цукрову тростину, овес, тритикале, просо прутоподібне і газонну траву. 47. Спосіб за п. 34, де рослина характеризується як толерантна до гербіциду, вибраного з групи, що складається з гліфосату, глуфосинату, 2,4-D, мезотріону, дитіопіру, ізоксафлутолу, бромоксинілу, атразину, флуазифопу-P і сульфонілсечовин/імідазолінонів. 48. Спосіб за п. 34, що додатково включає контактування рослини щонайменше з одним із зазначених гербіцидів, вибраних із групи, що складається з гліфосату, глуфосинату, 2,4-D, мезотріону, тіазопіру, ізоксафлутолу, бромоксинілу, атразину, флуазифопу-P і сульфонілсечовин/імідазолінонів. 49. Спосіб поліпшення здоров'я насіння, який включає контактування насіння, що містить ген, який кодує дикамбамонооксгеназу, з дикамбою або продуктом її DMO-опосередкованого метаболізму в кількості, яка поліпшує проростання насіння у порівнянні з насінням такого ж генотипу, яке не контактувало з дикамбою або продуктом її DMO-опосередкованого метаболізму. 26 UA 102507 C2 27 UA 102507 C2 28