Антитіло, яке зв’язується з людською пропротеїнконвертазою субтилізин/кексинового типу 9 (pcsk9)

Реферат: Винахід стосується антитіла або його антигензв'язувального фрагмента, яке зв'язується з людською пропротеїнконвертазою субтилізин/кексинового типу 9 (PCSK9). Винахід також стосується фармацевтичної композиції, яка містить дане антитіло, та способу лікування гіперліпідемії або гіперхолестеринемії. UA 114604 C2 (12) UA 114604 C2 UA 114604 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Цей винахід належить до галузі медицини. Зокрема, цей винахід стосується антитіл до пропротеїнконвертази субтилізин/кексин тип 9 (PCSK9), композицій, які містять такі антитіла до PCSK9, і способів застосування антитіл до PCSK9 для лікування гіперліпідемії або гіперхолестеринемії. Пропротеїнконвертаза субтилізин/кексин тип 9 (PCSK9) являє собою секретовану серинпротеазу, що утворюється головним чином у печінці, яка регулює концентрацію в плазмі крові холестерину ліпопротеїдів низької густини (LDL-C). Секретована PCSK9 зв'язується і інтерналізується з рецептором LDL (LDLR), розташованим на поверхні гепатоцитів. Функція LDLR полягає у виведенні LDL-C з плазми шляхом зв'язування і транспортування частинок LDL до лізосом для розкладання. Після того, як частинка LDL доставлена для розкладання, LDLR поновно повертається на поверхню гепатоцитів для зв'язування і виведення додаткової кількості LDL-C з плазми. PCSK9 регулює рівень LDL-C у плазмі крові шляхом спрямування інтерналізованих LDLR на розкладання, а не на поновне повернення на клітинну поверхню, тим самим знижуючи виведення LDL-C. Результати досліджень на гризунах з дефіцитом або надекспресією PCSK9 вже підтвердили, що PCSK9 регулює циркуляційні рівні LDL шляхом модулювання рівнів LDLR. Результати наукових спостережень, за якими циркулююча PCSK9 бере участь у розкладанні печінкових LDLR, надають можливість припустити, що нейтралізація PCSK9 антитілами є ефективним терапевтичним підходом для зниження LDL-C. Повідомлялось про те, що статинові лікарські засоби, які є сучасним загальновживаним лікуванням для зниження LDL-C, можуть фактично підвищити експресію та збільшити сироваткові рівні PCSK9. Тому антитіла до PCSK9 також мають потенціал для зниження LDL-C синергічно зі статиновою терапією. Антитіла до PCSK9 та їх вплив на зниження рівня LDL-C у плазмі крові є відомими - в цій галузі. Наприклад, US2009/0246192, US2009/0142352, US2010/0166768 і WO2010/029513 розкривають такі антитіла до PCSK9 та їх використання. Тим не менш, на сьогоднішній день немає схвалених для терапевтичного використання антитіл, що цілеспрямовано впливають на PCSK9. Таким чином, залишається потреба в альтернативних антитілах до PCSK9. Зокрема, залишається потреба в альтернативних антитілах до PCSK9, які з високою активністю знижують рівень LDL-C. Ще конкретніше, залишається потреба в альтернативних антитілах до PCSK9, які з високою активністю знижують рівень LDL-C і які забезпечують пролонговану дію (наприклад, пролонговане пригнічення рівня LDL-C). Такі антитіла за варіантом, якому віддають перевагу, повинні мати хороші фізико-хімічні властивості, щоб полегшити розробку, виробництво або виготовлення композицій. Цей винахід пропонує антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент, що містить варіабельну ділянку важкого ланцюга (HCVR) і варіабельну ділянку легкого ланцюга (LCVR), де HCVR містить гіперваріабельні ділянки (CDR) HCDR1, HCDR2 і HCDR3, a LCVR містить гіперваріабельні ділянки LCDR1, LCDR2 і LCDR3, де амінокислотна послідовність HCDR1 задана послідовністю SEQ ID NO: 1, амінокислотна послідовність HCDR2 задана послідовністю SEQ ID NO: 2, амінокислотна послідовність HCDR3 задана послідовністю SEQ ID NO: 3, амінокислотна послідовність LCDR1 задана послідовністю SEQ ID NO: 4, амінокислотна послідовність LCDR2 задана послідовністю SEQ ID NO: 5, і амінокислотна послідовність LCDR3 задана послідовністю SEQ ID NO: 6, причому згадане антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент зв'язується з людською PCSK9. В одному з варіантів здійснення цього винаходу запропоноване антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент, що містить варіабельну ділянку важкого ланцюга (HCVR) і варіабельну ділянку легкого ланцюга (LCVR), де амінокислотна послідовність HCVR задана послідовністю SEQ ID No: 7 і амінокислотна послідовність LCVR задана послідовністю SEQ ID NO: 8, причому згадане антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент зв'язується з людською PCSK9. В іншому варіанті здійснення цього винаходу запропоноване антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент, що містить дві варіабельні ділянки важкого ланцюга (HCVR) і дві варіабельні ділянки легкого ланцюга, де амінокислотна послідовність кожної HCVR задана послідовністю SEQ ID NO: 7 і амінокислотна послідовність кожної LCVR задана послідовністю SEQ ID NO: 8. У іншому конкретному варіанті здійснення цього винаходу запропоноване антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент, що містить важкий ланцюг (НС) і легкий ланцюг (LC), де амінокислотна послідовність НС задана послідовністю SEQ ID NO: 9 і амінокислотна послідовність LC задана послідовністю SEQ ID NO: 10. У ще більш конкретному варіанті здійснення цього винаходу запропоноване антитіло, що містить два важкі ланцюги (НС) і два легкі ланцюги (LC), де амінокислотна послідовність кожного НС задана послідовністю SEQ ID NO: 9 і амінокислотна послідовність кожного LC задана послідовністю SEQ ID NO: 10. У найбільш конкретному варіанті здійснення цього винаходу запропоноване антитіло, що 1 UA 114604 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 складається з двох НС і два LC, де амінокислотна послідовність кожного НС задана послідовністю SEQ ID NO: 9 і амінокислотна послідовність кожного LC задана послідовністю SEQ ID NO: 10. Цей винахід також пропонує фармацевтичні композиції, які містять антитіло або антигензв'язувальний фрагмент за цим винаходом, і один(-ну) або декілька фармацевтично прийнятних носіїв, розріджувачів або допоміжних речовин. Зокрема, фармацевтичні композиції за цим винаходом також містять один або декілька додаткових терапевтичних агентів. Крім того, цей винахід пропонує спосіб лікування гіперліпідемії або гіперхолестеринемії, який включає введення пацієнту, який цього потребує, ефективної кількості антитіла або антигензв'язувального фрагменту за цим винаходом. Цей винахід також пропонує антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент за цим винаходом для застосування в терапії. Більш конкретно, цей винахід пропонує антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент за цим винаходом для застосування в лікуванні гіперліпідемії або гіперхолестеринемії. Крім того, цей винахід пропонує застосування антитіла або його антигензв'язувального фрагменту за цим винаходом у виготовленні лікарського засобу для лікування гіперліпідемії або гіперхолестеринемії. Цей винахід також стосується молекул нуклеїнових кислот і векторів експресії, що кодують антитіло або антигензв'язувальний фрагмент за цим винаходом. Далі, цей винахід пропонує антитіло, одержане за певним способом, де згаданий спосіб включає (а) культивування клітинихазяїна, що містить першу полінуклеотидну послідовність, що кодує поліпептидну послідовність, задану послідовністю SEQ ID NO: 9, і другу полінуклеотидну послідовність, що кодує другу поліпептидну послідовність, задану послідовністю SEQ ID NO: 10, в таких умовах, в яких згадані поліпептидні послідовності експресуються; і (b) виділення зі згаданої клітини-хазяїна антитіла, яке містить важкий ланцюг і легкий ланцюг, де поліпептидна послідовність згаданого важкого ланцюга задана послідовністю SEQ ID NO: 9 і поліпептидна послідовність згаданого легкого ланцюга задана послідовністю SEQ ID NO: 10. Більш конкретно, антитіло, що продукується вищезгаданим способом, включає два важкі ланцюги і два легкі ланцюги, де поліпептидна послідовність кожного важкого ланцюга задана послідовністю SEQ ID NO: 9 і поліпептидна послідовність кожного легкого ланцюга задана послідовністю SEQIDNO:10. Непроцесоване антитіло являє собою молекулу імуноглобуліну, яка містить 2 важких (Н) ланцюги і 2 легких (L) ланцюги, сполучені між собою дисульфідними зв'язками. Аміно-кінцева ділянка кожного ланцюга містить варіабельну ділянку довжиною приблизно 100-110 амінокислот, яка відповідає, головним чином, за розпізнавання антигену за допомогою гіперваріабельних ділянок (CDR), які входять до її складу. Карбокси-кінцева ділянка кожного ланцюга визначає константну ділянку, яка відповідає, головним чином, за ефекторну функцію. Як відомо у цій галузі, легкі ланцюги класифікуються як каппа або лямбда, кожен з яких відрізняється конкретною константною ділянкою. Важкі ланцюги класифікуються як гамма, мю, альфа, дельта або епсилон і визначають ізотип антитіла як IgG, IgM, IgA, IgD або IgE, відповідно. IgG антитіла можуть бути додатково поділені на підкласи, наприклад, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4. Важкий ланцюг кожного типу також відрізняється конкретною константною ділянкою з послідовністю, добре відомою у цій галузі. Термін "антигензв'язувальний фрагмент" у значенні, вживаному у цьому описі, означає Fab-фрагменти, Fab'-фрагменти, F(аb')2-фрагменти і одноланцюгові Fv-фрагменти, які зв'язуються з людською PCSK9. Термін "зв'язуються (або "зв'язується") з людською PCSK9" у значенні, вживаному у цьому описі, означає взаємодію з антигенною детермінантою на людській PCSK9, що задана амінокислотною послідовністю SEQ ID NO: 14. Термін "антигенна детермінанта" у значенні, вживаному у цьому описі, означає дискретні тривимірні сайта на антигені, які розпізнаються антитілами або їх антигензв'язувальними фрагментами за цим винаходом. CDR перемежовуються більш консервативними ділянками, які називаються каркасними ділянками ("FR"). Кожна варіабельна ділянка легкого ланцюга (LCVR) і варіабельна ділянка важкого ланцюга (HCVR) складається з 3 CDR та 4 FR, які розміщуються у напрямку від амінокінця до карбоксильного кінця таким чином: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Вказані 3 CDR легкого ланцюга позначають як "LCDR1, LCDR2 і LCDR3", а 3 CDR важкого ланцюга позначають як "HCDR1, HCDR2 і HCDR3". Вказані CDR містять більшість залишків, які вступають у специфічні взаємодії з антигеном. Номенклатура і місцезнаходження амінокислотних залишків CDR у межах LCVR і HCVR антитіл або антигензв'язувальних фрагментів за цим винаходом можуть бути визначені у відповідності з добре відомою схемою нумерації, яка розроблена Кабатом (Kabat) (LCDR 1-3, HCDR2-3), або відповідно до схеми нумерації, яка розроблена Кабатом (Kabat) та Чотья (Chothia) (HCDR1). 2 UA 114604 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Методи продукування та очищення антитіл і антигензв'язувальних фрагментів є добре відомими у цій галузі, і їх можна знайти, наприклад, у Harlow and Lane (1988) Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, розділи 5-8 та 15. Наприклад, миші можуть бути імунізовані людською PCSK9 або її фрагментами, і одержані антитіла після цього можуть бути виділені та очищені, і амінокислотні послідовності можуть бути визначені із застосуванням звичайних способів, добре відомих в цій галузі. Антигензв'язувальні фрагменти також можуть бути одержані звичайними способами. Антитіло або антигензв'язувальні фрагменти за цим винаходом конструюють так, щоб вони містили одну або декілька людських каркасних ділянок довкола CDR, одержаних з нелюдського антитіла. Людські каркасні зародкові послідовності можна одержати від ImMunoGeneTics (IMGT) через веб-сайт http://imgt.cines.fr або з'ясувати з The Immunoglobulin Facts Book by Маriе-Paule Lefranc and Gerard Lefranc, Academic Press, 2001, ISBN 012441351. Зокрема, зародкові каркасні ділянки легкого ланцюга для використання у антитілі або антигензв'язувальних фрагментах за цим винаходом включають A3 та O2. Конкретні зародкові каркасні ділянки важкого ланцюга для використання у антитілі або антигензв'язувальних фрагментах за цим винаходом включають VH3-21 та VH3-23. Генно-інженерні антитіла або антигензв'язувальні фрагменти за цим винаходом можуть бути одержані і очищені з використанням відомих методів. Наприклад, послідовності кДНК, що кодують важкий ланцюг (наприклад, амінокислотна послідовність, задана послідовністю SEQ ID NO: 9) і легкий ланцюг (наприклад, амінокислотна послідовність, задана послідовністю SEQ ID NO: 10), можуть бути клоновані та введені в GS (глутамінсинтетаза) вектор експресії. Згаданим сконструйованим імуноглобуліновим вектором експресії у подальшому можуть бути стабільно трансфіковані клітини СНО. Як буде зрозуміло фахівцю у цій галузі, експресія антитіл ссавцями призведе до глікозилювання, як правило, на висококонсервативних сайтах N-глікозилювання на Fc-ділянці. Стабільні клони можуть бути перевірені на експресію антитіла, що специфічно зв'язується з людською PCSK9. Позитивні клони можуть бути розмножені в біореакторах в безсироватковому культуральному середовищі для продукування антитіл. Живильні середовища, до яких було секретоване антитіло, можуть бути очищені звичайними методами. Наприклад, середовище можна зручно завантажити до колонки з афінним сорбентом Protein А або G Sepharose FF, врівноваженої сумісним буфером, наприклад, забуференим фосфатом фізіологічним розчином. Згадану колонку промивають для видалення компонентів неспецифічного зв'язування. Зв'язане антитіло елююють, наприклад, градієнтом рН і фракції антитіла виявляють, наприклад, за допомогою SDS-PAGE (електрофорез у поліакриламідному гелі у присутності додецилсульфату натрію), після чого змішують. Антитіло може бути сконцентровано та/або відфільтроване у стерильних умовах за допомогою традиційних методів. Розчинні агрегати і мультимери можуть бути ефективно видалені за допомогою традиційних методів, у тому числі із застосуванням гель-хроматографії за розміром молекул, гідрофобного хроматографування, іонообмінного хроматографування або хроматографування на гідроксиапатитовій адсорбційній колонці. Цей продукт може бути негайно замороженим, наприклад, при температурі -70 °C або може бути підданий ліофілізації. Антитіла за цим винаходом є моноклональними антитілами. Термін "моноклональне антитіло" або "Mab" у значенні, вживаному у цьому описі, означає антитіло, яке походить з однієї копії або клону, у тому числі, наприклад, будь-якого еукаріотного, прокаріотного або фагового клону, а не спосіб, за допомогою якого воно продукується. Моноклональні антитіла та їх антигензв'язувальні фрагменти можна одержати, наприклад, за допомогою гібридомної технології, технології рекомбінантних ДНК, методу фагового дисплею, синтетичних методів, наприклад, пересадження CDR, або комбінацій таких методів чи інших методів, відомих у цій галузі. У іншому варіанті здійснення цього винаходу антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент чи нуклеїнова кислота, що його кодує, надається в ізольованій формі. У значенні, вживаному у цьому описі, термін "ізольований" означає білок, пептид або нуклеїнову кислоту, які не містять або практично не містять інших видів макромолекул, присутніх у клітинному середовищі. Термін "практично не містить" у значенні, вживаному у цьому описі, означає білок, пептид або нуклеїнову кислоту, що становить інтерес, який(яка) містить понад 80 % (моль) макромолекул згаданих видів, за варіантом, якому віддають перевагу, понад 90 %(моль), і за варіантом, якому віддають більшу перевагу, понад 95 %(моль). Антитіла або антигензв'язувальні фрагменти за цим винаходом можуть бути використані в лікуванні пацієнтів. Термін "лікування" (або "лікувати") означає уповільнення, переривання, зупинення, полегшення, припинення, зменшення або звертання розвитку або тяжкості існуючого симптому, розладу, стану або захворювання. Термін "пацієнт" у значенні, вживаному у цьому 3 UA 114604 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 описі, означає людину або ссавця, який не є людиною, але переважно означає людину. У значенні, вживаному у цьому описі, термін "ефективна кількість" означає кількість або дозу антитіла або антигензв'язувального фрагменту за цим винаходом, яка у випадку одно- чи багаторазового введення пацієнту справляє бажаний вплив на пацієнта, який зазнає лікування. Ефективна кількість може бути легко визначена лікарем, який лікує хворого та є фахівцем в цій галузі, з урахуванням ряду факторів, таких як вид ссавця, його розмір, вік і загальний стан здоров'я, конкретне захворювання, ступінь або тяжкість захворювання; реакцію конкретного пацієнта; конкретне введене антитіло; спосіб введення; характеристики біодоступності введеного препарату; схему введення дози та застосування будь-яких супутніх лікарських засобів. Антитіла або антигензв'язувальні фрагменти за цим винаходом, або фармацевтичні композиції, що їх містять, можуть бути введені парентеральними шляхами (наприклад, підшкірним, внутрішньовенним, внутрішньочеревинним, внутрішньом'язовим або черезшкірним). Фармацевтичні композиції за цим винаходом можуть бути одержані способами, добре відомими в цій галузі (наприклад, Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19 ed. (1995), A. Gennaro et al., Mack Publishing Co.), і містять антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент, як розкрито у цьому описі, і один(-у) або декілька фармацевтично прийнятних носіїв, розріджувачів або допоміжних речовин. Наприклад, антитіло або антигензв'язувальний фрагмент за цим винаходом може бути введений до складу композиції з такими агентами як цитрат натрію, лимонна кислота, полісорбат 80 та сахароза, і одержана композиція у подальшому може бути ліофілізована, і зберігатись при температурі від 2 °C до 8 °C. Вказана ліофілізована композиція у подальшому перед введенням може відновлюватись за допомогою стерильної води для ін'єкцій. Наведені нижче Приклади додатково ілюструють винахід, однак слід розуміти, що ці Приклади наведені для ілюстрації, а не для обмеження, і що фахівцем у цій галузі можуть бути здійснені різні модифікації. Приклад 1 Генно-інженерне антитіло до PCSK9 Мишу-хазяїна імунізують пептидом, який містить скорочений у С-кінцевому напрямку фрагмент людської PCSK9 (послідовність SEQ ID NO: 17), і РС8К9-зв'язувальне IgG антитіло ізолюють, і клонують з використанням звичайних методів. Гіперваріабельні ділянки ізольованого мишачого Fab рандомізують шляхом мутагенезу, і одержані антитіла піддають скринінгу на спорідненість до людської PCSK9. Мутації, які підвищують спорідненість, комбінують, і оптимізовані гіперваріабельні ділянки генно-інженерними методами вводять до складу людських каркасних ділянок важкого і легкого ланцюгів VH3-21 і A3, відповідно. Для додаткової оптимізації біофізичних властивостей гуманізованого антитіла, у межах послідовностей гіперваріабельних ділянок здійснюють цілеспрямовані заміни ароматичних і гідрофобних амінокислот. Бібліотеки рандомізованих гіперваріабельних ділянок також піддають скринінгу на додаткові мутації, які підвищують спорідненість. Корисні мутації гіперваріабельних ділянок довільно комбінують і експресують, і одержані антитіла піддають скринінгу на спорідненість до людської PCSK9. Одержують непроцесоване гуманізоване і оптимізоване антитіло до PCSK9, яке має такі амінокислотні послідовності: Фрагмент mAb HCDR1 HCDR2 HCDR3 HCVR не LCDR1 LCDR2 LCDR3 LCVR LC 45 Амінокислотна послідовність SEQ ID NO: 1 SEQ ID NO: 2 SEQ ID NO: 3 SEQ ID NO: 7 SEQ ID NO: 9 SEQ ID NO: 4 SEQ ID NO: 5 SEQ ID NO: 6 SEQ ID NO: 8 SEQ ID NO: 10 Відповідні послідовності кДНК, які кодують амінокислотні послідовності SEQ ID NO: 9 і SEQ ID NO: 10 важкого і легкого ланцюгів, відповідно, виглядають так: 4 UA 114604 C2 Фрагмент mAb НС LC 5 10 15 20 25 30 35 40 Послідовність кДНК, що кодує SEQIDNO:11 SEQ ID NO: 12 Приклад 2 Експресія генно-інженерного антитіла до PCSK9 Згадане генно-інженерне антитіло до PCSK9 Прикладу 1 може бути експресованим у стабільно трансфікованій лінії клітин СНО. Для трансфікування шляхом електропорації лінії клітин яєчнику китайського хом'ячка, CHOK1SV (компанія Lonza Biologies PLC, Slough, Великобританія), використовують глутамінсинтетазний (GS) вектор експресії, який містить кДНК з послідовностями SEQ ID NO: 11 (що кодує амінокислотну послідовність SEQ ID NO: 9 важкого ланцюга) і SEQ ID NO: 12 (що кодує амінокислотну послідовність SEQ ID NO: 10 легкого ланцюга). Вектор експресії кодує ранній промотор SV (мавпячий вірус 40Е) і ген GS. Експресія GS забезпечує біохімічний синтез глютаміну (амінокислоти, яка є необхідною для клітин лінії CHOK1SV). Після завершення трансфекції, клітини піддають змішаній селекції з 50 мкМ Lметіонінсульфоксиміну (MSX). Інгібування GS MSX застосовують для підвищення переконливості селекції. Клітини з інтегрованою кДНК вектора експресії в транскрипційно активні ділянки геному клітини-хазяїна можуть відбиратись проти клітин лінії CHOK1SV дикого типу, які експресують ендогенний рівень GS. Змішану культуру піддають одноклітинному клонуванню із застосуванням технології FACS (клітинний сортер зі збудженням флуоресценції); клональні лінії клітин розмножують, і піддають скринінгу на експресію генно-інженерного антитіла до PCSK9 Прикладу 1. Приклад 3 Зв'язування антигенної детермінанти РСSK9-зв'язувальну антигенну детермінанту мишачого IgG (з якого одержали генноінженерне антитіло до PCSK9 Прикладу 1) визначають шляхом екстрагування антигенної детермінанти і мас-спектрометрії на основі воднево-дейтерієвого обміну, та звужують до ділянки в межах лінійної амінокислотної послідовності 160-181 каталітичного домену людської PCSK9 (нумерація амінокислот грунтується на непроцесованій послідовності людської PCSK9 з включенням сигнального пептиду довжиною у двадцять вісім амінокислот). Взаємодія генноінженерного антитіла Прикладу 1 з цією антигенною детермінантою в каталітичному домені людської PCSK9 підтверджується оцінкою його зв'язування з синтетичними пептидами, які відповідають залишкам 160-181 (Таблиця 1). Вказане генно-інженерне антитіло Прикладу 1 зв'язує пептид 160-181 з більшою спорідненістю, ніж інтактну людську PCSK9, причому згадану різницю стимулює більш висока швидкість асоціації (kon). Швидкість дисоціації (koff) знаходиться в межах 2-кратній швидкості дисоціації інтактної PCSK9, що дозволяє висунути припущення про те, що сили взаємодії (після завершення зв'язування) є подібними. Крім того, ці дані дозволяють припустити, що майже всі зв'язувальні детермінанти вміщені у межах цієї лінійної ділянки PCSK9. Зв'язування генно-інженерного антитіла Прикладу 1 з пептидом 166-181 є значно слабшим, ніж з пептидом 160-181, що демонструє роль амінокислоти (або декількох амінокислот) в межах ділянки 160-165. Зв'язування генно-інженерного антитіла Прикладу 1 з пептидом 163-174 було значно сильнішим, аніж з 166-181, що також дозволяє припустити внесок від залишків 163-165. 5 UA 114604 C2 Таблиця 1: Кінетика зв'язування та спорідненість антитіла Прикладу 1 до пептидів, що відповідають послідовностям каталітичного домену людської PCSK9 Фрагмент PCSK9 Послідовність С-кінцевий His зрілої hPCSK9* (SEQ ID NO: 13) HPCSK9 160-181** hPCSK9 166-181** hPCSK9 163-174** RITPPRYRADEYQPPDGGSLVE (SEQ ID NO: 14) YRADEYQPPDGGSLVE (SEQ ID NO: 15) PPRYRADEYQPP (SEQ ID NO: 16) kon (1/Mc) Koff (1/c) KD (hM) 8,67E+04 1,50E-04 1,8 1,45E+06 2,42E-04 0,17 4,58E+06 1,56E-01 2,75E+06 8,31E-03 34 3,0 * Використана hPCSK9 являє собою зрілу форму, яка не містить сигнального пептиду з двадцяти восьми амінокислот, і яка містить С-кінцеву His-мітку. ** Нумерація амінокислот відповідає повній людській PCSK9 з сигнальним пептидом довжиною у двадцять вісім амінокислот. 5 10 15 Приклад 4 Кінетика зв'язування і спорідненість Для оцінки кінетики зв'язування і спорідненості досліджуваного антитіла до PCSK9 Прикладу 1, до PCSK9 людей, макак-крабоїдів, мишей, пацюків і кролів застосовують відомий в цій галузі поверхневий плазмонний резонанс (SPR). В умовах фізіологічної буферної системи (іонна сила і рН) і температури (37 °C), генно-інженерне антитіло Прикладу 1 зв'язується з людською PCSK9 5 -1 -1 з середньою швидкістю асоціації (kon) 1,2 × 10 М с і середньою швидкістю дисоціації (koff) 1,2 × -3 -1 10 с . Було визначене значення KD зв'язування людської PCSK9 для генно-інженерного антитіла Прикладу 1, яке становить приблизно 11 нМ. Генно-інженерне антитіло Прикладу 1 5 -1 -1 зв'язується з PCSK9 макак-крабоїдів з середньою швидкістю асоціації (kon) 1,1 × 10 M c -3 -1 середньою швидкістю дисоціації (koff) 2,5×10 с , наслідком чого є значення KD зв'язування PCSK9 макак-крабоїдів на рівні приблизно 25 нМ. У наведеній нижче Таблиці 2 представлені узагальнені додаткові результати, одержані з генно-інженерним антитілом до PCSK9 Прикладу 1 із застосуванням PCSK9 мишей, пацюків і кролів. Ці дані показують, що генно-інженерне антитіло до PCSK9 Прикладу 1 при фізіологічних значеннях рН, іонної сили і температури зв'язується з PCSK9 як людей, так і макак-крабоїдів з наномольною спорідненістю. Таблиця 2: Кінетика зв'язування і спорідненість антитіла до PCSK9 Прикладу 1 до PCSK9 людини, макак-крабоїдів, мишей, пацюків і кролів Антиген Людська PCSK9* PCSK9 макак-крабоїдів* PCSK9 мишей** PCSK9 пацюків** PCSK9 кролів ** Kon Середнє ± середнє квадратичне відхилення -1 -1 5 М с (10 ) Koff Середнє ± середнє квадратичне відхилення -1 -3 с (10 ) KD Середнє ± середнє квадратичне відхилення нМ n 1,2±0,46 1,1±0,51 NB NB NB 1,2±0,18 2,5±0,79 NB NB NB 11±2,9 25±6,8 NB NB NB 6 4 3 2 3 "NB" Зв'язування не виявлено; * Аналіз проводили при температурі 37°С; ** Аналіз проводили при температурі 25°C 6 UA 114604 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Приклад 5 Інгібування зв'язування PCSK9 з рецептором LDL PCSK9 регулює плазмовий рівень LDL-C шляхом зниження вмісту LDLR печінки і тим самим зменшення поглинання LDL гепатоцитами. Каталітичний домен PCSK9 являє собою сайт, який зв'язується з LDLR. Таким чином, очікується, що антитіла, які розпізнають каталітичний домен PCSK9, будуть інгібувати зв'язування PCSK9 з LDLR. Для визначення впливу досліджуваного антитіла до PCSK9 на зв'язування PCSK9 з рецептором LDL застосовували дослідження за методикою AlphaLISA®. Рекомбінантна непроцесована PCSK9, що використовується при проведенні дослідження, експресується в стабільній клітинній лінії НЕК (лінія клітин нирки людського зародку) 293 у вигляді С-кінцевого His-міченого білка (Qian etal., J. Lipid Res. 48: 1488-1498, 2007). Екстрацелюлярний домен рекомбінантного рецептора LDL експресується в тимчасово трансфікованих клітинах лінії НЕК 293Е клітин як С-кінцевий FLAG-мічений білок (Qian et al., J. Lipid Res. 48: 1488-1498, 2007). Мишаче анти-PCSK9 Mab, яке зв'язується з С-кінцевим доменом людської PCSK9, експресується в клітинах лінії НЕК293, і очищається на колонці з афінним сорбентом Protein-G, з подальшою обробкою на колонці Superdex 200. Моноклональне анти-FLAG® ВіоМ2 антитіло (компанія Sigma) являє собою очищене мишаче IgGl моноклональне антитіло, ковалентно зв'язане з біотином гідразидним зв'язком. Анти-FLAG® ВіоМ2 буде розпізнавати послідовність FLAG на N-кінці, Met-N-кінці або С-кінці FLAG гібридних білків. Анти-FLAG® ВіоМ2 може бути виявлений за допомогою авідинових або стрептавідинових кон'югатів. Моноклональне антиFLAG® ВіоМ2-біотин антитіло постачається в розчині, до складу якого входить 50 % гліцерину, 10 мМ фостфату натрію, рН 7,25, 150 мМ NaCl, та який містить 0,02 % азиду натрію, і зберігається при температурі -20 °C. Експерименти за методикою AlphaLISA® проводять в 384-лункових білих планшетах ProxiPlate (компанія Perkin Elmer) з використанням як буфера 25 мМ HEPES, рН 7,5, 100 мМ NaCl, 2,5 мМ СаСl2, 0,5 % ТХ-100, 0,1 % казеїну, 1 мг/мл декстрану-500 і 0,05 % Proclin-300. При проведенні досліджень використовують донорні гранули AlphaLISA® Streptavidin (компанія Perkin Elmer) і акцепторні гранули мишачого анти-PCSK9 Mab, кон'югованого з AlphaLISA®. Коли гранули опиняються у безпосередній близькості завдяки взаємодії партнерів зв'язування, PCSK9 і LDLR, синглетний кисень передається від донорних гранул на акцепторні гранули. У разі лазерного збудження при 680 нм, синглетний кисень збуджує випромінювання світла акцепторною гранулою. Акцепторні гранули зв'язуються з мишачим анти-РСSK9 Mab шляхом відновного амінування з використанням NaBH3CN (компанія Sigma), і зберігаються при температурі 4 °C. Акцепторні гранули, кон'юговані з мишачим анти-PCSK9 Mab (22 мкг/мл), попередньо навантажуються 2,22 нМ розчином PCSK9 протягом однієї години. Донорні гранули (44 мкг/мл) попередньо навантажуються 5,55 нМ розчином анти-FLAG® ВіоМ2 і 2,22 нМ розчином FLAG-міченого LDLR протягом однієї години. Після завершення попереднього навантаження, 2 мкл досліджуваного антитіла до PCSK9 або контрольного IgG додають до планшету ProxiPlate, що містить 9 мкл суміші кожних гранул (кінцева концентрація PCSK9 і LDLR=1 нМ) за допомогою повністю автоматизованої піпетки Multimek (компанія Beckman), і залишають для зв'язування впродовж ночі при кімнатній температурі. Сигнал AlphaLISA® (кількість імпульсів на секунду) вимірюють за допомогою Envision Turbo (компанія Perkin Elmer). Всі експерименти з проведенням дослідження AlphaLISA® здійснюють за умов низької освітленості. Після проведення процедур по суті як описано вище зв'язування людської PCSK9 з LDLR при дослідженні AlphaLISA® зростає у залежності від концентрації PCSK9. Додавання генноінженерного антитіла до PCSK9 Прикладу 1 (досліджуване антитіло до PCSK9) спричинює пов'язане з концентрацією і повне інгібування зв'язування PCSK9 з LDLR, з середнім значенням ІС50 на рівні приблизно 90 пМ. Контрольний IgG4 у цьому дослідженні не демонструє ефективності. Результати цього дослідження показують, що генно-інженерне антитіло до PCSK9 Прикладу 1 інгібує зв'язування людської PCSK9 з LDLR. Приклад 6 Інгібування функціонування PCSK9 на клітинах HepG2 Для визначення впливу досліджуваного антитіла до PCSK9 на густину LDLR на гепатоцитах, людські клітини HepG2 культивують в колбах Т75, покритих полі-D-лізином. Через 24 год. клітини висівають з розрахунку 5000 клітин/лунку в 100 мкл середовища DMEM/F-12 (3:1), яке містить 5 % (у об'ємному відношенні) людської ліпопротеїн-дефіцитної сироватки (LPDS; компанія Intracel), на 96-лункові чорні планшети (компанія Becton-Dickinson), сенсибілізовані полі-D-лізином. Після інкубації протягом ночі в середовищі, яке містить LPDS, клітини впродовж 7 UA 114604 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 2 год. інкубують з 69 нМ (5 мкг/мл) His-міченої на С-кінці рекомбінантної людської PCSK9 і досліджуваним антитілом до PCSK9 або контрольним IgG4 антитілом при концентраціях у межах від 2,6 нМ до 1333 нМ. Всі інкубації проводять при температурі 37 °C. Рівні LDLR контролюють за допомогою антитіла до LDLR (компанія Progen), флуоресцентно міченого за допомогою набору для мічення Zenon® Alexa Fluor® 488 Mouse IgG2b Labeling Kit (компанія Invitrogen). Клітини інкубують з ідентифікуючим антитілом протягом 90 хв при кімнатній температурі, після чого фіксують протягом 10 хв за допомогою фіксатора без формаліна (Prefer; компанія ANATECH, Ltd) з подальшим підвищенням коефіцієнту проникності в 0,01 % розчині Triton X-100. Клітини забарвлюють йодидом пропідію (10 мкг/мл) (компанія Invitrogen) для визначення загальної кількості клітин. Кількісне визначення сигналу LDLR здійснюють за допомогою лазерного сканувального мікропланшетного цитометру - детектору флуоресценції Acumen Explorer™ (компанія ТТР LabTech). Після проведення процедур по суті як описано вище людська PCSK9 викликає залежне від концентрації зменшення рівня LDLR на клітинах HepG2 зі значенням ЕС50, яке становить 18 нМ. Генно-інженерне антитіло до PCSK9 Прикладу 1 (досліджуване антитіло до PCSK9) інгібує РСSK9-індуковане пригнічення LDLR на клітинах HepG2 з ІС50, яке становить 104 нМ. Людський контрольний IgG4 був відносно неактивним при концентраціях до 1333 нМ. Ці дані показують, що генно-інженерне антитіло до PCSK9 Прикладу 1 інгібує РСSK9-опосередкований розкладання LDLR. Приклад 7 Інгібування РСSK9-індукованого зниження поглинання LDL Для визначення впливу досліджуваного антитіла до PCSK9 на поглинання LDL, клітини HepG2 висівають з розрахунку 5000 клітин/лунку в 100 мкл середовища DMEM/F-12 (3:1), доповненого 5 % LPDS, на 96-лункові чорні планшети, сенсибілізовані полі-D-лізином, і інкубують при температурі 37 °C в атмосфері 5 % СО2 протягом 18 год. Людську PCSK9 (69 нМ) додають до клітин з досліджуваним антитілом до PCSK9 або без досліджуваного антитіла до PCSK9, або до клітин з людським контрольним IgG4 при концентраціях у межах від 2,6 нМ до 1333 нМ, і піддають попередній інкубації з клітинами протягом 2 год. при температурі 37 °C. Після додавання 100 нг/лунку флуоресцентно міченого LDL (BODIPY-LDL, компанія Invitrogen), клітини інкубують протягом 4 год. при температурі 37 °C. Клітини при кімнатній температурі протягом 10 хв фіксують за допомогою фіксатора без формаліна (Prefer; компанія ANATECH, Ltd). Після подвійного промивання клітин за допомогою PBS, коефіцієнт проникності клітин підвищують за допомогою забуференого фосфатом фізіологічного розчину, що містить 0,01 % Triton Х-100, протягом 15 хв при кімнатній температурі, і забарвлюють йодидом пропідію (10 мкг/мл) для визначення загальної кількості клітин. Поглинання LDL визначають за допомогою лазерного сканувального флуоресцентного мікропланшетного цитометру Acumen Explorer™, і виражають у вигляді відсотку флуоресцентних клітин відносно загальної кількості клітин. Реакцію на досліджуване антитіло до PCSK9 або контрольний IgG виражають, як відсоткове інгібування PCSK9, тобто відсоток повернення до максимального поглинання LDL при відсутності PCSK9 по відношенню до вихідного поглинання LDL-C у присутності лише PCSK9. Також обчислюють відповідні значення ІС50 для інгібування РСSK9-індукованого зниження поглинання LDL. Після проведення процедур по суті як описано вище людська PCSK9 викликає залежне від концентрації зменшення поглинання LDL на клітинах HepG2 зі значенням ЕС50, що дорівнює 32 нМ. Генно-інженерне антитіло до PCSK9 Прикладу 1 звертає РСSK9-індуковане інгібування, що відображається як підвищене поглинання LDL, у той час як контрольний IgG4 не звертає інгібування. Зокрема, генно-інженерне антитіло до PCSK9 Прикладу 1 демонструє середнє максимальне відсоткове інгібування PCSK9, яке становить 84 % і середнє значення ІС50, яке становить 194 нМ. Ці дані показують, що генно-інженерне антитіло до PCSK9 Прикладу 1 інгібує РСSK9-індуковане зниження поглинання LDL. Приклад 8 Ефективність in vivo Для визначення in vivo фармакокінетичної (РK) та/або фармакодинамічної (PD) дії досліджуваного антитіла до PCSK9, це досліджуване антитіло може бути введено звичайним макакам-крабоїдам з подальшим визначенням певних РK та/або PD параметрів. Наприклад, досліджуване антитіло до PCSK9 може бути введено внутрішньовенним або підшкірним шляхом здоровим, "наївним" макакам-крабоїдам, і сироваткові концентрації вказаного досліджуваного антитіла можуть у подальшому бути виміряні за допомогою дослідження сендвіч-ELISA з людським IgG. Сироваткові концентрації, виміряні в різних часових точках після введення антитіла, можуть використовуватись для визначення різних РK параметрів вказаного 8 UA 114604 C2 5 досліджуваного антитіла, в тому числі Τ1/2, Сmах, AUC і плазмового кліренсу (CL). Так само, досліджуване антитіло до PCSK9 може бути введено внутрішньовенним або підшкірним шляхом здоровим, "наївним" макакам-крабоїдам, і сироваткові концентрації LDL-C можуть бути виміряні nd за допомогою аутоаналізатору (Direct LDL-C Plus, 2 Gen., компанія Roche Diagnostics). Після проведення процедур по суті як описано вище фармакокінетичні параметри генноінженерного антитіла до PCSK9 Прикладу 1 оцінюють на здорових макаках-крабоїдах після внутрішньовенного введення однієї дози 1 мг/кг, 5 мг/кг або 15 мг/кг і після однієї підшкірної дози 5 мг/кг. Фармакокінетичні параметри, виміряні при проведенні цих досліджень, представлені у наведеній нижче Таблиці 3. 10 Таблиця 3 Фармакокінетичні параметри генно-інженерного антитіла до PCSK9 Прикладу 1 у макак-крабоїдів. Доза (мг/кг) 1 5 15 Доза (мг/кг) 5 15 20 25 30 35 40 Т1/2 (дні) 5,4±1,0 7,3±1,3 8,4±3,0 Tmax (дні) 2,7±0,6 Внутрішньовенно n = 4/групу) AUCtotal Cmах (мкг/мл) (годмкг/мл) 19,8±1,1 2218±222 107,3±3,2 14378±1374 260,3±45,0 57290±16535 Підшкірно (n = 3/групу) AUCtotal Cmax Т1/2 (мкг/мл) (дні) (годмкг/мл) 32,4±1,9 5,4±0,7 11575±1345 CL (мл/год./кг) 0,45±0,04 0,35±0,04 0,28±0,07 CL/F (мл/год/кг) 0,44±0,05 %F 81 Сироватковий рівень LDL визначають після введення генно-інженерного антитіла до PCSK9 Прикладу 1 у двох незалежних дослідженнях. В обох дослідженнях, ознаки пригнічення рівня LDL-C було очевидними через 24 год. після введення генно-інженерного антитіла до PCSK9 Прикладу 1. Після внутрішньовенного (i.v.) введення антитіла Прикладу 1 у дозі 5 мг/кг, спостерігалось максимальне середнє зниження рівня LDL-C на 60 % (дослідження 1) і 25 % (дослідження 2). При внутрішньовенному введенні дози 5 мг/кг, середнє пригнічення рівня LDLC зберігалось протягом приблизно 8 тижнів (дослідження 1) і 2 тижнів (дослідження 2). При проведенні дослідження 2, спостерігався незначний вплив дози (від 1 мг/кг до 15 мг/кг) на величину пригнічення LDL-C (від 25 % до 35 %). Вплив дози на тривалість пригнічення LDL-C був більш очевидним. При введенні підшкірним шляхом (5 мг/кг), ефективність генноінженерного антитіла Прикладу 1 щодо пригнічення рівнів LDL-C була подібною до ефективності, яка спостерігається після внутрішньовенного введення. Після введення генноінженерного антитіла Прикладу 1 у будь-якій дозі, будь-якого впливу на сироваткові рівні холестерину ліпопротеїнів високої густини не спостерігалось. Приклад 9 Фізико-хімічні властивості генно-інженерного антитіла до PCSK9 Було також встановлено, що генно-інженерне антитіло до PCSK9 Прикладу 1 має хорошу розчинність, хімічну стабільність і фізичну стабільність. А. Розчинність Для забезпечення можливості зручного введення дози бажаною є достатньо висока розчинність. Наприклад, 1 мг/кг доза на 1,0 мл ін'єкцію пацієнту масою 100 кг буде потребувати розчинності на рівні 100 мг/мл. Бажаним також є зберігання антитіла в мономерному стані без агрегування високомолекулярних сполук (HMW) при високій концентрації. Для визначення розчинності досліджуваного антитіла, антитіло може бути діалізовано в (1) в розчині 10 мМ цитрату, рН 6, (2) розчині 10 мМ цитрату, рН 6, 150 мМ NaCl, і (3) забуференому фосфатом фізіологічному розчині (PBS), рН 7,4. Відновлений діалізат у подальшому може бути проаналізований за допомогою аналітичної гель-хроматографії за розміром молекул (SEC) для визначення відсотка HMW. У подальшому досліджуване антитіло може бути сконцентроване в 4 мл центробіжному концентраторі при температурі ~ 25 °C до досягнення межі розчинності або порового об'єму концентратора. У раз досягнення порового об'єму, дані про концентрацію надають як значення, яке є більшим або дорівнює вказаному. Концентроване антитіло після цього може бути проаналізоване засобами SEC для визначення відсотка HMW. Для визначення 9 UA 114604 C2 5 того, чи є будь-яке збільшення % HMW після концентрації оборотним, концентрований зразок може бути розбавлений до 1 мг/мл і проаналізований методом SEC. Після проведення процесів по суті як описано вище генно-інженерне антитіло до PCSK9 Прикладу 1 при всіх умовах досліджуванння демонструвало розчинність, що перевищує 128 мг/мл. Крім того, при високій концентрації були присутні лише низькі рівні HMW. Таблиця 4: Відсоток HMW в розчинних зразках, визначений за допомогою SEC 10 мМ цитратний буфер, рН 6 10 мМ цитратний буфер, 150 мМ NaCl, рН6 PBS, рН 7,4 10 15 %HMW (діалізат) 0,75 % %HMW (концентрат) 1,60 % % HMW (розведення 1 мг/мл) 0,93 % 0,62 % 1,39 % 0,90 % 0,94 % 2,00 % 1,34 % В. Хімічна стабільність Хімічна стабільність сприяє розробці лікарських композицій з достатнім строком придатності. Для оцінки хімічної стабільності досліджуваного антитіла, вказане антитіло може бути введене до складу композиції в концентрації 1 мг/мл в 10 мМ цитратному буфері при рН 4, рН 5, рН 6 або рН 7. Після цього зразки композиції інкубують протягом 4 тижнів при температурі 4 °C, 25 °C і 40 °C під час дослідження прискореного розкладання. Зміни зарядового профілю антитіла, які відображають хімічні зміни, можуть бути оцінені із застосуванням капілярного ізоелектрофокусування (cIEF) у відповідності зі стандартними методиками. При дослідженні хімічної стабільності генно-інженерного антитіла Прикладу 1, після здійснення дослідження за методиками по суті так як описано вище, були одержані наведені нижче результати. Таблиця 5: Хімічна і стабільність, визначена із застосуванням cIEF Зміна % головного піку через (зберігання при температурі 25 °C) 10 мМ цитратний буфер, рН 5 10 мМ цитратний буфер, рН 6 10 мМ цитратний буфер, рН 7 20 25 30 35 4 тижні (у порівнянні з 4 °C) (зберігання при температурі 40 °C) -0,4 Не випробували -4,1 -24,7 -7,7 Не випробували Результати показують, що після 4 тижнів зберігання при температурі 25 °C, % головного піку зменшується лише на 4,1 процентних пункти, у випадку одержання композиції при значенні рН 6 (звичайний рівень рН, що застосовується у композиції на основі антитіла), що вказує на те, що генно-інженерне антитіло до PCSK9 Прикладу 1 має достатню хімічну стабільність, щоб сприяти розробці рідких композицій з прийнятним строком придатності. Крім того, згадане антитіло також демонструє хорошу хімічну стабільність при рН5 і, меншою мірою, при рН7, що вказує на те, що антитіло має характеристики стабільності, які надають можливість одержання композицій в певному діапазоні рН. С. Фізична стабільність Для оцінки фізичної стабільності досліджуваного антитіла, згадане антитіло може бути введене у композицію в концентрації 1 мг/мл в 10 мМ цитратному буфері при рН 4, рН5, рН6 або рН7 (або 10 мМ Трис-буфері, рН 8). Після цього, під час дослідження прискореного розкладання зразки інкубують протягом 4 тижнів при температурі 4 °C, 25 °C і 40 °C. Після інкубації фізичну стабільність оцінюють із застосуванням гель-хроматографії за розміром молекул (SEC), яка відокремлює бажане мономерне антитіло від агрегованого високомолекулярного (HMW) антитіла. У Таблиці 6 наведені результати дослідження фізичної стабільності генно-інженерного антитіла до PCSK9 Прикладу 1 після здійснення дослідження за методиками по суті так як описано вище. Дані показують, що при рН 5, рН 6 і рН 7, зміна HMW протягом 4 тижнів при 10 UA 114604 C2 температурі 25 °C або 40 °C була менше ніж 1 %, що вказує на те, що це антитіло має хорошу фізичну стабільність, і є стійким до самоасоціації та агрегації. Таблиця 6: Відсоток HMW фізично стабільних зразків Вихідний зразок 25 °C впродовж 4 тижнів 40 °C впродовж 4 тижнів рН4 0,26 0,37 20,34 % HMW, визначений за допомогою SEC рН5 рН6 рН7 0,32 0,40 0,50 0,44 0,51 0,66 1,15 1,02 1,32 5 11 рН8 1,31 2,10 3,41 UA 114604 C2 12 UA 114604 C2 13 UA 114604 C2 14 UA 114604 C2 15 UA 114604 C2 16 UA 114604 C2 17 UA 114604 C2 18 UA 114604 C2 19 UA 114604 C2 20 UA 114604 C2 21 UA 114604 C2 22 UA 114604 C2 23 UA 114604 C2 24 UA 114604 C2 25 UA 114604 C2 26 UA 114604 C2 27 UA 114604 C2 ФОРМУЛА ВИНАХОДУ 5 10 15 1. Антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент, що містить варіабельну ділянку важкого ланцюга (HCVR) і варіабельну ділянку легкого ланцюга (LCVR), де HCVR містить гіперваріабельні ділянки (CDR) HCDR1, HCDR2 і HCDR3, a LCVR містить CDR LCDR1, LCDR2 і LCDR3, де амінокислотна послідовність HCDR1 задана послідовністю SEQ ID NO: 1, амінокислотна послідовність HCDR2 задана послідовністю SEQ ID NO: 2, амінокислотна послідовність HCDR3 задана послідовністю SEQ ID NO: 3, амінокислотна послідовність LCDR1 задана послідовністю SEQ ID NO: 4, амінокислотна послідовність LCDR2 задана послідовністю SEQ ID NO: 5 і амінокислотна послідовність LCDR3 задана послідовністю SEQ ID NO: 6, причому згадане антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент зв'язується з людською пропротеїнконвертазою субтилізин/кексинового типу 9 (PCSK9). 2. Антитіло або антигензв'язувальний фрагмент за п. 1, що містить варіабельну ділянку важкого ланцюга (HCVR) і варіабельну ділянку легкого ланцюга (LCVR), де амінокислотна послідовність HCVR задана послідовністю SEQ ID NO: 7 і амінокислотна послідовність LCVR задана послідовністю SEQ ID NO: 8. 28