Застосування композиції, яка містить ферментований грибками роду penicillium сир, в профілактиці або терапії інфекцій, запалень або запальних уражень, спосіб одержання екстракту з вказаного сиру

Реферат: UA 114605 C2 (12) UA 114605 C2 Винахід стосується застосування композиції, яка містить ферментований грибками роду Penicillium сир, екстракт сиру і/або харчовий продукт, напій або добавку, що містять сир або екстракт сиру, для профілактики або терапії інфекцій, запалень або запальних уражень; застосування такої композиції у виробництві лікарського засобу; способу одержання вказаного екстракту сиру. UA 114605 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Область техніки Даний винахід належить до харчових, косметичних, профілактичних і терапевтичних застосувань харчових грибків, продуктів ферментації та їх екстрактів. Винахід має відношення, зокрема, до зниження підвищених рівнів холестерину й/або тригліцеридів, а також до терапії або профілактики інфекцій, запалень, запальних уражень, атеросклерозу, хвороб серця, запальних процесів у шлунку, кишечнику й печінці, а також їх ускладнень, і до ініціювання або стимулювання регенерації або загоєння ран, опіків, виразок або інших форм порушень в уражених або в постарілих тканинах. Рівень техніки Хронічні запальні процеси в печінці й жирових тканинах приводять до ліпідних розладів і метаболічного синдрому. Хронічні запалення в інших тканинах також мають багато клінічних проявів, включно атеросклероз, серцево-судинні захворювання, ожиріння, діабет 2-го типу, рак, саркопенію, гастрит, виразку шлунка або дванадцятипалої кишки, артрит, дерматологічні захворювання й старіння шкіри та інших органів. Є багато повідомлень, що зв'язують розвиток таких станів з наявністю інфекції Chlamydia. Про механізми, за допомогою яких інфекція Chlamydia може досягти печінки, привести до змін ліпідного обміну й служити тригером для окисних каскадів, недавно повідомлялося в [5-10]. У контролюванні запальних реакцій і процесів інфікування важливу роль відіграють цитокіни й, зокрема, інтерлейкіни, лімфокіни й інтерферони. Запальні окисні ураження можуть бути наслідком бактеріальної інфекції або активності аутоіммунних антитіл, або наявності інших токсичних факторів, або проявляються, коли запалення досягає критичного рівня. Ураження клітинних оболонок можуть привести до вивільнення вмісту клітини в позаклітинне середовище. Клітинний вміст може включати протеази, інші компоненти, що розщеплюють ферменти й кислотні внутрішньоклітинні компоненти. Випуск клітинного вмісту в позаклітинне середовище може привести, крім того, до ураження клітинних мембран і внутрішньоклітинного матрікса. Крім того, локальне зрушення pH у кислу сторону може змінити активність супероксидцісмутази й інших білків з подібними структурними й каталітичними властивостями [3-4]. Стани, що включають запалення й запальне ураження, мають усе більш зростаючу важливість. Ступінь поширеності хвороб серця й діабету постійно збільшується, у тому числі й внаслідок високого рівня поширеності ожиріння. Короткий опис сутності винаходу Автори даного винаходу виявили, що харчові грибки і їх продукти ферментації мають цілий ряд корисних біологічних властивостей, що не описувалися раніше, включаючи антибактеріальні, протизапальні й антиокислювальні властивості, а також здатність стимулювати регенерацію тканин. Ефект спостерігається, зокрема, із грибками, використовуваними при виготовленні блакитного й білого, одержуваного за допомогою грибкової ферментації сиру, або інших харчових продуктів, для яких використовуються такі грибки. Описані тут композиції можуть, наприклад, послабити або інгібувати в індивідуума інфекцію, запалення або окиснення, включаючи запальні окисні ураження, або послабити чи інгібувати виникнення в індивідуума, тривалість або важкість одного чи декількох симптомів, пов'язаних з інфекцією, запаленням або окисненням, або знизити ризик індивідуума постраждати від інфекції, запалення або окиснення, або ж одного чи декількох пов'язаних із цим симптомів. Дані композиції можуть застосовуватися для зниження рівня холестерину й, отже, допомагати в скороченні частоти проявів, або в затримуванні виникнення хвороб серця, а також сприяти у відновленні після хвороб серця, зокрема, після інфаркту міокарда. Даний винахід може застосовуватися, зокрема, для зниження в індивідуума підвищених рівнів холестерину й/або тригліцеридів. В одному переважному втіленні винахід може застосовуватися для зниження або зменшення рівня холестерину й/або тригліцеридів і, зокрема, для зниження підвищених рівнів холестерину й/або тригліцеридів, включаючи суб'єктів, відомих, як таких, що мають атеросклероз і/або хворобу серця, але також і здорових суб'єктів. З урахуванням того, що сир сприймається як високожирний продукт, таке знаходження виявляється несподіваним. Композиції й способи винаходу можуть також застосовуватися для запобігання, ослаблення або лікування інфекцій. Таким чином, передбачається застосування даного винаходу в профілактиці або терапії інфекцій, запалень, запальних уражень, окисних уражень, атеросклерозу, хвороб серця, запальних станів шлунка, кишечнику або печінки, або їх ускладнень, в ініціюванні або 1 UA 114605 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 стимулюванні регенерації або загоєння, або в зниженні підвищених рівнів холестерину й/або тригліцеридів. Відповідно, даний винахід забезпечує композицію, що містить: (і) популяцію клітин і/або спор харчових грибків; (іі) харчову матрицю, що містить популяцію клітин і/або спор харчових грибків; і/або (ііі) екстракт, продукт ферментації або метаболіт (і) або (іі), призначену для застосування в профілактиці або терапії інфекцій, запалень, запальних уражень, окисних уражень, атеросклерозу, хвороб серця, запальних станів шлунка, кишечнику або печінки, або їх ускладнень, в ініціюванні або стимулюванні регенерації або загоєння, або в зниженні підвищених рівнів холестерину й/або тригліцеридів. Винахід, крім того, забезпечує застосування композиції, що містить: (і) популяцію клітин і/або спор харчових грибків; (іі) харчову матрицю, що містить популяцію клітин і/або спор харчових грибків; і/або (ііі) екстракт, продукт ферментації або метаболіт (і) або (іі), для виготовлення лікарського препарату, призначеного для профілактики або терапії інфекцій, запалень, запальних уражень, окисних уражень, атеросклерозу, хвороб серця, запальних станів шлунка, кишечнику або печінки, або їх ускладнень, ініціювання або стимулювання регенерації або загоєння, або для зниження підвищених рівнів холестерину й/або тригліцеридів. Даний винахід, крім цього, надає спосіб профілактики або терапії інфекцій, запалень, запальних уражень, окисних уражень, атеросклерозу, хвороб серця, запальних станів шлунка, кишечнику або печінки, або їх ускладнень, ініціювання або стимулювання регенерації або загоєння, або зниження підвищених рівнів холестерину й/або тригліцеридів, при цьому такий спосіб містить уведення індивідуумові, що має потребу в цьому композиції, яка містить: (і) популяцію клітин і/або спор харчових грибків; (іі) харчову матрицю, що містить популяцію клітин і/або спор харчових грибків; і/або (ііі) екстракт, продукт ферментації або метаболіт (і) або (іі). Винахід, крім того, пропонує сир, що виготовляється із застосуванням грибків, екстракт із такого сиру або харчові продукти, напої або добавки, що містять такий сир або екстракт, для застосування в профілактиці або терапії інфекцій, запалень, запальних уражень, окисних уражень, атеросклерозу, хвороб серця, запальних станів шлунка, кишечнику чи печінки, або їх ускладнень, в ініціюванні або стимулюванні регенерації або загоєння, або в зниженні підвищених рівнів холестерину й/або тригліцеридів. У ще одному втіленні винахід забезпечує спосіб одержання екстракту, призначеного для застосування в профілактиці або терапії інфекцій, запалень, запальних уражень, окисних уражень, атеросклерозу, хвороб серця, запальних станів шлунка,кишечнику або печінки, або їх ускладнень, в ініціюванні або стимулюванні регенерації або загоєння, або в зниженні підвищених рівнів холестерину й/або тригліцеридів в індивідуума, що містить: (а) забезпечення харчової матриці, що містить популяцію клітин і/або спор харчових грибків; (b) змішування зазначеної харчової матриці в рідкій фазі; і (с) відділення рідкої фази для одержання екстракту. Винахід також забезпечує спосіб здійснення скринінга, визначення або оцінки активності молекул, з'єднань або продуктів, здатних інгібувати запальні ураження, лізосомальні ураження, кислотні ураження, SOD- або IgG, або інші опосередковувані імуноглобулінами ураження, ураження, що індукуються пероксидазою або пероксидом водню, або ж інші форми окисного ураження, при цьому такий спосіб містить: (а) надання білка або білків з доменами, що мають топологію "грецький ключ", які здатні до утворення електронно-транспортних комплексів в умовах протонного надлишку над продукуванням електронів у кислому середовищі з pH між 4,04,5 і нижче 6,0-6,5; і (b) контролювання утворення пероксиду водню й/або викликуваним утворенням пероксиду водню окисненням. Даний винахід, крім цього, забезпечує спосіб оцінки запального окисного ураження (IOD), що містить: (a) надання зразка людської тканини, гомогената зразка тканини, сироватки або плазми; (b) додавання джерела водневих іонів, здатного виступати в якості субстрату для супероксиддісмутази; (c) інкубація зразка протягом часу від 6 до 24 годин; і (d) виконання MDA-тесту для визначення ступеня окиснення. Короткий опис креслень Фігура 1 наводить зразки сиру рокфор, що застосовувався в якості одного джерела активних екстрактів (угорі) і сиру оссо-іраті в якості контрольного не цвілевого сиру (унизу). Фігура 2 наводить зразки сиру Castello® (а) і двох сортів сиру камамбер (b) і (с). Фігура 3 наводить ділянки сирів рокфор і оссо-іраті, з яких відбиралися порції для виготовлення екстрактів. Ліворуч - рокфор: а) приблизно 5 мм від поверхні й не менш 10-15 мм від кордону найближчої грибкової колонії; b) 5 мм від краю грибкової колонії; і с) від області 2 UA 114605 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 найбільш інтенсивного росту усередині грибкової колонії - грибкового ядерця. Праворуч - оссоіраті: а) 5-10 мм від кірки; b) від середньої частини сиру. Фігура 4 відображає електрофореграми білка в SDS (додецилсульфат натрію) поліакриламідному гелі. Μ - молекулярна маса (білковий стандарт). 1-3 елюйовані фракції. 4 вихідних сирних екстракту в PBS (фосфатно-сольовий буфер). Фігура 5 показує загальні кількості клітин, рекрутованих у черевну порожнину у відповідь на інтраперітонеальну (і.р.) провокацію LPS (ліпополісахарид): контроль - тільки сольовий розчин; LPS - тільки провокація LPS; RS1 - миші, що одержували рокфор; Cast - миші, що одержували сир кастелло. Фігура 6 відображає кількість B-Лімфоцитів, залучених у відповідь на інтраперітонеальну LPS-провокацію. Фігура 7 відображає кількість клітин В-1, залучених у відповідь на інтраперітонеальну LPSпровокацію. Фігура 8 відображає кількість Т-Лімфоцитів, залучених у відповідь на інтраперітонеальну LPS-провокацію. Фігура 9 відображає кількість нейтрофілів і макрофагів, залучених у відповідь на інтраперітонеальну LPS-провокацію. Докладний опис винаходу Попередній короткий опис не призначений для визначення кожного об'єкта винаходу, і додаткові об'єкти описані в інших розділах, таких як докладний опис. У цілому даний документ призначений для розгляду як єдиного розкриття, і слід розуміти, що передбачаються будь-які комбінації описаних тут ознак, навіть якщо дана комбінація ознак не виявляється в спільному виді в тій самій пропозиції, або абзаці, або розділі цього документа. Що стосується об'єктів винаходу, описаних або заявлених з використанням артиклів "а" або "an", слід розуміти, що, якщо контекст однозначно не припускає більш вузького значення, такі способи вираження означають "один або декілька". Термін "або" повинен розумітися, як такий, що призначений для охоплення об'єктів у вигляді альтернативи або всіх разом, якщо контекст однозначно не має на увазі іншого. Якщо об'єкти винаходу описані як "такі, що містять" деяку ознаку, передбачаються також і його втілення "що складаються з" або "по суті, що складаються з" даної ознаки. Коли використовується термін "близько", дана заявка також розкриває й застосування точно певної величини. Даний винахід ґрунтується на виявленні того, що грибкові клітини й спори грибків, використовуваних при одержанні харчових продуктів, зокрема, при виробництві сирів, мають безліч несподіваних властивостей, що означає, що вони є підходящими для використання в цілому ряді таких застосувань, як терапія або профілактика інфекцій, зниження запалень і запальних уражень і зниження рівнів холестерину. Грибки й композиції У даному винаході можуть застосовуватися будь-які підходящі грибки. Харчові грибки можуть бути обрані, наприклад, із грибків або цвілевих грибків роду Реnісіllium, таких як Реnісіllium roqueforti, Реnісіllium camemberti, Реnісіllium candidum, Реnісіllium glaucum або Реnісіllium nalgiovense; грибків або цвілевих грибків роду Rhizopus, таких як Rhizopus oligosporous; грибків або цвілевих грибків роду Fusarium, таких як Fusarium venenatum; грибків або цвілевих грибків роду Monascus, таких як Monascus pilosus, або Monascus purpureus, або Monascus ruber; або грибків або цвілевих грибків роду Aspergillus, таких як Aspergillus oryzae або Aspergillus terreus. У винаході можуть застосовуватися будь-які харчові грибки, використовувані у виробництві сиру, зокрема, використовувані при виготовленні блакитних або білих цвілевих сирів, включаючи кожний із грибків, застосовуваних для одержання обговорюваних тут сирів. Грибки можуть бути застосовуваними у виробництві м'якого сиру, зокрема, м'якого блакитного або білого цвілевого сиру. У винаході можуть застосовуватися будь-які грибкові клітини, грибкові спори або екстракти. Кращі харчові грибки включають Реnісіllium roqueforti і Реnісіllium camemberti. У деяких кращих втіленнях харчові грибки не виробляють пеніцилін і не є Реnісіllium notatum або Реnісіllium chrysogenum. Грибкові клітини, спори, екстракти й метаболіти таких грибків можуть використовуватися в різних композиціях завдяки їхнім несподіваним, особливо виділюваним тут властивостям. В одному прикладі грибкові клітини, спори, екстракти, метаболіти й композиції винаходу забезпечуються для цілей застосування в способі лікування організму тварин або людини. Композиція винаходу може бути харчовим продуктом, харчовою добавкою, дієтичною добавкою, топічним або нутрикосметичним засобом, нутрицевтичним продуктом, фармацевтичним продуктом або іншою композицією, що підходить для приймання усередину 3 UA 114605 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 індивідуумом. Композиція може бути, наприклад, у формі таблетки або може надаватися у вигляді рідини. В одному переважному прикладі винахід забезпечує добавку, що містить грибкові клітини або спори винаходу, або їх екстракт. Добавка може бути у формі напою. Підходящі харчові продукти включають молочні продукти, такі як сир; м'ясо, таке як консервоване м'ясо; інші продукти й напої, одержувані з біомаси тварин, водоростевого, рослинного, дріжджового або мікробного походження. В одному прикладі композиція перебуває у формі йогурту або напою для здоровішого харчування. Композиція може бути молочним коктейлем або іншим напоєм для здоровішого харчування. Композиція може бути морозивом. Композиція може бути соусом або майонезом. Фахівцям у даній області очевидні й інші підходящі харчові продукти. У деяких прикладах грибкові клітини, спори або їх екстракти призначають для додавання або нанесення на харчовий продукт, наприклад, хліб. У деяких кращих втіленнях харчовий продукт або харчова матриця є сиром. В одному переважному прикладі сир є блакитним або м'яким сиром, зокрема, таким сиром, добавка грибків до якого представляє частину способу його готування, або ж додається до нього на деякій стадії готування, включаючи кожну з, що тут згадуються. Таким чином, у переважному прикладі сир є цвілевим сиром. В одному переважному прикладі сир є блакитним або білим цвілевим сиром. Даний сир може бути сиром із прожилками. Підходящі сири включають рокфор, камамбер, данаблю, вершковий блакитний сир, стілтон, кабралес, блакитний брі, камбоцолу, фурм д'Амбер, горгонзолу, блє д'Овернь, Cibosano і інші сири, що містять цвілеві грибки. Сир може бути сиром, який звичайно не готується із грибками, але до якого грибки винаходу додаються для збагачення сиру. Сир може бути в деяких прикладах французьким сиром, а в інших прикладах датським сиром. Сир може бути, наприклад, сиром, який виготовляється або містить коров'яче, овече, козяче молоко або молоко буйволиць. Сир може бути пастеризованим або непастеризованим. Сир може бути підданий UHT (ультрависокотемпературній) обробці. Кожна з обговорюваних тут композицій може бути пастеризована, або піддана UHT-обробці, або може бути не пастеризована. У деяких прикладах грибкові клітини або спори в сирі або в інших композиціях винаходу можуть бути живими, в інших - мертвими грибковими клітинами й/або спорами. В одному переважному прикладі харчовий або інший продукт винаходу містить грибки, використовувані при виготовленні сиру, або екстракт із таких грибків. Екстракти й вимір активності Може застосовуватися або забезпечуватися екстракт харчової матриці або популяції харчових грибків, який може містити одну або більш молекул або з'єднань, вироблюваних харчовими грибками, включаючи білки, глікопротеїди, ліпопротеїди, полісахариди й вторинні метаболіти. Такі молекули або сполуки можуть бути отримані в результаті метаболічної переробки харчової матриці харчовими грибками. У деяких випадках екстракт може бути екстрактом цільного сиру або ж отриманим з культури грибків, використовуваних у готуванні сиру. Підходящий екстракт харчової матриці або популяції грибків може бути отриманий змішуванням матриці або популяції з рідкою фазою й відділенням рідкої фази. Наприклад, спосіб одержання екстракту для цілей описаного тут застосування може містити: (а) забезпечення харчової матриці, що містить популяцію клітин і/або спор харчових грибків; (b) змішування харчової матриці в рідкій фазі; і (с) відділення рідкої фази для одержання екстракту. Підходящі рідкі фази включають водні буфери, такі як фосфатно-сольовий буферний розчин (PBS), органічні розчинники, такі як метанол і етанол, кислоти, наприклад, соляну кислоту, і кислотно-спиртові суміші, такі як суміш етанолу й соляної кислоти. Фахівцям у даній області очевидна можливість застосування й інших підходящих водних буферів, органічних розчинників, кислот і їх комбінацій. У винаході може використовуватися будь-яка рідка фаза, яка приводить до одержання екстракту, що демонструє один або кілька видів активності винаходу. Наприклад, екстракт або метаболіт можуть показувати антимікробну, протизапальну й/або антиокислювальну активність. Екстракт або метаболіт можуть показувати здатність стимулювати або підсилювати регенерацію, включаючи регенерацію тканин, таку як регенерація після кожного з типів, що згадуються тут, ураження тканини. У деяких втіленнях харчова матриця або грибкова популяція й рідка фаза можуть бути гомогенізовані, наприклад, у результаті перемішування вихровим способом, ультразвуковою обробкою або іншою підходящою методикою змішування. Рідка фаза може бути відділена або ізольована від суміші будь-якою підходящою методикою, такою як центрифугування, гель - або мембранна фільтрація, або ж будь-яка інша зручна методика поділу. В одному прикладі може бути застосований супернатант, що утворюється після центрифугування. 4 UA 114605 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 У деяких прикладах екстракт може бути отриманий із сиру або від однієї зі стадій виробництва сиру. У деяких випадках замість готування сиру здійснюється лише ферментація грибків з одержанням екстракту з культури, при цьому переважно грибки є застосовуваними в готуванні сиру. Екстракт може пастеризуватися або стерилізуватися, наприклад, за допомогою фільтрації або будь-якої іншої підходящої методики стерилізації. У деяких втіленнях екстракт може бути, крім того, підданий фракціонуванню, наприклад, електрофорезом, або гель - або мембранною фільтрацією, за допомогою ВЕРХ або іншої підходящої методики з метою одержання фракції, збагаченої одним або декількома білками, включаючи глікопротеїди або ліпопротеїди, поліпептиди, ліпополі сахарид або інші органічні молекули або компоненти екстракту. Може застосовуватися фільтрація через сефадекс. Одна або кілька фракцій екстракту можуть бути піддані подальшому аналізу, наприклад, методами ВЕРХ або мас-спектроскопії. У даному винаході можуть застосовуватися будь-який екстракт або фракція, які зберігають бажану активність, наприклад, бажану антимікробну, протизапальну або антиоксидантну активність. Екстракт або фракція можуть мати здатність стимулювати або підсилювати регенерацію. Антиоксидантна, протизапальна, антибактеріальна або регенеративна активність однієї або декількох фракцій екстракту може бути визначена після фракціонування. В одному випадку екстракт або фракція можуть бути, що демонструють антимікробну активність, таку як протибактеріальна або фунгіцидна активність, і в переважному прикладі мають дію проти Chlamydia. Фракція або екстракт можуть показувати антиоксидантну активність у випробуваннях винаходу, зокрема, у будь-якому з описаних нижче випробувань по оцінці запальних окисних уражень. В іншому прикладі грибкові клітини/спори, їх екстракт, метаболіт або продукт ферментації мають здатність до зниження рівнів холестерину, зокрема, холестерину ЛПНЩ, і/або можуть бути здатними до зниження рівнів тригліцеридів. Вони можуть бути здатними до зниження рівнів, підвищених у порівнянні з очікуваними для здоровіших суб'єктів. Композиція, що містить (і) популяцію клітин харчових грибків, (іі) харчову матрицю, що містить популяцію клітин харчових грибків, або (ііі) екстракт, продукт ферментації або метаболіт (і) або (іі), може послабляти або інгібувати один або кілька параметрів, пов'язаних із запаленням, інфекцією або окисненням в індивідуума. Наприклад, композиція може послабляти або інгібувати один або кілька алергійних процесів; ендотеліальні ураження; запалення, наприклад, при розвитку захворювань органів; окисні ураження; запальні окисні ураження; пероксидне окиснення ліпідів, концентрацію AST і ALT у печінці; сироваткові рівні холестерину або рівні змісту часток холестерину ЛПНЩ; ліпіди й тригліцериди печінки; запалення; опосередковане LPS рекрутування клітин у черевну порожнину й вироблення й рекрутування прозапальних цитокінів в індивідуума. Описані тут композиція або екстракт можуть знизити або інгібувати активність одного або декількох із сироваткової глутаматпіруваттрансамінази, сироваткової глутаматоксалацетаттрансамінази, лужної фосфатази й інших лізосомальних ферментів, металопротеаз, колагеназ, глюкуронідази й інших ферментів і факторів, що впливають на одну або декілька клітинних оболонок, позаклітинного матриксу, поперечно-зв'язаного колагену, сіалової кислоти й інших маркерів ураження клітинних оболонок і матриксу. У кращих прикладах фермент або модульований маркер є асоційованими із захворюванням або станом, зокрема, з одним з тих, що тут згадуються. Суб'єкти й уведення Даний винахід може застосовуватися для лікування будь-якого підходящого суб'єкта, наприклад, будь-якого підходящого суб'єкта, що належить до ссавців. В одному переважному прикладі такий суб'єкт є людиною. Винахід може також застосовуватися в лікуванні тварин, таких як сільськогосподарські тварини й свійські тварини, наприклад, коні, рогата худоба, вівці, собаки й кішки. Індивідуум може перебувати в стані, обраному із групи, що полягає з: - інфекції; - автоімунного захворювання; - алергійного стану; - артеріальної гіпертензії; - атеросклерозу; - кардіопатологій, таких як ішемічна хвороба серця; 5 UA 114605 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 - судинних патологій, таких як ендокардит, міокардит, серцева недостатність, захворювання клапанів серця, аритмія, атеросклероз, артеріальна гіпертензія, васкуліт, ендартеріїт, варікоз вен, ендофлебіт, ендотеліальні ураження; - церебральних патологій; - ожиріння; - діабету 2-го типу; - рака, саркопенії; - метаболічної дисфункції; - метаболічного синдрому; - целюліта й вікової деградації тканин; - гастриту; виразки шлунка або дванадцятипалої кишки; - артриту; - дерматиту, псоріазу, вугрового висипу, хронічних виразок шкіри або інших вікових або не пов'язаних з віком станів шкіри, включаючи опіки й рани шкіри й інших тканин; - спортивні, операційні травми й інші ураження; - кахексії, побічних ефектів хіміотерапії й променевої терапії, радіаційного впливу; - або може бути піддадуть ризику такого стану. В одному переважному прикладі призначений для одержання терапії суб'єкт може мати підвищені рівні тригліцеридів і/або холестерину. В одному прикладі суб'єкт може бути суб'єктом із хворобою серця й/або атеросклерозом, або бути суб'єктом, що належать до групи, ідентифікованої в якості групи ризику для таких станів. Такий суб'єкт може мати підвищений холестерин і/або може приймати статіни. Суб'єкт може приймати аспірин для сприяння в профілактиці хвороби серця. Суб'єкт може бути таким, що мав щонайменше один серцевий напад. Суб'єкт може бути таким, що переніс інсульт. Суб'єкт може бути здоровим суб'єктом, але може приймати композицію винаходу для сприяння зниженню ступені важкості або розвитку атеросклерозу й/або хвороби серця. У наступному переважному прикладі винахід може застосовуватися для терапії або профілактики інфекції. Тому суб'єкт може бути суб'єктом, інфікованим такими інфекціями, як викликувані будьякими з мікроорганізмів, що згадуються тут, і, зокрема, Chlamydia. В одному прикладі суб'єкт може бути суб'єктом з підвищеним або високим холестерином. Суб'єкт може мати й підвищений холестерин, і позитивні результати аналізів на Chlamydia. Суб'єкт може бути суб'єктом з надлишковою масою тіла або таким, що потерпає від ожиріння. Суб'єкт може бути у віці, наприклад, більш 30, 40, 45, 50, 60, 67 або 70 років. Винахід також може застосовуватися для терапії або профілактики інфекції Helicobacter pylori. Винахід може застосовуватися для терапії або профілактики пов'язаної з інфекцією Helicobacter pylori виразкової хвороби. Суб'єкт, що зазнає терапії винаходу, може бути суб'єктом з виразковою хворобою й/або з виразкою в анамнезі. Винахід може також застосовуватися для стимулювання або посилення регенерації тканин. Наприклад, винахід може застосовуватися для лікування ран, опіків, виразок або інших уражень тканин. Винахід може застосовуватися для терапії або профілактики запальних уражень і/або окисних уражень. Винахід може застосовуватися для лікування лізосомальних, кислотних, SOD, викликуваних пероксидами, імуноглобуліном або інших форм уражень. Винахід може також застосовуватися для лікування шлункових, кишкових або хвороб печінки, зокрема, таких станів, які є наслідком запальних уражень. В одному прикладі такий стан є виразкою. Описані тут композиції можуть бути підходящими для застосування в терапії обговорюваних тут станів або з метою полегшення одного або декількох симптомів. Наприклад, винахід може вести до зниження холестерину, придушенню або ліквідації інфекції, зниженню запального окисного ураження. В одному прикладі проведена із застосуванням винаходу терапія може призвести до зниження підвищених рівнів холестерину й/або тригліцеридів і, зокрема, до рівня, який кваліфікувався б для даного суб'єкта як нормальний. Кожна з описаних тут композицій може застосовуватися для зменшення ризику або важкості хвороби серця, атеросклерозу й/або серцевих нападів, а також інсультів. В одному прикладі кожний з описаних тут сирів або продовольчих продуктів може застосовуватися для такої мети, зокрема, у випадках станів, пов'язаних з інфекціями Chlamydia, або коли суб'єкт має таку інфекцію. Суб'єкт може бути інфікованим суб'єктом. Інфекція може включати інфекцію бактеріями, наприклад, грампозитивними бактеріями, включаючи Staphylococci, такі як Staphylococcus saprophyticus, і грамнегативними бактеріями, включаючи Е.соlі, такі як Е.соlі 0157, Chlamydia, такі як Chlamydia trachomatis і Chlamydia 6 UA 114605 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 pneumoniae; інфекцію грибками, наприклад, Candida, такими як Candida albicans, інфекцію найпростішими; інфекцію рикетсіями; або інфекцію вірусами. Винахід може застосовуватися проти S. aureus. Суб'єкт може мати пневмонію або септицемію, викликані, наприклад, інфекцією й, зокрема, інфекцією Chlamydia. Суб'єкт може мати інфекцію Helicobacter і, зокрема, інфекцію Helicobacter pylori. Суб'єкт також може мати виразку або виразку в анамнезі. Суб'єкт може мати інфекцію й ураження тканини, таке як опік, рана або інша форма тканинного ураження. Композиція, що містить (і) популяцію клітин харчових грибків, (іі) харчову матрицю, що містить популяцію клітин харчових грибків, або (ііі) екстракт, продукт ферментації або метаболіт (і) або (іі), як описано вище, може застосовуватися в будь-якій зручній формі або рецептурі. Наприклад, такі композиції й рецептури можуть застосовуватися в якості косметичних, нутрицевтичних або фармацевтичних композицій, що втримуються разом з одним або декількома фармацевтично, косметично або поживно прийнятними носіями, допоміжними речовинами, формотворними агентами, розчинниками, наповнювачами, буферними засобами, стабілізаторами, емульгаторами засобами, що консервують, змащеннями або іншими матеріалами, відомими фахівцям у даній області, і, при необхідності, з іншими активними засобами. Підходящі матеріали можуть бути в цілому визнаними в якості безпечних (GRAS) відповідно до критеріїв US FDA (Комісія з контролю над ліками й живильними речовинами США) і можуть включати основні харчові продукти, як описано нижче. Дана композиція може бути додана до дієти суб'єкта. У деяких прикладах композиції винаходу можуть бути впаковані з маркуванням або інструкціями, що підкреслюють області застосування й користь винаходу. Наприклад, винахід включає кожну з обговорюваних тут композицій з позначеннями, що стосуються кожної зі згаданих тут активностей, такими як позначення відносно протиінфекційних, протизапальних і/або таких, що знижують холестерин властивостей композиції, особливо здатності композиції знижувати рівень холестерину. В одному прикладі винахід забезпечує впакований у такий спосіб харчовий продукт, такий як сир або продукт на сирній основі, наприклад, кожний із сирів, що згадуються тут, зокрема блакитні сири, що згадуються, включаючи рокфор. Таке впакування може бути також представлене для кожного з цвілевих сирів, що згадуються, включаючи білі цвілеві сири, а також блакитні цвілеві сири. У деяких втіленнях рецептури описаних тут композицій можуть бути розроблені для місцевого застосування індивідуумом. Підходящі рецептури й способи місцевого застосування добре відомі в даній області. У деяких прикладах композиція винаходу може застосовуватися до ділянки ураження тканини, наприклад, до рани або опіку. Композиція може бути застосована за допомогою, наприклад, пов'язки, примочки, імплантату або іншого засобу локальної доставки до ураженої ділянки. Композиція може бути у формі гелю, мазі або може застосовуватися у вигляді спрея. В одному переважному втіленні композиції й способи винаходу включають пероральне приймання або споживання. У деяких прикладах композиції винаходи з'їдаються як частина дієти. Можуть застосовуватися сполуки, матеріали, композиції й/або лікарські форми, які відповідно до результатів ретельної медичної перевірки є підходящими для застосування в контакті із тканинами суб'єкта (наприклад, людини) без надмірної токсичності, подразнення, алергійної реакції або іншої проблеми або ускладнення, відповідно до прийнятного співвідношення "користь/ризик". Кожний носій, допоміжна речовина і т.д… також повинні бути "прийнятними" у сенсі того, щоб бути сумісними з іншими інгредієнтами рецептури. Винахід може приймати форму добавки або здорового харчування. В одному прикладі можуть забезпечуватися таблетка, йогурт або напій, що містять грибкові клітини або спори, або екстракт, або метаболіт. Харчові продукти, які звичайно не містять грибкових клітин або спор, або щонайменше грибкових клітин або спор, використовуваних у сирі, можуть бути доповнені такими клітинами або спорами, або ж екстрактом кожного з них. У деяких випадках композиція винаходу може бути композицією, яка звичайно містить грибкові клітини, спори, екстракт або метаболіт винаходу, але яка підсилюється їх більш високою кількістю. Наприклад, харчові продукти винаходу, такі як сир, можуть мати більш високий рівень змісту грибкових клітин, спор, екстракту або метаболіту в одному переважному прикладі, у якому харчові продукти є, або містять такий збагачений сир. Наприклад, сир може мати щонайменше 10, 20, 50, 100, 200, 300 % або більш грибкових клітин, спор, екстракту або метаболіту винаходу. Упакування для продукту може показувати, що він є збагаченим або 7 UA 114605 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 поліпшеним продуктом завдяки наявності підвищеного рівня змісту грибкових клітин, спор, екстракту або метаболітів. Випробування Інші об'єкти винаходу належать до ідентифікації й визначення характеристик харчових продуктів із протиінфекційними, протизапальними й/або антиоксидантними властивостями, а також таких, що володіють регенеративними здатностями. Наприклад, спосіб ідентифікації або характеризування харчового продукту може містити: забезпечення харчового продукту, який містить популяцію клітин або спор харчових грибків, і вимір активності зразка або екстракту харчового продукту відносно ослаблення інфекції, запалення або окиснення. Може бути оцінена здатність викликати регенерацію тканин. Спосіб може містити початковий етап вибору або ідентифікації харчового продукту, який містить популяцію клітин харчових грибків. Підходящі харчові грибки описані вище. У модельній in vitro або in vivo системі може бути визначена здатність екстракту або зразка послаблювати або інгібувати алергійні процеси, ендотеліальні ураження, запалення, наприклад, при розвитку захворювань органів, окисні ураження, запальні окисні ураження, запалення або рекрутування прозапальних цитокінів. Може бути визначена здатність екстракту або зразка знижувати або інгібувати активність одного або декількох із сироваткової глутаматпіруваттрансамінази, сироваткової глутаматоксалацетаттрансамінази, лужної фосфатази й інших лізосомальних ферментів, металопротеаз, колагеназ, глюкуронідази й інших ферментів і факторів, що впливають на одну або декілька із клітинних оболонок, позаклітинного матрікса, поперечно-зв'язаного колагену, сіалової кислоти й/або інших маркерів ураження клітинних оболонок і матрікса. Може бути визначена активність зразка або екстракту відносно ослаблення інфекції. Наприклад, може бути визначена дія зразка або екстракту на одну або кілька патогенних клітин, таких як бактеріальні, або грибкові, або клітини найпростіших, або ріккетсії, або вірусні частки. Спосіб містить приведення зразка або екстракту в контакт із патогенними клітинами й визначення дії зразка або екстракту на кількість, зростання, життєздатність або інвазійну здатність патогенних клітин. Зниження кількості, зростання, життєздатності або інвазійної здатності патогенних клітин, наведених у контакт зі зразком або екстрактом, у порівнянні з контролем є показником того, що даний харчовий продукт володіє протиінфекційними властивостями. У даній області добре відомі й інші підходящі in vitro, або ex vivo, або in vivo випробування на наявність протиінфекційних властивостей. Таким чином, в одному прикладі композиції й інші матеріали винаходу будуть, зокрема, у таких випробуваннях демонструвати протиінфекційну активність, особливо проти Chlamydia. Може бути визначена активність зразка або екстракту відносно ослаблення запалень. Наприклад, може бути оцінена дія зразка або екстракту на експресію або продукування цитокінів у клітині ссавців. Спосіб містить приведення зразка або екстракту в контакт із клітинами ссавців і визначення дії зразка або екстракту на експресію, продукування або секрецію цитокінів клітинами ссавців. Зниження експресії, продукування або секреції цитокінів після контакту зі зразком або екстрактом у порівнянні з контрольними клітинами, що не контактували зі зразком або екстрактом, є показником того, що даний харчовий продукт має протизапальні властивості. В інших втіленнях може бути визначена продукція оксиду азоту (NО) і PGE2, що стимулюються ліпополісахаридом (ЛПС) клітинами ссавців, такими як клітини RAW 264.7. Активність зразка або екстракту відносно зниження запалення може бути визначена в моделі гострого запалення на гризунах, такої як модель індукованого набряку лабети, наприклад, модель індукованого каррагенаном набряку лапи, або в моделі хронічного запалення на гризунах, таких як індуковані моделі гранулеми навколо ватяної кульки й повітряного мішечка. У даній області добре відомі й інші підходящі in vitro, або ex vivo, або in vivo випробування на наявність протизапальних властивостей (див., наприклад, Rubinchik і ін…, Methods Mol Biol. 2010; 618:349-58). Даний спосіб може вимірювати концентрацію цитокінів. Підходящі цитокіни добре відомі в даній області й включають IL-1B, IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10, BM-CSF (бичачий макрофагальний колонієстимулюючий фактор), IFN-γ, TNF-α або інші цитокіни або сигнальні молекули. Способи виміру рівня цитокінів добре відомі в даній області. Композиції винаходу в одному прикладі можуть знижувати рівні цитокінів, наприклад, можуть скорочувати будь-які з вищезгаданих цитокінів за винятком BM-CSF або INFN-γ. В інших втіленнях може бути визначена дія зразка або екстракту на опосередковане ЛПС рекрутування клітин у моделі на ссавців. Наприклад, може бути виконане дозозалежне 8 UA 114605 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 титрування розчинів екстракту в досліджуваній системі в порівнянні з контролем, представленим лише розчинником. Може бути визначена активність зразка або екстракту відносно зниження окиснення й/або запального окисного ураження. Наприклад, може бути виконане дозозалежне титрування розчинів екстракту в досліджуваній системі в порівнянні з контролем, представленим лише розчинником. Підходящі способи для оцінки антиоксидантних властивостей включають аналіз на зміст кон'югованих діенів (Beris, Η. Drugs, 42, 1991, 569-605); за допомогою DPPH (дифенілпікрилгідразил) (Vani і ін…, Inter. J. Pharmacognosy 35, 1997, 313-317); нейтралізуючу пероксидні або гідроксильні радикали активність (Babu і ін…, Fitoterapia, 72, 2001, 272-277); тест і ABTS (2,2 -азине-біс-[3-етилбензтіазолін сульфонат]); випробування з DMPD (N, Диметил-ПФенілендіамін) (Rice-Evans, С і ін…, Methods Enzymol, 243, 1994, 279-293); абсорбційну здатність стосовно кисневих радикалів (ORAC) (Frei і ін…, Advances in medicine experiment and biology, 264, 1990, 155-63); FRAP (антиоксидантний тест залізовідновлювальної активності) (Benzie і ін…, Anal. Biochem., 239, 1996, 70-76); TRAP (тартрат-резистентна кисла фосфатаза) (Ghiselli і ін…, Radic. Biol. Med., 18, 1995, 29-36); тест на "тіні" еритроцитів (Chiaki і ін…, J.Agric Food Chem:46: 454-57) і мікросомальне пероксидне окиснення ліпідів або випробування з тіобарбітуровою кислотою (ТВА) (Kimura Υ. і ін. (1984) Planta Med:50: 473-76). У даній області добре відомі й інші підходящі in vitro, або ex vivo, або in vivo випробування на наявність антиоксидантних властивостей. Описані вище способи можуть реалізовуватися in vitro, наприклад, у клітинній культурі. Описані вище способи можуть здійснюватися in vivo, наприклад, відносно організму-хазяїна або модельного організму. Способи можуть застосовувати ex vivo зразки. Виходячи з даних вимірів активності в 1 ,2, 3 або більшій кількості описаних вище тестів харчовому продукту можуть привласнюватися бали або розряди. Наприклад, бали або розряди можуть привласнюватися або ставитися до харчового продукту згідно з покроковою шкалою в 2, 3, 4, 5 або більш балів або розрядів залежно від рівня протиінфекційної, протизапальної або антиоксидантної активності, обмірюваної для даного продукту. Бали або розряди можуть бути представлені числом (наприклад, 1, 2 або 3), описовим розрядом (наприклад, висока, середня або низька активність) або їх комбінацією (наприклад, одна зірочка, дві зірочки або три зірочки активності). Бали можуть також даватися відносно регенеративної здатності. У деяких втіленнях бали або розряд можуть бути визначені в порівнянні зі зразковим харчовим продуктом, таким як сир рокфор. Наприклад, трьохрівнева шкала може містити перший рівень, який привласнюється у випадку, коли обмірювана активність нижче активності зразкового продукту, другий рівень, який привласнюється обмірюваній активності, подібній активності зразкового продукту, і третій рівень, який привласнюється обмірюваній активності, що перевищує активність зразкового продукту. Визначення параметрів інших підходящих шкал перебуває в межах компетенції фахівців у даній області. У деяких втіленнях бали або розряд можуть бути відображені на впакуванні харчового продукту. Наприклад, харчовий продукт або впакування можуть бути маркіровані із вказівкою привласнених балів або розряду. Упакування або поверхня харчового продукту в типовому випадку можуть містити маркування або інший ідентифікатор, що вказують привласнені бали, або розряд. Підходящі способи маркування харчових продуктів і впакування добре відомі в даній області. Описані вище способи можуть застосовуватися для порівняння різних харчових продуктів або екстрактів харчових продуктів. Наприклад, бали або розряд можуть бути привласнені харчовому продукту відповідно до відносної здатності даного харчового продукту інгібувати запалення, інгібувати антиокислювальні ураження або інгібувати хвороботворні інфекції в співвіднесенні з іншими харчовими продуктами. У деяких прикладах уведення композиції винаходу може привести до скорочення рівнів холестерину й/або тригліцеридів. Наприклад, у деяких випадках, винахід може забезпечувати зниження холестерину нижче 300 мг/дл, зокрема, нижче 250 мг/дл і переважно до 200 мг/дл або нижче. Це може привести до зниження рівня ферментів печінки, таких як ALT і AST. У наступному прикладі композиція винаходу може продемонструвати здатність послабляти або запобігати інфекції, викликуваній будь-яким з інфекційних агентів, що згадуються тут, включаючи ті, що задіяні в прикладах даної заявки. Композиція може показувати активність проти Chlamydia і, зокрема, проти Chlamydia trachomatis. Така активність може бути перевірена in vitro, наприклад, за допомогою додавання композиції до певної кількості Chlamydia у культурі. Активність може бути перевірена в моделях на тваринах, наприклад, на мишах, інфікованих 9 UA 114605 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Chlamydia, такими як Chlamydia muridarum, включаючи штам Морn. Метою випробування може бути знаходження збільшеного часу виживання в порівнянні з інфікованими мишами, що не одержували дану композицію. В одному переважному прикладі композиція винаходу може показувати зниження IOD (запальне окисне ураження), наприклад, за результатами вимірів за допомогою описаного тут випробування. Винахід також має на увазі випробування, що містить забезпечення зразка тканини або гомогената зразка тканини, або сироватки/плазми, переважно від пацієнтів із хронічними станами запального або окисного стресу, підкислення зразка з використанням субстрату або субстратів для супероксиддісмутази (SOD), інкубування зразка, потім виконання тесту на малоновий діальдегід (MDA) або інших випробувань, що підходять для кількісного визначення продуктів пероксидного окиснення. В одному переважному прикладі результати додавання композиції винаходу порівнюються з контрольним зразком. Тканина може бути будь-якою людською тканиною, наприклад, тканиною, витягнутою при операції, аналогічним образом у випробуванні можуть використовуватися гомогенати будь-якої такої тканини. В одному переважному прикладі тканина або гомогенат тканини мають походження від людини. У наступному переважному прикладі випробування проводилося із застосуванням плазми або сироватки. В одному прикладі тканина, гомогенат, сироватка, або плазма отримані від індивідуума із хронічним станом запального або окисного стресу, включаючи будь-які такі стани, що згадуються тут, наприклад, атеросклероз або артрит. Такі тканини, гомогенати, сироватка або плазма можуть бути отримані, наприклад, від суб'єкта із запальним розладом кишечнику, ішемічною хворобою серця, артеріальною гіпертензією, гіперхолестеринемією або SLE (системна червона вовчанка). У деяких прикладах вихідний зразок регулюється таким чином, щоб рівень білка в зразку становив від 1 до 10 мг білка в 1 мл зразка, наприклад, від 2 до 8 мг/мл, переважно від 3 до 7 мг/мл, наприклад, від 4 до 6 мг/мл або перебував близько таких величин. У деяких прикладах рівень білка становить близько 5 або 6 мг/мл. У наступному переважному прикладі додавання зразка для випробувань не буде приводити до розведення загального обсягу зразка більш ніж на близько 20, 15, 10 або 5 %, і переважно буде зберігати рівень білка в цілому зразку в межах зазначених вище діапазонів. У наступному переважному прикладі забезпечуються оцтова кислота або соляна кислота як джерело водневих іонів, що виступають у якості субстрату для SOD. У деяких випадках концентрація водневих іонів щонайменше в близько 10, 25, 50, 75, 100, 125, 150, 175 або 200 раз вище, чим рівень змісту таких іонів у контрольному зразку, або доходить аж до таких рівнів. Наприклад, у деяких випадках рівень змісту доданих водневих іонів може становити від близько 50 до 150, переважно від 75 до 125, і особливо в 100 раз вище, чим у контрольному зразку. В одному прикладі до контрольного зразка додається еквівалентний обсяг рідини, але без джерела водневих іонів, наприклад, може бути доданий PBS для того, щоб гарантувати ідентичність обсягів контрольного й зразка для випробувань. Слідом за додаванням джерела водневих іонів зразок може бути підданий інкубуванню протягом, наприклад, від близько 6 до 24 годин, такому як від 6 до 16, або від 8 до 12 годин. В одному переважному прикладі зразки інкубуються протягом ночі. Інкубування може проводитися, наприклад, при 37 °C. Після інкубування реакція може бути зупинена за допомогою, наприклад, трихлороцтової кислоти додаванням, наприклад, від близько 0,5 до 1 Μ трихлороцтової кислоти. Далі може бути виконаний тест на MDA для аналізу ступеня окиснення. Зразок, до якого був доданий зразок для випробувань, може бути порівняний з негативним контролем, до якого джерело водневих іонів не додавалося. Наприклад, можуть бути проведено дві однакові, за винятком додавання водневих іонів, реакції. У деяких випадках може бути також здійснений позитивний контроль, що включає наприклад, зразок для випробувань, відомий здатністю впливати на запальні окисні ураження (IOD), наприклад, відомий у якості інгібітору IOD. В одному прикладі здійснюється кількісне визначене MDA завдяки здатності MDA реагувати з тіобарбітуровою кислотою (ТВА), слідом за чим виконується спектрофотометричний або флюорометричний кількісний аналіз. В одному прикладі грибкові клітини або спори, грибкові екстракти або інші композиції, використовувані або забезпечувані у винаході, інгібують IOD, такий як IOD згідно з вимірами випробування, яке описане вище. Наприклад, рівень інгібування в порівнянні з контролем може скласти щонайменше 10, 20, 30, 50 або 40 %, або аж до таких рівнів. У деяких прикладах рівень інгібування може становити щонайменше 10, 15, 25, 30, 40, 50, 60, 75 або 100 % від показаного 10 UA 114605 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 сиром рокфор, таким як будь-який із сортів, що згадуються тут, сиру рокфор, або його екстрактами. У порівнянні із сирами кастелло або камамбер рівень інгібування може бути щонайменше таким же, як і рівні, демонстровані кожною конкретною формою цих сирів, що згадуються тут, або їх екстрактів. У деяких прикладах у якості негативного контролю може використовуватися оссо-іраті або інші не цвілеві сири, які не показують або представляють мінімальне інгібування IOD. В одному прикладі у випробуванні, що застосовувалось для визначення рівня інгібування запального окисного ураження, у якості зразка буде використовуватися людська плазма, зокрема, у тому випробуванні, яке використовується для одержання результатів, представлених у таблиці 6 даної заявки. Готування Композиція, що містить (і) популяцію клітин харчових грибків, (іі) харчову матрицю, що містить популяцію клітин харчових грибків, або (ііі) екстракт, продукт ферментації або метаболіт (і) або (іі), як описано вище, може втримуватися в харчовому продукті. Наприклад, вона може втримуватися в хлібі, крупі, печиві, маслі, спредах (наприклад, маргарині), сирі, йогурті, напоях або кормах для свійських тварин, наприклад, у консервованому або сухому кормі для кішок або собак. Фахівцям у даній області очевидні й інші харчові продукти, що підходять для цієї мети. Дана рецептура може бути змішана з інгредієнтами харчового продукту до його готування (наприклад, за допомогою теплової обробки) і/або може бути додана до харчового продукту після готування. Представлені тут результати показують, що рецептури можуть бути включені в харчові продукти без погіршення якості продуктів і можуть залишатися активними, перебуваючи в уведеному в харчові продукти стані. В одному прикладі композиція переважно є ксеногенною або екзогенною стосовно харчового продукту, тобто природно композиція в даному харчовому продукті не присутня. В одному втіленні композиція є композицією, яка у звичайному стані не містить грибкових клітин або спор, наприклад, використовуваних у блакитних або м'яких сирах, таких як будь-які з тих, що тут згадуються. В одному прикладі композиція у звичайному стані могла б містити грибкові клітини або спори, але в цьому випадку вони присутні в підвищених концентраціях, наприклад, щонайменше вдвічі, утроє, учетверо або ще більше перевищуючи нормальний рівень вмісту. Таким чином, ще один наступний об'єкт винаходу є харчовим продуктом, що містять (і) популяцію клітин і/або спор харчових грибків, (іі) харчову матрицю, що містить популяцію клітин харчових грибків, або (ііі) екстракт, продукт ферментації або метаболіт (і) або (іі), як описано вище, призначеним, наприклад, для послаблення інфекції, запалення або окиснення в індивідуума, при цьому така популяція, матриця або екстракт природно в харчовому продукті не присутні. Харчовий продукт також може застосовуватися для зменшення лізосомальних уражень, кислотних, SOD або IgG пероксидних уражень, уражень, що викликані пероксидом водню, і інших форм окисних уражень. Харчовий продукт може застосовуватися для зменшення окисного ураження в цілому й запального окисного ураження, зокрема. Харчовий продукт може також застосовуватися для ініціювання або стимулювання регенерації або загоєння. Також забезпечується спосіб виготовлення харчового продукту, що призначений для послаблення, або затримування, або запобігання інфекцій, запалень або окиснення в індивідуума, при цьому зазначений спосіб містить: (і) забезпечення інгредієнта харчового продукту; (іі) змішування (a) популяції клітин харчових грибків, (b) харчової матриці або продукту її ферментації, що містить популяцію клітин харчових грибків, або (c) екстракту, продукту ферментації або метаболіту (а) або (b), як описано вище, із зазначеним інгредієнтом; (ііі) уведення зазначеної суміші в рецептуру харчового продукту. Розроблений харчовий продукт може також використовуватися для зменшення або затримки запального, лізосомального, кислотного, SOD, IgG пероксидного або зумовлюваного пероксидом водню ураження. Композиція може застосовуватися для зменшення або виключення інших форм окисної ураження, а також для стимулювання регенерації й/або загоєння. Композиція може застосовуватися в терапії опіків або інших уражень шкіри. Інгредієнти харчового продукту включають основні харчові продукти, такі як борошно, м'ясо, яйця, желатин, молоко, сіль, засоби, що консервують, і вода, які застосовуються для одержання 11 UA 114605 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 харчових продуктів. Може включатися цукор. Підходящі для застосування відповідно до даних способів інгредієнти харчових продуктів є відомими в даній області. Композиції винаходу можуть містити будь-які такі компоненти. Також забезпечується спосіб виготовлення харчового продукту, що призначений для ослаблення, або затримування, або запобігання інфекцій, запалень або окиснення в індивідуума, при цьому зазначений спосіб містить: (і) забезпечення харчового продукту й (іі) внесення (a) популяції клітин харчових грибків, (b) харчової матриці, що містить популяцію клітин харчових грибків, або (c) екстракту, продукту ферментації або метаболіту (а) або (b), як описане вище, у зазначений харчовий продукт. Переважно (а), (b) і/або (с) є ксеногенними або екзогенними стосовно харчового продукту, тобто а), (b) і (с) у природньому стані в харчовому продукті не присутні. Наступні приклади представляють деякі перераховані далі втілення винаходу. (1) Композиція, що містить (і) популяцію клітин харчових грибків, (іі) харчову матрицю, що містить популяцію клітин харчових грибків, або (ііі) екстракт, продукт ферментації або метаболіт (і) або (іі), призначена для ослаблення або інгібування інфекцій, запалень або окиснення в індивідуума. (2) Застосування композиції, що містить (і) популяцію клітин харчових грибків, (іі) харчову матрицю, що містить популяцію клітин харчових грибків, або (ііі) екстракт, продукт ферментації або метаболіт (і) або (іі), у виробництві препарату, призначеного для ослаблення або інгібування інфекцій, запалень або окиснення в індивідуума. (3) Спосіб ослаблення або інгібування інфекцій, запалень або окиснення в індивідуума, що містить уведення композиції, що містить (і) популяцію клітин харчових грибків, (іі) харчову матрицю, що містить популяцію клітин харчових грибків, або (ііі) фракцію, екстракт, продукт ферментації або метаболіт (і) або (іі) індивідуумові, що потребує цього. (4) Композиція, спосіб або застосування за будь-яким з пунктів формули винаходу 1-3, у якому композиція послабляє або інгібує інфекцію, запалення або окиснення, або їх ризик в індивідуума. (5) Композиція, спосіб або застосування згідно з будь-яким з пунктів формули винаходу 1-4, у якому харчові грибки вибираються із грибків роду Реnicillium, грибків роду Rhizopus, грибків роду Fusarium, грибків роду Monascus або грибків роду Aspergillus. (6) Композиція, спосіб або застосування згідно з будь-яким з пунктів формули винаходу 1-5, у якому грибки роду Реnicillium вибираються з Реnicillium roqueforti, Penicillium camemberti, Реnicillium candidum, Реnicillium glaucum і Реnicillium nalgiovense. (7) Композиція, спосіб або застосування згідно з будь-яким з пунктів формули винаходу 1-6, у якому композиція є збагаченим продуктом харчування, харчовою добавкою, дієтичною добавкою, нутрицевтиком, фармацевтичним продуктом, топічним дерматологічним продуктом або топічним косметичним продуктом. (8) Композиція, спосіб або застосування згідно з будь-яким з пунктів формули винаходу 1-6, у якому композиція є харчовим продуктом або напоєм. (9) Композиція, спосіб або застосування згідно з будь-яким з пунктів формули винаходу 1-8, у якому харчова матриця вибирається з молочного продукту, м'яса або напою, або інших біологічних матриць. (10) Композиція, спосіб або застосування згідно з пунктом формули винаходу 9, у якому харчова матриця є сиром. (11) Композиція, спосіб або застосування згідно з пунктом формули винаходу 10, у якому сир вибирається із групи, що полягає з рокфору, камамбера, вершкового блакитного сиру, стілтона, камбоцоли, фурм-д'Амберу, горгонзоли, блє д'Овернь, Cibosano. (12) Композиція, спосіб або застосування згідно з будь-яким з пунктів формули винаходу 111, у якому екстракт готується змішуванням харчової матриці з рідкою фазою й відділенням рідкої фази. (13) Композиція, спосіб або застосування згідно з пунктом формули винаходу 12, у якому рідка фаза є водним або неводним розчинником. 12 UA 114605 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 (14) Композиція, спосіб або застосування згідно з пунктом формули винаходу 13, у якому рідка фаза вибирається із групи, що полягає з фосфатно-сольового буферного розчину (PBS), метанолу, етанолу, соляної кислоти, а також і етанолу, і соляної кислоти. (15) Композиція, спосіб або застосування згідно з будь-яким з пунктів формули винаходу 1214, у якому рідка фаза відділяється центрифугуванням або фільтрацією. (16) Композиція, спосіб або застосування згідно з будь-яким з пунктів формули винаходу 1214, у якому слідом за зазначеним відділенням рідка фаза стерилізується або пастеризується. (17) Композиція, спосіб або застосування згідно з будь-яким з пунктів формули винаходу 116, у якому композиція послабляє або інгібує одне або декілька з алергійних процесів, ендотеліальних уражень, запалень, окисних уражень, запальних окисних уражень, запалень при розвитку захворювань органів і рекрутування прозапальних цитокінів в індивідуума. (18) Композиція, спосіб або застосування згідно з будь-яким з пунктів формули винаходу 117, у якому індивідуум має стан, обраний із групи, що складається з автоімунного захворювання, артеріальної гіпертензії, атеросклерозу, кардіопатології, судинної патології, церебральної патології, ожиріння, діабету 2-го типу, рака, саркопенії, метаболічної дисфункції, гастриту, виразки шлунка або дванадцятипалої кишки, артриту або ураження суглобів, дерматиту, псоріазу, вугрового висипу, хронічних виразок шкіри, вікових або не пов'язаних з віком станів шкіри, опіків і ран шкіри й інших тканин, уражень, включаючи спортивні, травматичні, операційні й інші ураження, кахексії, побічних ефектів хіміотерапії й променевої терапії, а також радіаційного опромінення. (19) Композиція, спосіб або застосування згідно з будь-яким з пунктів формули винаходу 118, у якому композиція має привласнений розряд, який є показовим відносно активності з ослаблення або інгібування інфекції, запалення або окиснення. (20) Композиція, спосіб або застосування згідно з пунктом формули винаходу 19, у якому привласнений розряд або оцінка в балах відображаються на композиції або її впакуванні. (21) Спосіб ідентифікації й/або характеризування харчового продукту, що містить: (і) забезпечення харчового продукту, що містить популяцію клітин харчових грибків, і (іі) вимір активності харчового продукту або його екстракту відносно ослаблення інфекції, запалення або окиснення. (22) Спосіб згідно з пунктом формули винаходу 21, що містить вибір, або ідентифікацію перед етапом (і) харчового продукту, який містить популяцію клітин харчових грибків. (23) Спосіб згідно з пунктами формули винаходу 21 або 22, що містить присвоєння балів або розряду харчовому продукту, які є показовими відносно результатів виміру зазначеної активності. (24) Спосіб згідно з пунктом формули винаходу 23, що містить маркування або нанесення на харчовий продукт або його впакування етикетки із привласненим розрядом або оцінкою в балах. (25) Спосіб одержання екстракту, призначеного для застосування з метою ослаблення інфекції, запалення або окиснення в індивідуума, що містить: a) забезпечення харчової матриці, що містить популяцію клітин харчових грибків, b) домішування зазначеної харчової матриці до рідкої фази. З розгляду даного розкриття фахівцям у даній області будуть очевидні й різні подальші об'єкти й втілення даного винаходу. Усі документи, що згадуються в даному описі, є тут включеними у всій їхній повноті за допомогою посилання. Винахід охоплює всі комбінації й субкомбінації ознак, які описані вище. Далі деякі об'єкти й втілення винаходу ілюструються за допомогою прикладів і за допомогою звертання до креслень і таблиць, що описані нижче. Приклади Досліджувані сири Для більшості представлених тут експериментів головним джерелом сирних екстрактів був сир рокфор, що виготовляється з овечого молока. Рокфор виготовляється в регіоні Середні Піренеї. У попередніх експериментах були протестовані дві торговельні марки (фіг. 1, угорі). Обидві продемонстрували подібні протибактеріальні й антиоксидантні властивості. Представлені нижче результати були отримані на екстрактах з "регулярного" рокфору (фіг. 1, угорі ліворуч), а не з рокфору "золотої медалі" (фіг. 1, угорі праворуч). Рокфор, з якого були отримані екстракти, виготовлявся з непастеризованого, неопрацьованого, незбираного овечого молока за допомогою Penicillium roqueforti. У якості контрольного сиру застосовувався сир оссо-іраті (фіг. 1, унизу). Цей сир походить із баскської області Франції, області, що межує із Середніми Піренеями. Сир оссо-іраті також виготовляється з непастеризованого, неопрацьованого, незбираного овечого молока, але не містить харчових грибків. 13 UA 114605 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Для оцінки того, чи є ефекти, які спостерігались, властивими тільки сирам, що виготовляються з овечого молока, були також перевірені утримуючі Penicillium roqueforti сири з коров'ячого молока (наприклад, данаблю, кастелло Данія) (фіг. 2а). Для визначення того, чи є спостережувані ефекти властивими тільки певним грибкам, були також перевірені сири камамбер, що виготовляються за допомогою Penicillium camemberti. Були перевірені непастеризований сир камамбер Le Medaillon Cremier (фіг. 2b) і пастеризований сир камамбер President (фіг. 2с). Готування сирних екстрактів Екстракти рокфору були отримані із трьох різних частин сиру: (a) близько 5 мм від поверхні сиру й не менш 10-15 мм від межі найближчої грибкової колонії; (b) близько 5 мм від грибкової колонії; і (c) з ділянки найбільш інтенсивного росту усередині грибкової колонії, описаного тут як грибкове ядерце (фіг. 3). Екстракти сиру Castello® були отримані з таких же ділянок. Екстракти камамбера були отримані із трьох різних ділянок сиру: (a) середньої частини сиру; (b) в 5-10 мм від поверхні; і (c) з кірки. Екстракти сиру оссо-іраті були отримані із двох різних ділянок сиру: (a) в 5-10 мм від кірки; і (b) із середньої частини сиру (фіг. 3). Готування екстрактів і фракцій Екстракти харчових грибків були отримані додаванням рівного обсягу PBS до кожної порції сиру, наприклад, 10-15 мл PBS додавалося до 10-15 г кожного сиру. Зразки потім гомогенізувались у термостатованій вихровій мішалці протягом 10 хвилин. Гомогенізовані суспензії інкубувались протягом 1 години при 4 °C і потім зразки центрифугувались протягом 15 хвилин на 3 500 обертів/хв…, Eppendorf 581 OR. Супернатант центрифугувався ще протягом 15 хвилин на 16 000 обертів/хв., Eppendorf 5115D. Даний супернатант використовувався для подальшого фракціонування. Екстракти фракціонувались гель-фільтрацією на колонці (1,59,0 см) із середовищем Sephadex G-25 в PBS. Колонка була піддана попередньому калібруванню для оцінки вільного й загального обсягу за допомогою декстринового блакитного й DNP-L-ALa. У кожному експерименті в колонку уводилося по 3 мл сирного екстракту, після чого відбиралися елюйовані фракції в наступних обсягах: фракція "1" - 6 мл, фракція "2" - 4 мл і фракція "3" - 10 мл. Концентрації білка визначалися по поглинанню на 280 нм, Shimadzu UV-1 800. Результати типового експерименту представлено в таблиці 1. Електрофорез Для визначення білкового профілю кожної фракції білкові фракції були піддані електрофорезу в поліакриламідному гелі з SDS (додецилсульфат натрію) по Лемлі. Усі фракції були розведені в 10 раз PBS. Далі фракції були додатково розведені: фракція "1" із сиру Castello® була розведена в 2 рази, кожна фракція "1" із сиру камамбер Medallion і фракція "1" із сиру камамбер President була розведена в 5 раз, фракція "1" з рокфору використовувалася без розведення. Інші фракції також використовувалися без розведення. Після цього всі зразки були розведені буфером Лемлі, що містять 2-меркаптоетанол, і протягом 5 хвилин нагрівалися при 100 °C. Для аналізу використовувалося по 10 мкл кожного зразка. Для виконання електрофорезу застосовувався Miniprotean III на 200 Вт. білкові стандарти, що серійно випускаються, мали молекулярну масу між 10 000 і 200 000 кд. Для ідентифікації смуг білків використовувався гель СВВ G-250. Результати електрофорезу представлені на фіг. 4. Етанолові фракції До порцій сиру додавалися рівні обсяги 99 % етанолу, наприклад, до 10-15 г сиру було додано по 10-15 мл 99 % етанолу. Зразки були гомогенізовані. Гомогенізовані суспензії інкубувались протягом 1 години при 4 °C і потім зразки центрифугувались протягом 15 хвилин на 3500 про/хв…, Eppendorf 581 OR. Супернатант повторно центрифугувався ще протягом 15 хвилин на 16000 про/хв…, Eppendorf 5115D. Даний супернатант використовувався в наступних експериментах. Крім того, були отримані фракції етанол:НСl гомогенізацією порцій сиру в 50:50 суміші 99 % етанолу й 0,01М соляної кислоти. Це повинне було імітувати кисле середовище в шлунку в процесі переварювання. Гомогенізовані суспензії інкубувались протягом 1 години при 4 °C і потім зразки центрифугувались протягом 15 хвилин на 3 500 про/хв., Eppendorf 581 OR. 14 UA 114605 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Супернатант повторно центрифугувався ще протягом 15 хвилин на 16 000 про/хв., Eppendorf 5115D. Даний супернатант використовувався в наступних експериментах. На закінчення фракції центрифугувались для видалення будь-яких видимих сирних часток, і зразки після цього стерилізувалися фільтрацією через мембрани з розміром пор в 0,22 мкм. Антибактеріальна й фунгіцидна активність Для перевірки на антибактеріальні й фунгіцидні властивості в експериментах використовувалися три звичайні види бактерій і один вид грибків: - Escherichia coli, штам АТСС 25922, - Staphylococcus saprophyticus, ATCC 15305, - Chlamydia trachomatis, штам L2/43/Bu, - Candida albicans, ATCC 10231. Escherichia coli, Staphylococcus saprophyticus і Candida albicans інкубувались протягом 24 годин у чашці Петрі на агаровому середовищі при наявності й відсутності сирних екстрактів. Chlamydia trachomatis у клітинній культурі Heia інкубувалась протягом 24 годин при наявності й відсутності сирних екстрактів. Сирні екстракти оссо-іраті (а) і (b) з концентраціями білка між 2 мкг і 200 мкг не показали ніякого ефекту на зростання кожного з даних мікроорганізмів. Екстракти рокфору всі були активними, при тому, що найбільш помітні ефекти спостерігалися для екстрактів, отриманих з ділянки (b). Результати представлено в таблиці 2. Незважаючи на демонстрацію значних антибактеріальних і фунгіцидних властивостей, повністю сирні екстракти випробувані мікроорганізми не пригнічували. Однак ці дані показують, що сирні екстракти можуть бути підходящими для застосування в терапії й/або профілактиці інфекцій. Активність проти Chlamydia trachomatis (in vitro). Ефект сирних екстрактів перевірявся на штамі Chlamydia trachomatis L2/43/Bu, вирощеному на клітинній лінії U-937, отриманої із чоловічої дифузійної гістіоцитарної лімфоми. Суспензії клітин культивувалися в 7 мл RPMI-1640 з 10 % ембріональною бичачою сироваткою в колбах для клітинних культур (Corning) при 37 °C у атмосфері 5 % СО2. Клітинна культура 6 пересіювалась кожні 2 дня. Завись відмитих клітин містила 6×10 клітин в 1 мл. Експерименти проводилися на 24-ямкових планшетах. Негайно після аліквотування клітинної суспензії по лунках кожна лунка засівалася С. trachomatis L2/43/Bu в 10 МОl. У той же самий час у кожну лунку вносилися різні дози сирних екстрактів. У якості контролю використовувалися неінфіковані клітинні суспензії. Після посіву й додавання сирних екстрактів усі чашки центрифугувались при 3000 g (1 800 про/хв.) протягом 20 хвилин при 25 °C і потім інкубувались 24 години при 37 °C в атмосфері 5 % СО2. Екстракти оссо-іраті не сповільнювали зростання Chlamydia у жодній з концентрацій, що перевірялися, від 2 до 200 мкг/мл клітинного живильного середовища. Екстракти рокфору показали значний ефект інгібування на зростання бактерій Chlamydia. Результати представлено в таблиці 3. Активність проти Chlamydia infection in vivo Дванадцять самок мишей BALB/c з масою тіла між 24 і 25 г були розділені на три групи. Контрольна група одержувала сир оссо-іраті, групу один годували сиром рокфор, група два одержувала сир данаблю (вершковий блакитний сир, Castello®). Початково миші перебували під наглядом і годувалися сирами. Миші харчувалися сирами рокфор або данаблю й маса їх тіла підтримувалася постійною. Миші в контрольній групі споживали оссо-іраті без видимих проблем. Через один тиждень спостереження всі миші були інтраназально інокульовані Chlamydia muridarum, штам Μοpn, спочатку іменований Nigg. Кожна миша одержала 5-104 бактерій. Сирні дієти зберігалися у всіх групах. На третій день після зараження всі миші в контрольній групі загинули від пневмонії й септицемії. На четвертий день загинули по дві миші в кожній із двох інших груп. Усі тварини, що вижили, після цього були умертвлені для патологоанатомічного дослідження. Розтин показав, що легені тварин з контрольної групи містили масивні скупчення уражень, сильно заражених бактеріями Chlamydia. Легені мишей із груп один і два, що вигодовувались сирами рокфор і данаблю, показали значно знижені рівні інфекції Chlamydia у порівнянні з контрольною групою. Єдина значима аномалія, знайдена в померлих мишей із груп один і два, була значно збільшена печінка, що й може пояснити фатальний результат. Таким чином, сири рокфор і данаблю містять щось, що може запобігати й/або сповільнювати розвиток гострої пневмонії Chlamydia. Протизапальні властивості Дія сирного екстракту на продукування цитокінів 15 UA 114605 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Вище було показане, що Penicillium roqueforti і/або молекули, вироблені Penicillium roqueforti, вирощеними на субстраті з овечого або коров'ячого молока, інгібують інфекцію Chlamydia in vitro і in vivo. Екстракти рокфору з ділянок (а) і (b) були перевірено на здатність пригнічувати або інгібувати продукування ключових цитокінів у клітинній культурі, інокульованої Chlamydia. Клітинна лінія, штам Chlamydia і протокол були такими ж, як описано вище. Після інкубування клітин протягом 24 годин при 37 °C в атмосфері 5 % СO2 по 150 мкл кожної суспензії було перенесено в пробірки Eppendorf (0,5 мол) і потім центрифугувались протягом 5 хвилин при 3 000 g (1 800 про/хв.). Після чого 100 мкл супернатанта були перенесені в нові пробірки й розведені PBS в 1 000 разів. Зразки були проаналізовані за допомогою аналізатора Віо-Рlех (Bio-Rad) і набору реактивів Human 8-plex Cytokine Panel на наступні цитокіни: IL-1B, IL2, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10, BM-CSF (бичачий макрофагальний колонієстимулюючий фактор), IFN-γ і TNF-α. Результати представлено в таблиці 4. Обидва екстракти (а) і (b) сиру рокфор виявилися здатними значно пригнічувати вироблення всіх перевірених цитокінів, крім BM-CSF і INF-γ. Спостерігалося, що дія екстрактів, отриманих з ділянки (b), була значно більш ефективною, чим екстрактів, отриманих з області (а). Це було особливо помітно при більш низькій концентрації білка в 20 мкг. При цій концентрації екстракти, отримані з області (b), були в 3 рази більш ефективні у відношенні інгібування продукції TNF-α, ніж екстракти, отримані від області (а). Для IL-1y різниця становила 4 рази. Інгібування продукції цитокінів супроводжувалося інгібуванням на 80-85 % зростання Chlamydia у випадку екстрактів, отриманих з області (а), у той час як екстракти, отримані з області (b), повністю блокували розвиток інфекції Chlamydia (таблиця 4). Сири рокфор і данаблю модулюють опосередковане LPS рекрутування клітин до черевної порожнини. Протизапальні властивості сирів рокфор (RS) і кастелло (Cast) були досліджені на мишах з індукованим LPS запаленням. Мишам через голку для штучного харчування протягом 2 днів (двічі в день) подавалися 0,2 мл сирного екстракту перед інтраперитонеальною (і.р.) ін'єкцією 0,5 мг/кг LPS E. соlі (Sigma). Через два дні від мишей, що одержували сирні екстракти, і контрольних мишей, що не одержували сирних екстрактів (тільки LPS або фізіологічний розчин), був отриманий перитонеальний лаваж. Підраховані й рекрутовані клітинні популяції (нейтрофіли, макрофаги, Ті B-Лімфоцити) були проаналізовані за допомогою проточної цитометрії (проточний цитометр FACS Calibur (BD), програмне забезпечення-Cellquest (BD) і FCS express (програмне забезпечення Denovo)). Загальна кількість клітин, рекрутованих до черевної порожнини у відповідь на провокацію LPS, виросло в день 2 (фіг. 5). Миші, що вигодовувались екстрактами, отриманими із сиру Castello®, показували зниження індукованого LPS рекрутування запальних клітин. Це також могло впливати на важкість запалення. Кількість B-Лімфоцитів у відповідь на LPS у день 2 після терапії була зниженою (фіг. 6). Терапія сирними екстрактами пом'якшила втрату B-Лімфоцитів після обробки LPS, що могло б привести до кращої стійкості до запалення. Субпопуляції клітин В-1 являють собою неспецифічні В-Лімфоцитарні популяції, які беруть участь в природженій стійкості до різних інфекцій і деяким запальним розладам. Кількість В-1 клітин (CD19+CD5+) збільшилася в групах обробки LPS і RS+LPS і була майже нормальною у групі терапії Cast+LPS (фіг. 7). Збільшена кількість Т-Клітин також спостерігалася в мишей, що одержували сирні екстракти (фіг. 8). Кількість резидентних макрофагів у черевній порожнині також було зменшено в оброблених LPS мишей, але було збільшено в мишей, що вигодовували сирними екстрактами (фіг. 9). У мишей із групи контролю майже не було нейтрофілів, але спостерігалося збільшення кількості цих клітин після обробки LPS. У мишей, що одержували сирні екстракти, рівні цих клітин були ненабагато підвищеними. Навіть короткочасне (2 дні) харчування сирними екстрактами демонструє очевидну здатність модулювати рекрутування клітин у відповідь на внутрішньочеревинну провокацію LPS з тенденцією до відновлення втрат субпопуляцій В-, Т-Клітин і макрофагів у відповідь на запальну провокацію. Ця здатність впливає на клітини, залучені й в природжений, і в адаптивний імунітет, пропонуючи можливість довгострокової регуляції запалення. Інгібування запального окисного ураження 1. Перевірка ex vivo дії продуктів з харчових грибків або їх екстрактів на запальні окисні ураження. Забезпечувався зразок гомогената людської тканини, витягнутої при операції, або людської плазми або сироватки, зокрема, від індивідуума із запальним станом, і доводився PBS до 16 UA 114605 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 концентрації 5 або 6 мг білка на 1 мл. Потім вносився зразок для випробувань, такий, щоб його додавання не розбавляло гомогенат тканини більш ніж на 5 %. Зразок після цього розділявся на дві частини. До одного зразку додавалися водневі іони, субстрат для супероксиддісмутази, у формі оцтової або соляної кислоти, але не, наприклад, сірчаної кислоти, у концентрації, що в 100 раз перевищує контрольний зразок, до якого в тому ж самому обсязі був доданий тільки PBS. Обидва зразки інкубувались протягом ночі або протягом стандартизованого часу не менш 6 і не більш 24 годин. Потім реакція зупинялася 0,5-1Μ трихлороцтовою кислотою й виконувався стандартний тест MDA для оцінки рівня окисненої тканини. 2. Перевірка ex vivo дії продуктів з харчових грибків або їх екстрактів на SOD-Пероксідазну активність 2+ 2+ Досліджувана система містила 0,1-100 нг Cu ,Zn - SOD і його субстрат 1-1 000 мкМ людських ЛПНЩ в 0,01-0,05М оцтовому, або фосфатному або представленому їхньою комбінацією буфері з ph 4,0-5,4-6,5-7,0. Для активізації реакції в деяких випадках може бути додана біохімічна або електрохімічна система, що виробляє пероксиди. Наприклад, 1 мкт - 1 мт цитохрому С і від 0,1 нг до 0,1 мг цитохром С оксидази, або 0,1 мкт - 10 мт ксантина й 0,1 нг - 0,1 мг ксантиноксідази. Випробувані зразки можуть бути додані в концентрації від 0,1 нг до 10 мг білка й інкубуються протягом 1 години, 2-4 годин або протягом ночі при 37 °C. Потім у якості продуктів пероксидного окиснення визначаються або дієнові кон'югати, або гідроксіпероксид, або MDA, або інші молекули або радикальні групи. Концентрація цих продуктів пероксидного окиснення порівнюється з контрольними зразками, у яких замість грибкових продуктів використовується PBS або інші екстрактуючі або розчинники, що розбавляють. Наступний експеримент демонструє дію сирних екстрактів на окисні ураження, що є наслідком запалення, за даними вимірів за допомогою описаних вище випробувань. Наукове пояснення методології описане в посилальних матеріалах [1-3]. Досліджувалися анти-IOD властивості різних сирних екстрактів. Сир оссо-іраті не показав значимого ефекту на рівень запального окисного ураження (IOD) у випробуваній системі. З іншого боку, екстракти трьох інших сирів виявилися здатними сповільнювати цей процес (таблиця 6). Найбільш значні результати спостерігалися при використанні екстрактів, отриманих з області b сиру. Результати для екстрактів, отриманих із сиру кастелло, демонструють, що екстракти, гомогенізовані в PBS, були ефективними інгібіторами IOD, при цьому найбільш ефективними виявилися екстракти з високою молекулярною масою. У випадку сиру камамбер President найефективнішими були низькомолекулярні екстракти. У випадку сиру камамбер Le Medallion ефективними були як низько-, так високомолекулярні екстракти. Екстракти, отримані з рокфору й розчинені в PBS, були не настільки ефективними, як екстракти, отримані із сиру кастелло, камамбер President і камамбер Le Medallion. Згідно даним електрофорезу, екстракти, отримані з кастелло й рокфору, гомогенізованих в PBS, і фракції цих екстрактів містили значно менше білка, ніж ці два види сиру камамбер (фіг. 4). Тому можна припустити, що анти-IOD активність обумовлюється полісахаридами, які могли бути метаболітами й/або частинами Реnісіllium roqueforti, вирощених в особливих умовах у ході дозрівання цього сиру. Етанольні екстракти всіх чотирьох сирів, що досліджувалися, були ефективними інгібіторами IOD. Додавання до екстрактів, отриманих з рокфору, соляної кислоти (HCl) побільшало рівні інгібування IOD. Результати представлено в таблиці 7. Клінічне випробування Був оцінений ефект споживання сиру рокфор на відібраних пацієнтах з ішемічною хворобою серця (CHD). Пацієнти з CHD також показали позитивні результати тестів або на антитіла IgG до Chlamydia pneumoniae (ELISA, Medac) і/або на підвищений рівень загального холестерину. До участі в дослідженні було притягнуто 30 пацієнтів, 16 чоловіків і 14 жінок, у віці 45-66 років. Ці пацієнти були рандомізовані по двом рівним групам. Три пацієнти випробування не закінчили й тому були виключені з дослідження. Контрольна група споживала сир оссо-іраті. Іспитова група споживала сир рокфор. Пацієнтам було рекомендовано вживати обидва сири двічі в день у вигляді легкої закуски порціями близько 25 грамів. Кров на аналізи відбиралася на початку випробування й після 8 тижнів знаходження на сирній дієті. Аналіз крові виконувався сліпим методом. Результати цих випробувань представлено в таблиці 8. У групі, що споживали сир рокфор, було відзначене зниження титрів специфічних антитіл до Chlamydia, крім того, поменшала кількість пацієнтів з позитивними результатами аналізів на 17 UA 114605 C2 5 10 15 20 25 30 Chlamydia. Перед випробуванням тільки 3 пацієнта показали негативні аналізи на Chlamydia, через 8 тижнів негативні аналізи на Chlamydia були в 6 пацієнтів. Жоден з пацієнтів у контрольній групі не став демонструвати негативні аналізи на Chlamydia. Подібна тенденція спостерігалася й для концентрації загального холестерину. До випробування 4 пацієнта з 14, що входять у когорту рокфору, показали підвищені рівні холестерину. Після випробування у всіх пацієнтів (стовпець 1) холестерин був знижений до 200 мг/дл і нижче. Важливо також відзначити значне скорочення часток холестерину ЛПНЩ. Було відзначене зниження в основній групі ліпідів, тригліцеридів і значна тенденція до зниження ферментів печінки ALT і AST (ліпіди були представлені в мг/дл, а ферменти в од./мл). Останні не були збільшені на початку випробування, однак ця тенденція може вказувати на деякі позитивні зміни в печінці. У контрольній групі такі ефекти не спостерігалися. Запалення в печінці може бути реакцією на наявність Chlamydia, а рівень запального окисного ураження у хворих на дієті з рокфором був знижений. Ця тенденція поширилася й на кров, що відображається концентрацією MDA (мт). У групі контрольного сиру ніяких змін цього параметра відзначене не було. Бібліографія 1. Petyaev I.M., Hunt J.V. (1996), Redox report, том 2, No.6, 365-372. 2. Petyaev I.M. і ін. (1998), Biochem.Soc.Trans., том 26, S43. 3. Petyaev I.M. (1999) в: "Superoxide Dismutase: Recent Advances and Clinical Applications" ("Супероксиддісмутаза: сучасні досягнення й клінічні додатки"), Paris, 40-44. 4. Petyaev І.Μ., Coussons P.J. (1999) в: "Superoxide Dismutase: Recent Advances and Clinical Applications" ("Супероксиддісмутаза: сучасні досягнення й клінічні додатки"), Paris, 51-54. 5. Bashmakov YK, і ін. (2010), Comp Hepatol., Jan 28; 9:3. 6. Yuriy K Bashmakov, і ін. (2010) World Journal of Hepatology, Feb 27; 2(2):74-80. 7. Petyaev IM, і ін. (2010), Int J Med Sci. 2010 Jun 10; 7(4):181-90 8. Ivan M. Petyaev, і ін. (2011) HYBRIDOMA, том 30, № 2:131-136. 9. Chalyk NE, і ін. (2009), Klin Lab Diagn. 2009 Aug; (8):7-8. 10. Petyaev I. Advances in Heart Disease-Proceedings of the 12th World Congress on Heart Disease-New Trends in Research and Treatment (Успіхи в лікуванні захворювань серця Матеріали 12-ого Всесвітнього конгресу по захворюваннях серця - нові тенденції в дослідженнях і терапії). Ванкувер, Канада, 2005; 16-19 липня: 277-283. Таблиця 1 Підвищення змісту білка в сирних фракціях (результати типового експерименту) Сири Рокфор Castello® Камамбер Sainte Mere Камамбер President Екстракти і їх фракції Екстракт в PBS PBS-1 PBS-2 PBS-3 Екстракт в PBS PBS-1 PBS-2 PBS-3 Екстракт в PBS PBS-1 PBS-2 PBS-3 Екстракт в PBS PBS-1 PBS-2 PBS-3 18 Концентрація білка 36 мг/мл 3,1 мг/мл 3,4 мг/мл 6,1 мг/мл 51,6 мг/мл 14,6 мг/мл 2,8 мг/мл 1,8 мг/мл 66,8 мг/мл 26,6 мг/мл 7,8 мг/мл 1,7 мг/мл 66,8 мг/мл 29,6 мг/мл 6,6 мг/мл 0,9 мг/мл UA 114605 C2 Таблиця 2 Дозозалежний ефект екстракту сиру рокфор (b) на зростання Е. coli, S. Saprophyticus і Candida* Мікроорганізми Escherichia coli Staphylococcus saprophyticus Candida albicans Кількість мікроорганізмів після додавання екстракту сиру рокфор (b) до живильних середовищ (ммкг білка/мл**) 0 25 50 75 100 108 108 107 106 106 107 107 107 106 106 106 106 105 104 104 6 * Концентрація мікроорганізмів на початку експерименту становила 10 KOE/мл. ** Інкубування протягом 18 годин при 37 °C. Таблиця 3 Ефекти екстрактів в PBS і фракцій на зростання Chlamydia trachomatis у клітинній культурі Сири і їх фракції Рокфор PBS-1 PBS-2 PBS-3 Castello® PBS-1 PBS-2 PBS-3 Камамбер Sainte Mere PBS-1 PBS-2 PBS-3 Камамбер President PBS-1 PBS-2 PBS-3 Концентрація Дія на зростання Chlamydia trachomatis 62 мкг/мл 150мкг/мл 69 мкг/мл 305 мкг/мл Інгібування Повне інгібування Відсутність ефекту Відсутність ефекту 292 мкг/мл 56 мкг/мл 90 мкг/мл Інгібування Відсутність ефекту Відсутність ефекту 532 мкг/мл 156 мкг/мл 85 мкг/мл Відсутність ефекту Відсутність ефекту Відсутність ефекту 1 480 мкг/мл 132 мкг/мл 45 мкг/мл Інгібування Відсутність ефекту Відсутність ефекту Таблиця 4 Ефект екстрактів, отриманих з ділянок сиру рокфор (а) і (b), на продукування цитокінів* у клітинній культурі через 48 годин після інокуляції Chlamydia trachomatis Концентрація цитокінів у пг/мл BMTNF-? IL-4 IL-6 IL-8 IL-10 IFN-? IL-Ib CSF *2,41 OOR< 5,47 1022,59 OOR< OOR< 57,83 4,42 Негативний контроль Позитивний 1033,51 9,54 8324,56 151106 52,1 контроль Ch. trachomatis L2 5 19 Дія на інфекцію Ch. trahomatis 6 6 2410 4,610 21487 60 % інфікованих клітин - великі кластери бактерій UA 114605 C2 Продовження Таблиці 4 + фракція "b", 219,61 OOR< 49,09 20 мкг білка + Сир рокфор 6 6 6 2210 OOR< 2510 410 *2,86 + фракція "b", 113,27 40 мкг білка + фракція "а", 698,21 20 мкг білка 0,48 23,2 1710 6 1,5 89,21 2910 6 5,13 19106 2,7106 11,96 + фракція "а", 310,12 40 мкг білка 0,61 36,18 2710 6 *0,67 22106 5,1106 OOR = поза верхніми межами діапазону / OOR 0,05 Оссо-Іраті (n=8)**** 226±19 220±27, p> 0,05 Δ=6 немає даних Δ=18 130 (188) ±11, p< 0,05 74 (172) ±18, 115 (181) ±14, Рокфор (n=8)**** 238±25 Δ=104 p< 0,01 Δ=164 p< 0,01 Δ=123 105±21, p< 0,01 130±16, p< 0,01 Кастелло (n=5)**** 241±21 140±17, p< 0,05 Δ=101 Δ=136 Δ=111 107±15, p< 0,01 114±17, p< 0,01 Камамбер (n=5)**** 219±23 132±18, p< 0,05 Δ=87 Δ=122 Δ=105 Сири - зростання рівня запального окиснення; *сироватка від пацієнтів з гострими запальними станами; **200 мкг білка в 1 мл сироватки; ***MDA - малоновий діальдегід; ****кількість проаналізованих зразків сироватки. 5 20 UA 114605 C2 Таблиця 7 Інгібування IOD в ex vivo випробувальній системі з різними фракціями сирних білків і етанольними екстрактами* Рівень IOD після 24 годин інкубування з різними сирними фракціями, у мкМ MDA Екстракти BS і їх фракції Етанольні екстракти Сири ЕтанольКонцентрація Екстракт фракція фракція фракція Доданий Екстракт ний білка bPBS 1 2 3 обсяг етанол-HCl екстракт Рокфор 10 мкг 30мкг Δ=3 10 мкл Δ=42 Δ=52 50 мкг Δ=0 Δ=0 50мкл Δ=39 Δ=51 150 мкг Δ=23 360 мкг Δ=9 Δ=28 Δ=3 Кастелло 10 мкг 30 мкг Δ=7 10 мкл Δ=35 Δ=38 50 мкг Δ=50 Δ=22 50 мкл Δ=45 Δ=44 150 мкг Δ=17 516 мкг Δ=45 Δ=27 Δ=49 Камамбер 10 мкг President 30 MMΔ=64 10 мкл Δ=44 Δ=50 50 мкг Δ=13 Δ=62 50 мкл Δ=61 Δ=58 150 мкг Δ=65 668 мкг Δ=19 Δ=55 Δ=29 *скорочення такі ж, як і в таблиці 6; Δ - зростання рівня запального окиснення, середнє по 3 паралельних випробуваннях. 21 UA 114605 C2 ФОРМУЛА ВИНАХОДУ 5 10 15 20 25 30 35 40 1. Застосування композиції, яка містить: (і) ферментований грибками сир, що містить популяцію клітин і/або спор харчових грибків; (іі) екстракт, отриманий з вказаного ферментованого грибками сиру за (і); і/або (ііі) харчовий продукт, напій або добавку, що містить вказаний ферментований грибками сир за (і) або екстракт за (іі), в профілактиці або терапії інфекцій, запалень або запальних уражень, де грибок, що використаний у виробництві вказаного сиру, вибраний із грибків роду Реnісіllium. 2. Застосування композиції за п. 1, де: (a) запальне ураження є кислотним ураженням; або (b) композиція є збагаченим харчовим продуктом або напоєм, харчовою добавкою, дієтичною добавкою, нутрицевтичним продуктом, фармацевтичним продуктом, дерматологічним топічним продуктом або косметичним топічним продуктом. 3. Застосування композиції за п. 1 або 2, де композиція призначена для терапії чи профілактики інфекції, спричиненої Candida, інфекції, спричиненої Chlamydia, або інфекції, спричиненої Helicobacter pylori. 4. Застосування композиції за будь-яким із пп. 1-3, у якій грибки вибирають з Реnісіllium roqueforti, Реnісіllium camemberti, Реnісіllium candidum, Реnісіllium glaucum або Реnісіllium nalgiovense. 5. Застосування композиції за будь-яким із попередніх пунктів, де (a) композиція є або містить блакитний або білий ферментований грибками сир, харчовий продукт або напій, що містить вказаний сир або екстракт вказаного сиру; (b) композиція містить або є екстрактом сиру, вибраного із сиру рокфор, камамбер, блакитний вершковий, стілтон, кабралес, камбоцола, фурм-д'Амбер, ґоргонзола, блє-д'Овернь або Cibosano; або (c) композиція містить або є екстрактом сиру рокфор. 6. Застосування композиції за будь-яким із попередніх пунктів, у якому екстракт готується змішуванням сиру з рідкою фазою й відділенням рідкої фази. 7. Застосування композиції за п. 6, де рідка фаза: (a) є водним або неводним розчинником; (b) вибирається з фосфатно-сольового буферного розчину (PBS), метанолу, етанолу, соляної кислоти або суміші етанолу із соляною кислотою; (c) відділяється центрифугуванням або фільтрацією; і/або (d) слідом за відділенням стерилізується або пастеризується. 8. Застосування композиції за будь-яким із попередніх пунктів, де композицію упаковують в упаковку із наданою оцінкою в балах або із розрядом, що вказують рівень активності композиції відносно зниження або профілактики певних станів. 22 UA 114605 C2 5 10 15 9. Застосування композиції, яка містить: (і) ферментований грибками сир, що містить популяцію клітин і/або спор харчових грибків; (іі) екстракт, отриманий з вказаного ферментованого грибками сиру за (і); і/або (ііі) харчовий продукт, напій або добавку, що містить вказаний ферментований грибками сир за (і) або екстракт за (іі), у виробництві лікарського засобу для профілактики або терапії інфекцій, запалень або запальних уражень, де грибок, що використаний у виробництві вказаного сиру, вибраний із грибків роду Реnісіllium. 10. Спосіб одержання екстракту, призначеного для застосування в профілактиці або терапії інфекцій, запалень або запальних уражень, що включає: (а) забезпечення ферментованого грибками сиру, що містить популяцію клітин і/або спор харчових грибків; (b) домішування ферментованого грибками сиру до рідкої фази; і (c) відділення рідкої фази для одержання екстракту, де грибок, що використаний у виробництві вказаного сиру, вибраний із грибків роду Реnісіllium. 23 UA 114605 C2 24 UA 114605 C2 25 UA 114605 C2 Комп’ютерна верстка Л. Литвиненко Міністерство економічного розвитку і торгівлі України, вул. М. Грушевського, 12/2, м. Київ, 01008, Україна ДП “Український інститут інтелектуальної власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 26