Застосування антитіла до cd151 для лікування первинних пухлин

Реферат: Винахід належить до застосування антитіла, здатного зв'язуватися з білком CD151 і інгібувати ріст пухлинних клітин, для одержання лікарського засобу, призначеного для лікування первинних пухлин. UA 99601 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Даний винахід стосується нового застосування антитіл до CD 151, здатних інгібувати ріст пухлин, причому вказані антитіла є, зокрема, мишачими, химерними або гуманізованими моноклональними антитілами. Відповідно до приватного варіанту, винахід стосується застосування цих антитіл або їх функціональних фрагментів як лікарських препаратів для профілактичного і/або терапевтичного лікування раку. Винахід стосується також продуктів і/або композицій, що містять такі антитіла, асоційовані, наприклад, з протираковими антитілами і/або з протираковими агентами, або кон'юговані з токсинами, і до їх застосування для профілактичного і/або терапевтичного лікування деяких видів раку. CD 151, званий також PETA-3 або SFA-1, являє собою мембранний білок, що належить до сімейства тетраспанінів (Boucheix et Rubinstein, 2001, Cell Mol. Life Sci.58, 1189-1205; Hemler, 2001, J.Cell Biol. 155, 1103-1107). У людей CD 151 має 253 амінокислоти і містить 4 мембранних фрагмента і 2 позаклітинних домени ЕС1 (18 амінокислот, послідовність [40-57]) і ЕС2 (109 амінокислот, послідовність [113-221]), званих також позаклітинними петлями. Потрібно відмітити, однак, що для CD 151 на сьогоднішній день ідентифіковані два варіанти нуклеотидної послідовності, а саме, один, що включає нуклеотиди А і С відповідно в положеннях 395 і 409 (SEQ ID No.1) [Fitter et al., Blood 86(4), 1348-1355] і другий, що включає в тих же положеннях нуклеотиди G і Т замість нуклеотидів А і С [Hasegawa et al., 1996, J.Virol. 70(5), 3258-3263]. У зв'язку з цим може спостерігатися мутація на рівні пептидної послідовності, а саме, мутація залишків До (Lys) і Р (Pro) відповідно в положеннях 132 і 137 в залишки R (Arg) і S (Ser) [Fitter et al., 1995, Blood 86(4), 1348-1355/Hasedawa et al., 1996, J.Virol. 70(5), 3258-3263]. CD151 суперекспресується в різних ракових клітинах, як, наприклад, в клітинах раку легень [Tokuhara et al., 2001, Clin.Cancer Res. 7, 4109-4114], товстої кишки [Hashida et al., 2003, Br.J.Cancer 89, 158-167], передміхурової залози [Ang et al., 2004, Cancer Epidemiol. Biomarkers Prev. 13, 1717-1721] або підшлункової залози [Gesierich et al., 2005, Clin.Cancer Res. 11, 28402852]. Використання мишей з нокаутом, не експресуючих CD 151, і антитіл до CD 151 і міРНК для блокування функціонування in vitro і експресії CD 151 в клітинах різного типу, дозволило продемонструвати, що CD 151 задіяний в різноманітних процесах, пов'язаних з раком, таких як клітинна адгезія (Nishiuchi et al., 2005, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102, 1939-1944; Winterwood et al., 2006, Mol. Biol. Cell 17, 2707-2721), рухливість клітин (Kohno et al., 2002, Int. J. Cancer 97, 336-343), клітинна міграція (Yauch et al., 1998, Mol. Biol. Cell 9, 2751-2765; Testa et al., 1999, Cancer Res. 59, 3812-3820; Penas et al., 2000, J. Invest. Dermatol. 114, 1126-1135; Klosek et al., 2005, Biochem. Biophys. Res. Commun. 336, 408-416), клітинна інвазія (Kohno et al., 2002, Int. J. Cancer 97, 336-343; Shiomi et al., 2005, Lab. Invest. 85, 1489-1506; Hong et al., 2006, J. Biol. Chem. 281, 24279-24292) і ангіогенез (Yanez-Mo et al., 1998, J. Cell Biol. 141, 791-804; Sincock et al., 1999, J. Cell Sci. 112, 833-844; Takeda et al., 2006, Blood). Однією з відмітних властивостей тетраспанінів є здатність їх до асоціації один з одним, а також з великою кількістю інших поверхневих молекул з утворенням структурованих макромолекулярних комплексів. Всередині цих комплексів кожний тетраспанін специфічно асоціюється з однією або декількома поверхневими молекулами, утворюючи, таким чином, первинні комплекси, що складаються з одного тетраспаніну і однієї молекули-партнера. Тетраспаніни можуть організовувати особливі мікродомени плазматичної мембрани, всередині яких вони очевидно рекрутують своїх молекулярних партнерів, які могли б поєднуватися за функціональною ознакою. Сукупність взаємодій, в яких беруть участь тетраспаніни, називають "тетраспанінівою мережею" або "Тетраспаніном Web". CD 151 взаємодіє на поверхні клітин з різними мембранними білками. Зокрема, були виявлені дуже стабільні комплекси, резистентні до дії деяких детергентів, з інтегринами, що є рецепторами ламінінів, більш конкретно, з інтегринами α3β1 або α6β4, переважним лігандом яких є ламінін 5 (Yauch et al., 1998, Mol. Diol. Cell 9, 2751-2765; Lammerding et al., 2003, Proc. Natl. Acad. Sci USA 100, 7616-7621). Ця асоціація залучає позаклітинні домени білка CD151 і інтегринів. Послідовність QRD [194-196] білка CD 151, локалізована в петлі ЕС2, дуже важлива в цій асоціації, оскільки мутація цього сайта призводить до втрати взаємодії з деякими інтегринами (Kazarov et al., 2002, J. Cell Biol. 158, 1299-1309). З іншого боку, в пухлинних клітинах були виявлені третинні функціональні комплекси CD151/интегрин α6β4/с-Met (рецептор HGF) (Klosek et al. 2005, Вiochem. Biophys. Res. Commun. 336, 408-416). Інгібування експресії CD 151 обробкою клітин за допомогою інтерференції РНК призводить до інгібування росту і міграції клітин, що індукується HGF. Взаємодії всередині самої клітини CD 151 з іншими тетраспанінами, необхідні для формування мережі тетраспанінів, мабуть залежать від мембранних і цитоплазмічних ділянок 1 UA 99601 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 CD151, оскільки було доведено, що делеція петлі ЕС2 не руйнує асоціацію CD 151 з іншими тетраспанінами (Berditchevski, 2001, J. Cell Sci. 114, 4143-4151). CD 151 здатний регулювати процеси адгезії, міграції і інвазії клітин шляхом модулювання різних сигнальних шляхів, таких як, наприклад, шлях фосфоінозитидів через асоціацію з Р14кіназою (Yauch et al., 1998, Mol. Diol. Cell 9, 2751-2765), сигнальний шлях с-Jun через фосфорилування FAK, Src, h38-MAPK і JNK (Hong et al., 2006), фосфорилування інтегринів за допомогою PKC (Zhang et al., 2001, J. Biol. Chem. 276, 2500-25013), активацію GNPаз сімейства Rho (Shigeta et al., 2003, J. Cell Biol. 163, 165-176). Взаємодії гомофільного типу між клітинами також відповідальні за збільшення клітинної рухливості і експресії металопротеїнази ММР-9 (Hong et al., 2006). Ці міжклітинні взаємодії CD151-CD151 викликають активацію с-Jun за допомогою фосфорилування FAK, Src, p38-MAPK і JNK. На сьогоднішній день, незважаючи на привабливість білка CD151, було виділене єдине антитіло для використання з терапевтичною метою, а саме, моноклональне антитіло 50-6. Моноклональне антитіло 50-6 (ізотип IgG1), направлене проти CD 151, було виділено у миші шляхом субстратної імунізації з використанням людських клітин епідермоїдної карциноми НЕр-3 (Testa et al., 1999, Cancer Res. 59, 3812-3820). Антитіло 50-6 здатне інгібувати in vitro міграцію клітин людини цервікальної карциноми HeLa, трансфікованих з метою суперекспресії CD 151, і клітин НЕр-3, і ангіогенез на моделі неоваскуляризації хоріоалантойної мембрани, індукованої bFGF (basic fibroblast growth factor). Воно інгібує in vivo метастазування, індуковане інокуляцією клітин HEp-3 на 2 моделях курячого ембріону (Testa et al, 1999, Cancer Res. 59, 3812-3820). У цих моделях інгібувальна активність антитіла 50-6 визначається вимірюванням активності білка huPA (human urokinase-type plasminogen activator) в екстрактах легень. Згідно з авторами цей аналіз відображає наявність клітин людини в легенях. Після аналізу зниження метастазування (розростання клітин НЕр-3 в легенях курячих ембріонів), індуковане антитілом 50-6, оцінюється, в порівнянні з контрольним антитілом, як 74 % на моделі, названій "спонтанне метастазування", в якій за інокуляцією клітин іде ін'єкція антитіла, і як 57 % на моделі, названій "експериментальне метастазування", в якій клітини і антитіло спільно інокульовані. Згідно з авторами, протипухлинні властивості антитіла 50-6, що спостерігаються in vivo, не пов'язані, видно, з цитостатчним або цитотоксичним ефектом, оскільки не доведено ніякої дії на проліферацію in vitro клітин НЕр-3. Гібридома, що продукує антитіло 50-6, знаходиться в АТСС під номером CRL-2696 (гібридома, депонована спочатку під номером 50-6 [РОТА-227]). Відповідно до загального аспекту, даний винахід стосується застосування щонайменше одного антитіла або одного з його функціональних фрагментів, здатного зв'язуватися з білком CD 151 і таким чином інгібувати ріст пухлини, для одержання лікарського засобу, призначеного для лікування раку. Множина експериментальних досліджень довела головну роль тетраспанінів в утворенні метастазів, діючи або як супресори, або як промотори метастазів. Таким чином, трансфекція тетраспанінів, таких як CD9, CD63 або CD82, знижує метастатичний потенціал ліній ракових клітин. І навпаки, експресія тетраспанінів CD151 і Co-029 ймовірно робить зворотний ефект. Отже, ці 2 тетраспаніни є, ймовірно, промоторами метастазування. Ці результати узгоджуються з різними клінічними дослідженнями, які показали, що в багатьох ракових клітинах (раку молочних залоз, легені, стравоходу, шлунку, печінки, підшлункової залози, товстої кишки, передміхурової залози, меланоми…), CD9 і CD82 менше експресуються на стадії первинних пухлин, якщо відбувається метастазування, і зниження їх експресії передбачає більш низьку тривалість життя. При раку лелгені сумарне зниження експресії CD9 і CD82 корелюється з більш високим метастатчним потенціалом в порівнянні з тим, коли експресія одного з цих двох антигенів зменшена. Множина проведених раніше досліджень показала, що суперекспресія CD151 асоціюється з агресивністю деяких видів раку, таких як рак легень, товстої кишки і передміхурової залози, і може розглядатися як фактор поганого прогнозу (Тokuhara et al., 2001, Clin. Cancer Res. 7, 41094114; Hashida er al., 2003, Br.J. Cancer 89, 158-167; Ang et al., 2004, Cancer Epidermiol. Biomarkers Prev. 13, 1717-1721). У цих випадках середня тривалість життя дійсно зменшується у пацієнтів, пухлина яких експресує CD151, в порівнянні з пацієнтами, пухлина яких не експресує CD151. Суперекспресія CD151 в різних пухлинних лініях клітин людини (HeLa, RPMI14788, A172, HT1080), індукована трансфекцією відповідного гена, провокує збільшення рухливості, міграції і інвазії трансфікованих клітин (Testa et al., 1999, Cancer Res. 59, 3812-3820); Kohno et al, 2002, Int. Cancer 97, 336-343). Ці процеси інгібуються в присутності антитіла проти CD151. 2 UA 99601 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Відповідно до іншого аспекту, функціональні фрагменти антитіл згідно з винаходом походять, наприклад, з фрагментів Fv, scFv (sc - простий ланцюг (simple chaine)), Fab, F(ab') 2, Fab', scFv-Fc або діатіл, або з будь-якого фрагмента, напів-період життя якого можна було б збільшити шляхом хімічної модифікації, такої як введення полі(алкілен)гліколю, такого як полі(етилен)гліколь ("ПЕГлікозилювання") (ПЕГлікозильовані фрагменти називають Fv-PEG, scFv-PEG, Fab-PEG, F(ab')2-PEG або Fab'-PEG) ("PEG" згідно з англійською номенклатурою Poly(Ethylene)Glycol), або шляхом включення в ліпосому, мікросфери або PLGA, причому вказані фрагменти здатні як правило виявляти активність, навіть часткову, того антитіла, з якого вони одержані. Переважно, вказані функціональні фрагменти являють собою або включають часткову послідовність важкого або легкого варіабельного ланцюга антитіла, з якого вони одержані, причому вказана часткова послідовність достатня, щоб зберегти таку ж специфічність зв'язування, яка властива антитілу, з якого вона одержана, і достатню афінність, переважно, рівну щонайменше 1/100, більш переважно, 1/10 афінності антитіла, з яких вона одержана. Такий функціональний фрагмент містить не менше 5 амінокислот, переважно, 10, 15, 25, 50 і 100 послідовних амінокислот послідовності антитіла, з якого він одержаний. Переважно, ці функціональні фрагменти є фрагментами типу Fv, scFv, Fab, F(ab')2, F(ab'), scFv-Fc або діатілами, які мають зазвичай таку ж специфічність зв'язування, як і антитіло, з якого вони одержані. Відповідно до даного винаходу фрагменти антитіла згідно з винаходом можуть бути одержані з антитіл, які описані вище, такими способами, як перетравлювання ферментами, такими як пепсин або папаїн і/або розщеплення дисульфідних місточків шляхом хімічного відновлення. З іншого боку, фрагменти антитіла згідно з винаходом можуть бути одержані методами генетичних рекомбінацій, також добре відомих фахівцеві, або ж шляхом пептидного синтезу за допомогою, наприклад, автоматичних пептидних синтезаторів, таких як синтезатори, що поставляються фірмою Applied. Згідно з аспектом винаходу, антитіло, що використовується, являє собою мишаче моноклональне антитіло. Під антитілами згідно з винаходом розуміють також химерні або гуманізовані антитіла. Під химерним антитілом розуміють антитіло, яке містить натуральну варіабельну ділянку (легкий ланцюг і важкий ланцюг), що походить з антитіла заданого типу, асоційованого з константними ділянками легкого і важкого ланцюга антитіла типу, гетерологічного по відношенню до вказаного заданого типу. Антитіла або їх фрагменти химерного типу, що використовуються згідно з винаходом, можуть бути одержані з використанням методів генетичної рекомбінації. Наприклад, химерне антитіло може бути одержане шляхом клонування рекомбінантної ДНК, що містить промотор і послідовність, що кодує варіабельну ділянку моноклонального антитіла, яке не належить людині, зокрема, миші, згідно з винаходом, і послідовність, що кодує константну ділянку антитіла людини. Химерним антитілом згідно з винаходом, таким рекомбінантним геном, що кодується, є, наприклад, химера миша/людина, причому специфічність цього антитіла детермінується варіабельною ділянкою, одержаною з ДНК миші і її ізотипу, що детермінується константною ділянкою ДНК людини. Для знайомства з методами одержання химерних антитіл можна послатися, наприклад, на документ Verhoeyn і співроб. (BioEssays, 8:74, 1988). Під гуманізованими антитілами розуміють антитіло, яке містить ділянки CDRs, одержані з антитіла, що не належить людині, а інші частини молекули антитіла одержані з одного (або декількох) антитіл людини. Крім того, деякі залишки сегментів скелета (звані FR), можуть бути модифіковані для збереження афінності зв'язування (Jones et al., Nature, 321:522-525, 1986; Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536, 1988; Riechmann et al., Nature, 332:323-327, 1988). Гуманізовані антитіла або їх функціональні фрагменти, можуть бути одержані відомими фахівцеві способами (такими, наприклад, які описані в документах Singler et al., J. Immun. 150:2844-2857, 1992; Mountain et al., Biotechnol. Genet. Eng. Rev., 10:1-42, 1992; Bebbington et al., Bio/Technology, 10:169-175, 1992). Такі гуманізовані антитіла переважно використовують в способах профілактичного і/або терапевтичного лікування in vivo. Інші способи гуманізування також відомі фахівцеві, такі як, наприклад, спосіб "CDR Grafting", описаний PDL, що є об'єктом винаходу патентів ЕР 0451261, ЕР 0682040, ЕР 0939127, ЕР 0 566647 або ж патентів US 5530101, US 6180370, US 5585089 US 5693761. Можна також назвати патенти US 5639641 або ж 6054297, 5886152 і 5877293. У даному винаході несподівано і абсолютно неочевидно для фахівця вперше запропоновано застосовувати антитіло до CD151, описане вище, або один з його функціональних фрагментів, здатне інгібувати проліферацію пухлинних клітин і розвиток 3 UA 99601 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 первинної пухлини, незалежно від його здатності інгібувати ангіогенез і/або утворення метастазів. Таким чином, антитіла, описані в даний заявці, мають здатність інгібувати на дуже ранній стадії розвиток пухлин. Ця протипухлинна активність антитіл згідно з винаходом є новою і несподіваною властивістю для антитіла, направленого до CD151, оскільки жодне антитіло до CD151, описане на сьогоднішній день, не має активність цього типу. Таким чином, антитіла згідно з винаходом мають властивість, відмінну і додаткову по відношенню до антитіл раніше описаних, зокрема, по відношенню до антитіла 50-6, оскільки протипухлинні властивості цього антитіла не пов'язані з дією на проліферацію пухлинних клітин. Цей результат свідчить також про те, що вперше виявлений зв'язок між CD151 і розвитком первинної пухлини і навіть проліферацією пухлинних клітин in vivo. Дійсно, на сьогоднішній день описані тільки про-метастатичні і про-ангіогенні активності CD151. Невпорядкована проліферація клітин будь-якого органу або тканини є одним з перших етапів утворення ракової пухлини. Пухлинні клітини є клітинами, які не здатні більше зазнавати нормального контролю росту клітин всередині даного органу або тканини. Ріст пухлини має експонентну динаміку, при цьому пухлинні клітини починають надмірно розмножуватися під впливом факторів росту і ангіогенезу. Згідно з головним аспектом, винахід стосується застосування щонайменше одного антитіла до CD151, або одного з його функціональних фрагментів, здатного інгібувати розвиток первинної пухлини і проліферацію пухлинних клітин. Більш конкретно, даний винахід стосується застосування щонайменше одного антитіла або одного з його функціональних фрагментів, здатного зв'язуватися з білком CD151, для одержання лікарського засобу, призначеного для лікування первинних пухлин. Крім того, автори винаходу передбачають, не засновуючись однак на будь-якій теорії, що застосування антитіла проти CD151 для лікування раку, представляє інтерес не тільки в зв'язку з інгібуванням ангіогенезу, але також в зв'язку з інгібуванням активності CD151, стимулюючої метастазування. Таким чином, даний винахід стосується застосування антитіла, описаного вище, або одного з його функціональних фрагментів, здатного інгібувати активність вказаного білка CD151, стимулюючу метастазування всередині пухлинних клітин. Більш конкретно, автори вважають, що це інгібування проявляє себе в інгібуванні різних етапів метастатичного процесу, зокрема, клітинної адгезії, міграції клітин і/або клітинної інвазії. Класичними етапами вказаної стимулюючої активності, більш конкретно, росту пухлини і метастатичних процесів, є наступні: 1) інвазія клітин первинної пухлини в з'єднувальні тканини, яка спричиняє за собою розщеплення за допомогою протеолітичних ферментів (таких як металопротеїнази) базальної мембрани і позаклітинного матрикса, що складаються з структурних білків, таких як ламінін, колаген або фібронектин, 2) міграція пухлинних клітин через тканини в циркулюючий потік крові, 3) прилипання до стінок судин і затримка в органі, 4) вихід з судини (новий етап інвазії) і адаптація до нового навколишнього середовища (проліферація і ангіогенез). Міграція клітин має істотне значення в процесі ембріонального розвитку. Незважаючи на те, що міграція клітин грає меншу роль у дорослих, деякі типи клітин, такі як лімфоцити, макрофаги і фібробласти, продовжують переміщуватися в процесі імунної відповіді, запалення і загоєння рани у дорослих для збереження гомеостазу. Однак при патології міграція пухлинних клітин сприяє головним чином розвитку пухлин на метастатичної стадії. Деяка кількість хемотаксичних факторів відповідальна за цю міграцію, цими факторами є похідні або пухлинних клітин, або клітин-хазяїнів. Серед таких факторів, потрібно назвати фактори росту (зокрема, фактори росту, які стимулюють ангіогенез), пептиди, що руйнують колаген, адгезивні білки, такі як ламінін і фібронектин. Згідно з приватним аспектом даний винахід стосується застосування щонайменше одного антитіла проти CD151 або одного з його функціональних фрагментів, здатного інгібувати клітинну міграцію пухлинних клітин. Інвазія є головною ознакою злоякісності пухлини: вона виходить за межі свого місця походження і розповсюджується в сусідні і віддалені тканини. Інвазивний характер виражається у втраті властивостей зазвичай властивих клітині: зазвичай клітини більшості тканин прилипають одна до одної за рахунок структур, званих десмосами, за рахунок адгезивних молекул; в епітелії клітини прилипають також і до базальної мембрани, яка лімітує глибину 4 UA 99601 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 епітелію. Пухлинні клітини втрачають ці нормальні якості і набувають нових. Зв'язки між ними послаблюються і клітини вивільняються одна від одної. Вони набувають рухливості, яка їм дозволяє відкріпитися від первинного місцеположення, проникнути (захопити) в сусідні тканини, слідуючи іноді за волокнами з'єднувальної тканини. Для епітеліїв, як правило, обмежуваних базальною мембраною, і для карцином, які з них виникли, ця мембрана стає першою перешкодою, яку треба подолати. Вона змінюється і розчиняється під дією ферментів (протеаз, катепсину), секретованих пухлинними клітинами. Подібна деструкція базальної мембрани іноді посилюється під дією ферментів, якими секретуються в нормальних умовах білими глобулами, але які відхилилися від своєї звичайної активності. Всі ці біологічні і молекулярні модифікації в поведінці клітин є умовою інвазії. Згідно з іншим аспектом, даний винахід стосується застосування щонайменше одного антитіла до CD151 або одного з його функціональних фрагментів, здатного інгібувати клітинну інвазію пухлинних клітин. Клітини організму прилипають один до одного і до позаклітинного матриксу, що оточує їх. Клітинна адгезія носить убіквітарний характер, беручи участь в більшості фізіологічних клітинних процесів, таких як виживання, проліферація і диференціювання клітин, і також беручи участь в різних патологічних ситуаціях, таких як, наприклад, рак і метастазування. Різні білки клітинної поверхні залучені в клітинну адгезію, такі як кадерини або інтегрини. Переважно, застосування згідно з винаходом полягає, головним чином, в інгібуванні клітинної адгезії. Згідно з ще одним аспектом, даний винахід стосується застосування щонайменше одного антитіла до CD151 або одного з його функціональних фрагментів, здатного інгібувати клітинну адгезію пухлинних клітин. Як вказано вище, білок CD151 належить до сімейства тетраспанінів і тому містить 2 позаклітинних домени ЕС1 (18 амінокислот, послідовність [40-57]) і ЕС2 (109 амінокислот, послідовність [113-221]), званих також позаклітинними петлями. Згідно з даним винаходом антитіла, що використовуються, здатні зв'язуватися щонайменше з одним епітопом, що знаходиться у позаклітинному домені. Переважно, вказане антитіло зв'язується на рівні петель ЕС1 і/або ЕС2. Більш конкретно, згідно з переважною формою здійснення винаходу, пропонується застосування щонайменше одного антитіла до CD151 або одного з його функціональних фрагментів, здатного зв'язуватися з одним епітопом, що знаходиться у позаклітинній петлі 1 (ЕС1) і/або 2 (ЕС2), переважно, в петлі ЕС2, що відповідають відповідно амінокислотам 40-57 (SEQ ID No6) і 113-221 (SEQ ID No4) білка CD151. Петля ЕС1 [40-57] містить 18 амінокислот і має теоретичну масу 2002,2 Да. Петля ЕС2 [113-221] включає сайт N-глікозилування (залишок Asn 159) і 6 залишків цистеїну, що утворюють 3 дисульфідні місточки. Структурна модель петлі ЕС2 тетраспанінів, зокрема, CD151, запропонована на основі тривимірної структури петлі ЕС2 тетраспаніну CD81 (Seigneuret et al., 2001, J. Biol. Chem. 276, 40055-40064). Згідно з цією моделлю тетраспаніни мають загальний скелет, відносно стійкий і що складається з 3 α-спіралей, і один специфічний варіабельний домен. У CD151 цей скелет ймовірно складається з ділянок [113-157] і [209-221] і варіабельного домену ділянки [158-208]. Варіабельний домен петлі ЕС2 ймовірно задіяний, більш конкретно, в специфічних взаємодіях CD151 з білками сімейства інтегринів. Експерименти з направленою мутацією довели, зокрема, важливість ділянки [193-208], більш конкретно, трипептиду QRD[194-196] і залишку цистеїну в положенні 192, в асоціації CD151 з деякими інтегринами, що є рецепторами ламініну, такими як інтегрини α3β1 або α3β4 (Kazarov et al., 2002, J. Cell. Biol. 158, 1299-1309). Більш переважно, даний винахід стосується застосування щонайменше одного антитіла до CD151 або одного з його функціональних фрагментів, здатного зв'язуватися з епітопом ділянки ЕС2, що включає щонайменше амінокислоти глутамін, аргінін і аспартат, відповідно в 194-196 положеннях 194, 195 і 196 (QRD ) білка CD151. Згідно з іншим аспектом, винахід полягає головним чином в застосуванні щонайменше одного антитіла до CD151 або одного з його функціональних фрагментів, яке являє собою моноклональне антитіло. Потрібно мати на увазі, що термін "моноклональне антитіло" означає антитіло, виділене з популяції практично гомогенних антитіл. Більш конкретно, індивідуальні антитіла однієї популяції є ідентичними, за винятком декількох можливих мутацій, які можуть природно походити, але частка яких в популяції мінімальна. Інакше кажучи, моноклональне антитіло являє собою гомогенне антитіло, що є продуктом проліферації тільки одного клітинного клону (наприклад, гібридоми, еукаріотичної клітини-хазяїна, трансфекованої молекулою ДНК, що 5 UA 99601 C2 5 10 15 20 кодує гомогенне антитіло, прокаріотичної клітини-хазяїна, трансфекованої молекулою ДНК, що кодує гомогенне антитіло, і т.д.) і яке зазвичай характеризується важкими ланцюгами одного і того ж класу і підкласу і легкими однотипними ланцюгами. Моноклональні антитіла володіють високою специфічністю і направлені тільки до одного антигену. Крім того, на відміну від препаратів поліклональних антитіл, які традиційно включають різні антитіла, направлені проти різних детермінант або епітопів, кожне моноклональне антитіло направлене тільки до одного епітопу антигену. Згідно з конкретним варіантом здійснення винаходу, моноклональне антитіло, що використовується вибирають з антитіл TS151 і TS151r. У подальшому описі позначення TS151r і TS151R є взаємозамінними. Отже, даний винахід стосується застосування щонайменше одного антитіла до CD151 або одного з його функціональних фрагментів, при якому вказане антитіло являє собою антитіло TS151 і/або антитіло TS151r. Більш конкретно, антитіло TS151 характеризується тим, що воно включає щонайменше: - 3 CDRs важкого ланцюга CDR-H1, CDR-H2 і CDR-H3 відповідно послідовності SEQ ID No.7, 8 і 9; і - 3 CDRs легкого ланцюга CDR-L1, CDR-L2 і CDR-L3 відповідно послідовності SEQ ID No.11, 12 і 13. Згідно з іншим варіантом здійснення, антитіло TS151 характеризується тим, що воно включає один важкий ланцюг, що містить послідовність SEQ ID No.10, і один легкий ланцюг, що містить послідовність SEQ ID No.14. У представлену нижче таблицю 1 зведені вказані елементи. Таблиця 1 Антитіло TS151 Легкий ланцюг Важкий ланцюг CDR-H1 CDR-H2 CDR-H3 CDR-L1 CDR-L2 CDR-L3 повний (варіабельний домен) повний (варіабельний домен) 25 30 SEQ ID No 7 8 9 11 12 13 10 14 Що стосується антитіла TS151r, то воно характеризується тим, що включає щонайменше: - 3 CDRs важкого ланцюга CDR-H1, CDR-H2 і CDR-H3 відповідно послідовності SEQ ID No.15,16 і 17; і - 3 CDRs легкого ланцюга CDR-L1, CDR-L2 і CDR-L3 відповідно послідовності SEQ ID No.19,20 і 21. Згідно з іншим варіантом здійснення, антитіло TS151r характеризується тим, що воно включає один важкий ланцюг, що містить послідовність SEQ ID No.18, і один легкий ланцюг, що містить послідовність SEQ ID No.22. У представлену нижче таблицю 2 зведені вказані елементи. Таблиця 2 Антитіло TS151r Легкий ланцюг Важкий ланцюг CDR-H1 CDR-H2 CDR-H3 CDR-L1 CDR-L2 CDR-L3 повний (варіабельний домен) повний (варіабельний домен) SEQ ID No 15 16 17 19 20 21 18 22 35 Згідно з іншим варіантом здійснення, в таблиці 3, представленій нижче, об'єднані нуклеотидні послідовності антитіл TS151 і TS151r. 6 UA 99601 C2 Таблиця 3 Антитіло TS151 Легкий ланцюг Важкий ланцюг CDR-H1 CDR-H2 CDR-H3 CDR-L1 CDR-L2 CDR-L3 повний (варіабельний домен) повний (варіабельний домен) CDR-H1 CDR-H2 CDR-H3 TS151r CDR-L1 CDR-L2 CDR-L3 повний (варіабельний домен) повний (варіабельний домен) 5 10 15 20 25 30 35 40 SEQ ID No 23 24 25 27 28 29 26 30 31 32 33 35 36 37 34 38 Одержання вказаних антитіл детально описане в прикладі 1. Еті 2 антитіла направлені до різних епітопів, оскільки TS151 добре розпізнає білок CD151, коли він асоційований з інтегринами або знаходиться у вільному вигляді на поверхні клітини (Chometon et al., 2006, Exp. Cell Res. 312, 983-995), в той час як антитіло TS151r не розпізнає комплекси CD151-інтегрини (Serru et al., 1999, Biochem. J. 340, 103-111; Geary et al., 2001, Tissue Antigenes 58, 141-153; Kazarov et al., 2002, J. Cell Biol. 158, 1299-1309; Sterk et al., 2002, J. Cell Sci. 115, 1161-1173). Епітоп, пізнаваний TS151r, локалізований в петлі ЕС2 і містить залишки Q194, R195 D196 (Kazarov et al., 2002, J. Cell Biol. 158, 1299-1309). Отже, це антитіло, принаймні частково, направлене до сайту CD151, що бере участь у взаємодіях з інтегринами. Залишок С192, очевидно, також сам бере участь в розпізнаванні CD151 за допомогою і TS151r (Kazarov et al., 2002, J. Cell Biol. 158, 1299-1309). Епітоп антитіла TS151, хоча і відрізняється від епітопу антитіла TS151r, точно не визначений. Обробка кератиноцитів людини (лінія клітин епітелію НаСаТ) антитілом TS151r призводить до втрати контакту клітина-клітина, до перегрупування цитоскелету, внутрішньоклітинного перерозподілу інтегрину α6β4 і збільшення міграції клітин на ламініні 1 (Chometon et al., 2006, Exp. Cell Res. 312, 983-995). Більш конкретно, переважно антитіло, що використовується, являє собою антитіло TS151. Переважно, використання антитіл проти CD151 в межах лікування раку особливо виправдовується у випадку раку, ракові клітини якого суперекспресують той же рецептор CD151. До таких форм раку належить рак товстої кишки [Hashida et al., Br. J. Cancer 89 (2003): 158167], рак легкого, переважно, недрібноклітинний рак легені [Tokuhara et al., Clin. Cancer Res. 7 (2001): 4109-4114], рак передміхурової залози [Ang et al., Cancer Epidemiol. Biomarkers 13 (2004):1717-1721] і рак підшлункової залози [Gesierich et al., Clin. Cancer Res. 11(2005):28402852]. Таким чином, даний винахід стосується застосування антитіла, описаного вище, для лікування раку, причому раком переважно є рак товстої кишки, легені, передміхурової залози або підшлункової залози. Винахід стосується також фармацевтичної композиції, що містить як активний початок сполуку, що являє собою антитіло або одну з його похідних сполук або функціональних фрагментів, переважно, з додаванням фармацевтично прийнятного ексципієнта і/або носія. Більш конкретно, винахід стосується застосування антитіла згідно з винаходом для одержання фармацевтичної композиції, що додатково містить щонайменше один фармацевтично прийнятний носій. У даному описі під фармацевтично прийнятним носієм розуміють сполуку або комбінацію сполук, що входить в фармацевтичну композицію, що не викликає побічні реакції, і що дозволяє, наприклад, полегшити введення активної сполуки або сполук, збільшити тривалість її життя і/або її ефективність в організмі, збільшити її розчинність в розчині або сприяти її консервації. Ці фармацевтично прийнятні носії добре відомі і можуть бути застосовані фахівцем залежно від природи і способу введення вибраної активної сполуки або сполук. 7 UA 99601 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Переважно, ці сполуки вводять системним шляхом, зокрема, внутрішньовенним шляхом, внутрішньом'язовим, внутрішньошкірним, внутрішньочеревинним або підшкірним шляхом або пероральним шляхом. Більш переважно, композицію, що містить антитіла згідно з винаходом, вводять в декілька прийомів, розділених у часі. Способи їх введення, дозування і оптимальні галенові форми можуть визначатися залежно від критеріїв, які враховуються при виробленні лікування, придатного для пацієнта, такого як, наприклад, вік або маса тіла пацієнта, тяжкість його загального стану, толерантність до лікування і виявлені побічні ефекти. Згідно з винаходом пропонується композиція для лікування раку, яка відрізняється тим, що вона містить як діючий початок щонайменше одне антитіло до CD151 або один з його функціональних фрагментів, здатний зв'язуватися з білком CD151. Згідно з винаходом пропонується композиція для лікування раку, яка відрізняється тим, що вона містить як діючий початок щонайменше одне антитіло до CD151 або один з його функціональних фрагментів, здатний зв'язуватися з білком CD151 і/або інгібувати його активність, стимулюючу метастазування. Згідно з винаходом пропонується також композиція для лікування раку, яка відрізняється тим, що вона містить як діючий початок щонайменше одне антитіло до CD151 або один з його функціональних фрагментів, здатний інгібувати розвиток первинних пухлин. Згідно з іншим аспектом винаходу пропонується композиція, що містить щонайменше одне антитіло до CD151 або один з його функціональних фрагментів, причому щонайменше одне антитіло являє собою моноклональне антитіло, вибране з антитіл TS151 або TS151r. Згідно з іншим аспектом винаходу, пропонується композиція, яка містить комбінацію антитіл TS151 і TS151r або їх функціональні фрагменти. З літератури відомо, що білок CD151 суперекспресується в ракових пухлинах, зокрема, в карциномах товстої кишки [Hashida et al., Br. J. Cancer 89 (2003): 158-167], в ракових пухлинах недрібноклітинного раку легені [Tokuhara et al., Clin. Cancer Res. 7 (2001): 4109-4114], ракових пухлинах передміхурової залози [Ang et al., Cancer Epidemiol. Biomarkers 13 (2004):1717-1721] і ракових пухлинах підшлункової залози [Gesierich et al., Clin. Cancer Res. 11(2005):2840-2852]. Зрозуміло, цей список даний як ілюстрація і будь-яка ракова пухлина повинна розглядатися як гіперекспресуюча білок CD151 і, отже, вона може бути об'єктом лікування відповідно до даного винаходу. Іншим додатковим варіантом здійснення винаходу є композиція, описана вище, яка додатково містить цитотоксичний/цитостатичний агент і/або моноклональне антитіло як комбінований продукт для одночасного, роздільного або рознесеного у часі застосування. Отже, даний винахід стосується також композиції, описаної вище, яка відрізняється тим, що вона додатково містить щонайменше один цитотоксичний/цитостатичний агент і/або один клітинний токсин і/або один радіоактивний елемент і/або одне моноклональне антитіло як комбінований продукт для одночасного, роздільного або рознесеного у часі застосування. Під "одночасним застосуванням" розуміють введення двох сполук композиції згідно з винаходом, включених в одну і ту ж фармацевтичну форму. Під "роздільним застосуванням" розуміють введення в один і той же час двох сполук композиції згідно з винаходом, включених в окремі фармацевтичні форми. Під "застосуванням, рознесеним у часі" розуміють послідовне введення двох сполук композиції згідно з винаходом, кожна з яких знаходиться в окремій фармацевтичній формі. Як правило, композиція згідно з винаходом значно збільшує ефективність лікування раку. Інакше кажучи, терапевтичний ефект антитіла згідно з винаходом несподівано посилюється при введенні цитотоксичного агента. Інша істотна перевага, що випливає з композиції згідно з винаходом, стосується можливості використовувати більш низькі ефективні дози активного початку, і це дозволяє уникнути або знизити ризик появи побічних ефектів, зокрема, побічного ефекту від цитотоксичного агента. Крім того, композиція згідно з винаходом, мабуть, дозволяє більш швидко досягнути очікуваного терапевтичного ефекту. Під "терапевтичними протираковими агентами" або "цитотоксичними агентами" потрібно розуміти речовину, яка при введенні пацієнту лікує або попереджає розвиток раку у пацієнта. Як необмежувальний приклад таких агентів можна назвати "алкілувальні" агенти, антиметаболіти, протипухлинні антибіотики, мітотичні інгібітори, інгібітори хроматинової функції, антиангіогенезні агенти, антиестрогени, антиандрогени або імуномодулятори. Такі агенти перераховані, наприклад, в довіднику VIDAL на сторінці, присвяченій канцерології і гематологія в колонці "Цитотоксичні засоби", ці цитотоксичні сполуки, названі з посиланням на цей документ, цитуються в даному описі як переважні цитотоксичні засоби. 8 UA 99601 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 До "алкілувальних засобів" належить будь-яка речовина, яка може поєднуватися ковалентним зв'язком або алкілувати будь-яку молекулу, переважно, нуклеїнову кислоту (наприклад, ДНК), всередині клітини. Як приклад цих алкілувальних агентів можна назвати гірчичні гази, такі як мехлоретамін, хлолрамбуцил, мелфалан, хлоргідрат, піпоброман, преднімустин, двонатрієвий фосфат або естрамустин; оксазафосфорини, такі як циклофосфамід, алтретамін, трофосфамід, сульфофосфамід або іфосфамід; азиридини або етиленіміни, такі як тіотепа, триетиленамін або альтретамін; нітрозосечовини, такі як кармустин, стрептозоцин, фотемустин або ломустин; алкілсульфонати, такі як бісульфан, треосульфан або імпросульфан; триазени, такі як дакарбазин; або ж комплекси на основі платини, такі як цисплатина, оксаліплатина або карбоплатина. До "антиметаболітів" належать речовини, які блокують ріст клітин і/або клітинний метаболізм, протидіючи деяким видам активності, як правило, синтезу ДНК. Як приклад антиметаболіту можна відмітити метотрексат, 5-фторурацил, флоксуридин, 5фтордеоксиуридин, капецитабін, цитарабін, флударабін, цитозинарабінозид, 6-меркаптопурин (6-МР), 6-тіогуанін (6-TG), хлордезоксіаденозин, 5-азацитидин, гемцитабін, кладрибін, деоксикоформіцин і пентостатин. До "протипухлинних антибіотиків" належать сполуки, які можуть попереджати або інгібувати синтез ДНК, РНК і/або білків. Приклади таких протипухлинних антибіотиків включають доксорубіцин, даунорубіцин, ідарубіцин, валрубіцин, мітоксантрон, дактиноміцин, мітраміцин, плікаміцин, мітоміцин С, блеоміцин і прокарбазин. "Мітотичні інгібітори" порушують нормальний розвиток клітинного циклу і мітозу. Як правило, інгібітори мікротрубочок або "таксоїди", таке як плакситаксел і доцетаксел, здатні інгібувати мітоз. Алкалоїди вінка, такі як вінбластин, вінкристин, віндезин і вінорелбін також здатні інгібувати мітоз. До "інгібіторів хроматинової функції" або "інгібіторів топоізомераз" належать речовини, які інгібують нормальну функцію білків, що моделюють хроматин, таких як топоізомераза I і II. Приклади таких інгібіторів включають, у відношенні топоізомерази I, камптотецин і його похідні, такі як іринотекан або топотекан, а у відношенні топоізомерази II етопозид, фосфат етопозиду і теніпозид. До "анти-ангіогенезних агентів" належать будь-які ліки, сполука, речовина або агент, що інгібує ріст кровоносних судин. Приклади анти-ангіогенезних агентів включають, без обмеження, разоксин, маримастат, батимастат, приномастат, таномастат, іломастат, CGS-27023A, галофугінон, COL-3, неовастат, BMS-275291, талидомид, CDC 501, DMXAA, L-651582, скваламін, ендостатин, SU5416, SU6668, інтерферон-альфа, EMD121974, інтерлейкін-12, IM862, ангіостатин і вітаксин. До "антиестрогенів" або "антиестрогенних агентів" належить будь-яка речовина, яка зменшує, антагонізує або інгібує дію естрогену. Приклади таких агентів включають тамоксифен, тореміфен, ралоксифен, дролоксифен, іодоксифен, анастрозол, летрозол і ексеместан. До "антиандрогенів" або "антиандрогенних агентів" належить будь-яка речовина, яка зменшує, антагонізує або інгібує дію андрогену. Прикладами антиандрогенів є флутамід, нілутамід, бікалутамід, спріронолактон, ципротеронацетат, фінастерид і цимітидин. Імуномодуляторами є речовини, які стимулюють імунну систему. Приклади таких імуномодуляторів включають інтерферони, інтерлейкіни, такі як альдеслейкін, ОСТ-43, денілейкін дифтитокс або інтерлейкін-2, фактори некрозу пухлини, такі як тазонермин, або інші типи імуномодуляторів, такі як лентинан, сизофіран, роквінімекс, підотимод, пегадемаза, тимопентин, полі I:С, або левамізол в комбінації з 5-флуоурацилом. Для одержання більш докладних відомостей фахівець може звернутися до підручника, виданого Французькою Асоціацією викладачів терапевтичної хімії, названого "робота з терапевтичної хімії", том 6, "Перспективні протипухлинні лікарські засоби для лікування раків, видання ТЕС & DOC, 2003". Переважні моноклональні антитіла вибирають з виділених антитіл, здатних специфічно інгібувати тирозин-кіназну активність рецепторів IGF-IR, EGFR, HER2/neu, cMET, VEGFR, VEGF і т.д. (або будь-яке інше відоме фахівцеві протипухлинне антитіло), або їх функціональних фрагментів і їх похідних, здатних інгібувати проліферативну і/або антиапоптозну і/або ангіогенну і/або активність, що індукує поширення метастазів, промотовану вказаними рецепторами. В особливо переважному варіанті здійснення винаходу, комбінований продукт в композиції згідно з винаходом відрізняється тим, що вказаний цитотоксичний агент хімічно поєднується з вказаним антитілом для одночасного застосування. В особливо переважному варіанті здійснення винаходу, вказана композиція згідно з винаходом відрізняється тим, що вказаний цитотоксичний/цитостатичний агент вибирають з 9 UA 99601 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 інгібіторів або стабілізаторів веретена, переважно, вінорелбіну і/або вінфлуніну і/або вінкристину. Для полегшення поєднання вказаного цитотоксичного агента з вказаним антитілом згідно з винаходом можна, зокрема, ввести проміжні молекули між двома сполуками, що поєднуються, такі як полі(алкілен)гліколі, наприклад, поліетиленгліколь, або ж амінокислоти, або згідно з іншим варіантом здійснення, використовувати активні похідні вказаних цитотоксичних агентів, в які могли б бути введені групи, здатні взаємодіяти з вказаним антитілом згідно з винаходом. Ці методи поєднання добре відомі фахівцеві і в даному описі детально не розглядаються. Згідно з іншим аспектом, винахід стосується композиції, яка відрізняється тим, що щонайменше одне з вказаних антитіл або одне з його функціональних похідних або фрагментів, кон'юговане з клітинним токсином і/або з радіоактивним елементом. Переважно, вказаний токсин являє собою токсин ентеробактерій, зокрема, екзотоксин А Pseudomonas. Радіоактивними елементами (або радіоізотоп), переважно, кон'югованими з антитілом, що 131 використовуються в медицині, є радіоізотопи, які випускають гамма-промені, переважно, йод , 90 199 100 67 217 211 ітрій , золото , паладій , мідь , вісмут і сурма . У медицині можуть бути також використані радіоізотопи, що випускають бета- і альфа-промені. Під токсином або радіоактивним елементом, кон'югованим щонайменше з одним антитілом або з одним з його функціональних фрагментів згідно з винаходом, розуміють будь-який засіб, що дозволяє зв'язати вказаний токсин або вказаний радіоактивний елемент щонайменше з одним антитілом, зокрема, методом ковалентного поєднання між двома сполуками з введенням або без введення зв'язувальної молекули. Серед агентів, що забезпечують хімічний (ковалентний), електростатичний або не ковалентний зв'язок всіх або частини елементів в кон'югаті, можна відмітити, більш конкретно, бензохінон, карбодіімід, ще більш конкретно, EDC (1-етил-3-[3-диметиламінопропіл]-карбодіімід гідрохлорид), дималеімід, дитіобіснітробензойну кислоту (DTNB), N-сукцинімідил-Sацетилтіоацетат (SATA), зв'язувальні агенти (bridging), що мають одну або декілька фенілазидних груп, що взаємодіють з ультрафіолетовим випромінюванням (УФ), і, переважно, N-[4-(азидосаліциламіно)бутил]-3'-(2'-піридилдитіо)пропіонамід (APDP), N-сукцинімідил-3-(2піридилдитіо)пропіонат (SPDP) і 6-гідразинонікотинамід (HYNIC). Інший варіант поєднання, що стосується спеціально радіоактивних елементів, може полягати у використанні біфункціонального хелатувального агента, що зв'язує іони. Серед цих хелатувальних агентів можна відмітити хелати, похідні EDTA (етилендіамінотетраоцтової кислоти) або DTPA (діетилентриамінопентаоцтової кислоти), які були розроблені для зв'язування металів, особливо радіоактивних металів, і імуноглобулінів. Так, DTPA і її похідні можна замістити різними групами у вуглецевому ланцюгу з метою збільшення стабільності і жорсткості комплексу ліганд-метал (Krejcarek et al., (1977); Brechdiel et al., (1991); Gansow (1991); патент USA 4831175). Наприклад, DTPA (діетилентриамінопентаоцтова кислота) і її похідні, яка вже давно дуже широко застосовується в медицині і біології або у вільній формі, або в формі комплексу з іоном металу, має чудову властивість утворювати стабільні хелати з іонами металів і зв'язуватися з білками, що представляють терапевтичний або діагностичний інтерес, такими як антитіла, що розширюють арсенал радіо-імунокон'югатів, що використовуються в лікуванні раку (Meases et al., (1984); Gansow et al. (1990). Даний винахід стосується додатково композиції згідно з винаходом для одержання лікарського засобу. Таким чином, даний винахід стосується, більш конкретно, застосування композиції, описаної вище, для одержання лікарського засобу, призначеного для лікування раку. З всіх раків, які можна попередити і/або лікувати, переважні рак товстої кишки, рак легень, рак передміхурової залози або рак підшлункової залози. Крім того, згідно з особливим новим і переважним аспектом здійснення, даний винахід стосується застосування композиції, описаної вище, для одержання лікарського засобу, призначеного для лікування первинних пухлин. Винахід стосується також застосування антитіла згідно з винаходом для одержання лікарського засобу, призначеного для цілеспрямованої доставки біологічно активної сполуки до клітин, що експресують або гіперекспресують рецептор CD151. У даному описі під біологічно активною сполукою розуміють будь-яку сполуку, здатну модулювати, зокрема, інгібувати, клітинну активність, зокрема, ріст клітин, їх проліферацію, транскрипцію або трансдукцію гена. 10 UA 99601 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Інші характеристики і переваги винаходу будуть зрозумілі з наступного опису, що включає приклади і фігури, представлені нижче. Опис фігур Фіг. 1 зображає нуклеотидні і білкові послідовності білка CD151, на яких показані петлі ЕС1 і ЕС2. Фіг. 2 є схемою, що ілюструє структуру тетраспанінів, що складають білок CD151, більш конкретно, дві позаклітинні петлі ЕС1 і ЕС1. Фіг. 3 показує результати порівняння PBS/контрольне антитіло на ортотопічній моделі А549. Фіг. 4 показує результати оцінки протипухлинної активності антитіла TS151 in vivo на ортотопічній моделі. Мишам з пригніченим імунітетом (n=10) прищеплювали шляхом внутрішньоплеврального введення 1,106 клітин А549. Через сім днів після щеплення мишей обробляли антитілом TS151 інтраперитональним введенням з початковою дозою 500 мкг, а потім обробляли два рази на тиждень протягом 5 тижнів дозою 250 мкг антитіла на мишу. Тваринам контрольної партії вводили PBS відповідно до тієї ж схеми введення. Фіг. 5 ілюструє експресію молекули CD151 у пацієнтів, хворих на рак передміхурової залози. Кожна літера відповідає вивченню одного пацієнта і для кожного пацієнта верхня панель відповідає нормальній тканині, прилеглій до пухлини, а нижня панель відповідає пухлинній тканині. Фіг. 6 ілюструє експресію молекули CD151 у пацієнтів, хворих на рак легені. Кожна літера відповідає вивченню одного пацієнта і для кожного пацієнта верхня панель відповідає нормальній тканині, прилеглій до пухлини, а нижня панель відповідає пухлинній тканині. Фіг. 7 ілюструє активність in vivo антитіл TS151 і TS151R на моделі ксенотрансплантату РС3. Мишам лінії Swiss Nude (n=6) трансплантували підшкірно клітини РС3. Через п'ять днів після трасплантації клітин миші одержували шляхом інтраперитонального введення (i.p.) антитіла, що досліджуються в початковій дозі 2 мг/мишу, а потім вводили два рази на тиждень ці ж антитіла в дозі 1 мг/мишу. Розмір пухлини визначали за формулою /6  довжина  ширина  товщина і для статистичної оцінки результатів використовували тест Манна і Уїтні (Mann et Whitney). Фіг. 8 ілюструє результат оцінки специфічності антитіл TS151 і TS151R для людської форми CD151 за методом вестерн-блот. Фіг. 9 ілюструє інгібування адгезії клітин А549 на лимініні 5. А) Інгібування клітинної адгезії різними антитілами до інтегринів. В) Інгібування клітинної адгезії комбінацією TS151/антитіло до інтегрину α3. Приклад 1: Генерування антитіл TS151r і TS151 Генерування антитіла TS151r Для генерування антитіл TS151r мишей лінії BALB/с імунізували інтраперитональним 7 шляхом за допомогою 10 клітин HeLa. Після 3-кратної імунізації і останнього повторного вливання, клітини миші-самиці були злиті з клітинами мієломи Р3 × 63AG8 згідно з класичними 7 7 способами, описаними Kohler і Mistein (5  10 клітин самиці / 3  10 клітин мієломи). Супернатанти гібридом, одержані внаслідок злиття, були скриновані на їх здатність розпізнавати клітини HeLa методом проточної цитометрії, потім за їх здатністю до імунопреципітації CD151 з лізату клітин HeLa, що одержується в присутності детергенту Brij 97, і до ко-імунопреципітації CD9. Виявилося, що антитіла TS151r мають ці різні властивості. Генерування антитіла TS151 Для одержання антитіл TS151 мишей лінії BALB/с імунізували інтраперитональним шляхом 7 за допомогою 10 клітин Jukat, потім 107 HEL (2 імунізації). Після останнього повторного вливання за допомогою білкових комплексів, що містять білок ADAM10, одержаних з лізатів клітин Jurkat і HEL, клітини самиці були злиті з клітинами мієломи Р3 × 63AG8 згідно з 7 7 класичними способами, описаними Kohler і Mistein (5  10 клітин самиці / 3  10 клітин мієломи). Супернатанти гібридом, одержані внаслідок злиття, були скриновані на їх здатність розпізнавати клітини Jurkat і HeLa шляхом проточної цитометрії. Антитіла TS151 були потім відібрані за їх здатністю до імунопреципітації CD151 з лізату клітин, одержаного в присутності детергенту Brij 97, і до ко-імунопреципітації інших тетраспанінів. Приклад 2: Оцінка in vivo протипухлинної активності антитіл TS151 і TS151r на ортотопічній моделі А549 Матеріал і метод Після перевірки на експресування білка CD151 (дані не представлені), клітини лінії А549, придбані в АТСС, культивували рутинним способом в середовищі F12K, що містить 10 мМ глутаміну і 10 % SVF. Ці клітини ділилися протягом 2 діб перед щепленням з тим, щоб вони знаходилися в експонентній фазі росту. Для проведення щеплення 7-тижневі миші з 6 пригніченим імунітетом були анестезовані і потім їм вводили 1,10 клітин А549 11 UA 99601 C2 5 10 15 20 25 30 інтрапарентеральним шляхом. Первинна пухлина швидко розвивалася і за 4 дні захопила структури, сусідні з місцем ін'єкції, що включають середостіння, легені і діафрагму. Для кращого моделювання хвороби початок лікування був здійснений тільки через 7 днів після імплантації клітин, зробленої інтраперитональним шляхом. Після вливання початкової дози 500 мг/мишу очищене антитіло TS151 вводили 2 рази на тиждень протягом 5 тижнів в дозі 250 мкг/мишу. Групу мишей, що одержували PBS, використовували як контроль, оскільки досліди, здійснені вище, показали, що введення контрольного ізотипу IgG1, не надало ніякого ефекту на тривалість життя тварин. Фіг. 3, що використовує попередні дані, показує специфічність активності, що спостерігається з використанням антитіла проти CD151. Так, обробка тварин мишачим імуноглобуліном IgG1 (mIgG1), що використовується як контрольний ізотип, показує, що останній не надав ніякої дії на тривалість життя тварин, якій вливали PBS, що використовується як носій вказаних антитіл. Оцінювальним параметром цієї моделі є тривалість життя тварин, а протипухлинна активність виражена шляхом розрахунку параметра Т/С% = середня тривалість життя оброблених тварин/середня тривалість життя тварин в контрольній групі Х 100. Було встановлено, що значення Т/С%, вище або рівне 125 % означає, що продукт активний. Результати Фіг. 4 показує протипухлинну активність антитіла TS151, розраховане значення Т/С% якої становить 140 %. Приклад 3: Порівняння протипухлинної активності in vivo антитіл TS151 і 50-6 на ортотопічній моделі А549 Матеріал і метод Протокол, що використовується, був ідентичний протоколу вищеописаного прикладу 2. Результати Одержані дані ясно говорять про те, що антитіло TS151 має протипухлинну активність, яка виразно вище активності, що виявляється антитілом 50-6, який як такий має показник Т/С% рівний лише 118, тобто нижче порогового значення, рівного 125 % (дані не представлені). Одержані результати, а саме, показник Т/С%, розрахований як описано вище, представлені в наступній таблиці 4: Таблиця 4 Т/С% 35 40 45 50 55 антитіло TS151 140 антитіло 50-6 118 Приклад 4: Вивчення експресії молекули CD151 Експресія білка CD151 була досліджена імуногістохімічним аналізом на зразках тканини людини, взятої у пацієнта, хворого на рак передміхурової залози або на рак легені. У цих же пацієнтів були взяті пластинки нормальних тканин, сусідніх до пухлини, і використовувалися для визначення рівня експресії в пухлинних тканинах в порівнянні з нормальними тканинами. Для цих дослідів були використані пластинки тканинного матриксу "Tissue array", що випускаються в продаж. Після депарафінування здійснювали демаскування антигенів при 30 °C за допомогою ферментного розчину, що містить пепсин (Labvision ref. AP-9007-005). Після цієї стадії здійснювали стадію видалення ендогенних пероксидаз шляхом інкубування зрізів в 3 % розчині перекису водню (Sigma) у воді. Насичення неспецифічних центрів здійснювали з використанням розчину Ultra-V-Block (Labvision ref. TA-125-UB) і введення мітки здійснювали за допомогою мишачого антитіла проти CD151, що випускається в продаж (Serotech, ref. MCA 1856), що використовується в кінцевій концентрації 5 мкг/мл. Контрольне мишаче антитіло ізотипу IgG1 (DakoCytomation, ref. X0931) використовували в експерименті як негативний контроль. Виявлення міток проводили за допомогою системи для виявлення Envision Dual Link (DakoCytomation, ref. К4061) і стандартного препарату DAB, субстрат пероксидази був S3309 DakoCytomation. Результати, представлені на фігурі 5, показують, що у багатьох пацієнтів в процесі розвитку пухлини передміхурової залози спостерігалася суперекспресія молекули CD151. Ця суперекспресія може бути дуже значною у 20 % досліджених пацієнтів (пацієнти А і С) або помірною (пацієнти А і D). Потрібно зазначити, що, за винятком ендотеліальних клітин, відповідні нормальні простатичні тканини не експресували або мало експресували CD151, а у випадку експресії вона була обмежена, мабуть, структурами гланулярного типу. Пацієнт Е має приклад пухлини, що не експресує CD151. 12 UA 99601 C2 5 10 15 20 У випадку раку легень (Фіг. 6) експресія від помірної (пацієнт А) до сильної (пацієнт В) спостерігалася на рівні деяких клітин нормальної легеневої тканини. Однак пухлинна тканина має дуже велику щільність високомічених клітин (пацієнти А і В). Пацієнт С має приклад пухлини, що не експресує CD151. Приклад 5: Дія антитіл TS151 TS151R на ріст in vivo пухлини РС3, імплантованої під шкіру миші Nude З урахуванням результатів, одержаних імуногістохімічним аналізом на тканинному матриксі "tissue array" передміхурової залози, була здійснена оцінка антитіл проти CD151 на ксенотрансплантаті пухлині РС3. Лінія клітин РС3 являла собою лінію клітин андрогеннезалежного раку передміхурової залози, придбану в АТСС і вирощену в середовищі 6 F12K+10 % SVF+L-Глутамін. Для проведення аналізу імплантували 5.10 клітин РС3 в правий бік миші Swiss Nude. Через п'ять днів після імплантації тварин радномізували за розміром пухлини і ділили на 3 групи, що порівнюються. Розмір пухлини у групи тварин, що зазнали 3 трансплантації, склав від 41 до 47 мм (розмір розраховували за формулою /6  довжина  ширина  товщина) в день 0 обробки. Потім тварини одержували очищені антитіла, що тестуються або PBS. Дози антитіл і частота вливань були наступними: початкова доза антитіл 2 мг/дозу; підтримуюча доза 1 мг/2 рази на тиждень. Результати, представлені на фіг. 7, показують, що два тестовані антитіла (TS151 і TS151R) поводяться порівняно однаково і інгібують дуже сильно ріст пухлини РС3, імплантованої підшкірно мишам Swiss Nude. У наведену нижче таблицю зведені статистичні дані проведених випробувань. Таблиця 5 Д0 Д3 Д7 Д10 Д14 Д17 Д20 Д24 Д28 Д31 Д35 Контроль/ Манн-Уитні р= р= р= р= р= р= р= р= р= р= р= TS151 (Вілкоксон) 0,132 0,937 0,065 0,589 0,002 0,002 0,002 0,002 0,002 0,002 0,002 Контроль/ Манн-Уитні р= р= р= р= р= р= р= р= р= р= р= TS 151R (Вілкоксон) 0,485 0,180 0,180 0,589 0,240 0,026 0,004 0,002 0,002 0,002 0,002 25 30 35 40 45 50 Проведені паралельно випробування, представлені на фігурі 8, показують, що антитіла TS151 і TS151R специфічно розпізнають молекулу CD151 людини без будь-якої перехресної реакції з мишачим рецептором. Це спостереження дозволяє передбачити, що активність, яка спостерігається на моделі ксенотрансплантату у миші Nude, може бути приписана тільки прямій дії на трансплантат людській тканині і, отже, виключає будь-яку інтерференцію антитіл TS151 і TS151R з клітинами строми або з ендотеліальними мишачими клітинами. Крім того, TS151 і TS151R є двома мишачими IgG1 і, отже, як це відоме фахівцеві, малоймовірно, щоб активність, яка спостерігається, була пов'язана з ефекторними функціями типу ADCC і CDC, які опосередковані, більш конкретно, антитілами типу мишачого IgG2a у мишей. Таким чином, сукупність цих результатів узгоджується з механізмом дії, безпосередньо пов'язаним з інгібуванням проліферації пухлинних клітин in vivo антитілами TS151 і TS151R. Приклад 6: Специфічність антитіл TS151 і TS151r Специфічність антитіл TS151 і TS151r оцінювалася методом Вестерн-блот аналізу. Лізати людської і мишачої тканини легені, підшлункової залози і товстої кишки (Biochain, 10 мкг загальних білків), а також зростаючі кількості клітинного лізату НТ-29 (10, 20 і 50 мкг загальних білків) наносили на 4-12 % поліакриламідний гель (BioRad). Після електрофорезу (не відновні умови) білки переносили на поверхню нітроцелюлозної мембрани. Після цього мембрани інкубували в присутності очищених антитіл TS151 і TS151r, потім в присутності поліклонального антитіла кролика до Ig миші, міченого пероксидазою (GE Healthcare), потім виявляли мітки за типом ECL. Антитіла TS151 і TS151r мають специфічність відносно людської форми Cd151, як про це свідчить факт розпізнавання CD151, встановлений шляхом Вестерн-блот аналізу, в лізатах клітин НТ-29 і різних тканин людини (Фіг. 8). Відсутність реакції на мишачий білок CD151 в лізатах різних тканин, взятих у мишей, підтверджує специфічність антитіл TS151 і TS151r відносно людської форми Cd151. Приклад 7: Інгібування клітинної адгезії Дослідження адгезії пухлинних клітин до ламініну 5, ліганду інтегринів α3β1 і α6β4, з якими може асоціюватися Cd151, здійснювали на 96 ямковому планшеті. Після імобілізації ламініну 5 (Chemicon, 200 мкл, концентрація 1 мкг/мл) протягом 1 години при температурі 37˚С, ямку заповнювали BSA з концентрацією 2 мг/мл (200 мкл, 1 година при температурі 37˚С). Суспензію 13 UA 99601 C2 5 10 15 20 25 клітин А549 мітили за допомогою 5-хлорметилфлуоресцеїн ацетату (CMFDA, Invitrogen), потім додавали їх з розрахунку 100000 клітин (100 мкл) на ямку в присутності або за відсутності антитіла (100 мкл). Після інкубування при 37˚С протягом 15, 30 або 60 хвилин клітини, що не зазнали адгезії, видаляли. Після зчитування хемілюмінесценції за допомогою люмінометру (Mithras, Berthold) визначали процентний вміст клітин, що не зазнали адгезії, за допомогою серії клітин, мічених CMFDA. Антитіло TS151 проти Cd151 і антитіла Р1В5 проти інтегрину α3, NKIGo3 проти інтегрину α6 і ASC-3 (Chemicon) проти інтегрину β4 оцінювалися при кінцевій концентрації 20 мкг/мл. Антитіло 9G4, направлене проти білка мембрани Escherichia coli, використовували як ізотипічний контроль. Антитіло Р1В5 проти інтегрину α3 інгібує адгезію клітин А549 до лимініну 5 (Фіг. 9А), в той час як антитіла NKI-Go3 проти інтегрину α6 і ASC-3 проти інтегрину β4 не інгібують адгезію клітин А549 до цього ж ліганду. Однак відмічене зниження інгібування протягом часу. Так, інгібування, індуковане Р1В5, складає більше 90 % протягом 15 хвилин, але потім знижується приблизно до 20 % через 1 годину. Асоціація антитіла Р1В5 з антитілом NLI-Go3 проти інтегрину α6 або з антитілом ASC-3 проти інтегрину β4 дозволяє зберегти високий рівень інгібування адгезії через 1 годину; це інгібування перевищує 90 % при асоціації з антитілом проти α6 і близько 70 % при комбінації з антитілом проти β4. Ці результати доводять, що клітини А549 адгезивні до ламініну 5, в перший період, завдяки інтегрину α3β1, потім, у другий період, завдяки інтегрину α6β4. Антитіло TS151 проти Cd151 не інгібує адгезію клітин А549 до лимініну 5, якщо воно використовується як єдине (Фіг. 9В). При комбінації TS151 з Р1В5 був визначений її ефект відносно адгезії клітин А549 і його порівнювали з раніше вказаними комбінаціями. Ця комбінація TS151/Р1В5 показала результат, порівнянний з асоціацією антитіл проти α6/проти α3 і проти β4/проти α3. Так, було відмічено збереження інгібування адгезії на рівні 80 % через 1 годину. Антитіло TS151 ймовірно здатне інгібувати адгезію клітин А549 завдяки антагоністичній дії на інтегрин α6β4. Список послідовностей 30 Pierre Fabre Médicament ЗАСТОСУВАННЯ АНТИТІЛА ДО CD 151 ДЛЯ ЛІКУВАННЯ РАКУ cas 640 35 FR 06/09135 2006-10-18 38 40 PatentIn version 3.3 45 1 759 ДНК Homo sapiens 1 14 UA 99601 C2 5 2 253 PRT homo sapiens 2 10 15 3 327 ДНК homo sapiens 15 UA 99601 C2 3 5 10 15 4 109 PRT homo sapiens 4 5 54 ДНК homo sapiens 5 20 25 6 18 PRT homo sapiens 6 30 35 7 8 PRT mus musculus 7 16 UA 99601 C2 5 8 8 PRT mus musculus 8 10 15 9 13 PRT mus musculus 9 20 10 120 PRT mus musculus 25 10 30 11 10 PRT mus musculus 35 11 17 UA 99601 C2 5 12 3 PRT mus musculus 12 10 13 9 PRT mus musculus 15 13 20 14 111 PRT mus musculus 25 14 30 15 8 PRT mus musculus 35 15 40 16 8 PRT mus musculus 18 UA 99601 C2 16 5 17 16 PRT mus musculus 10 17 15 18 123 PRT mus musculus 20 18 25 19 10 PRT mus musculus 30 19 35 20 3 PRT mus musculus 20 19 UA 99601 C2 5 21 9 PRT mus musculus 21 10 15 22 111 PRT mus musculus 22 20 25 23 24 ДНК mus musculus 23 30 24 24 ДНК mus musculus 35 24 40 25 39 ДНК 20 UA 99601 C2 mus musculus 25 5 10 26 360 ДНК mus musculus 26 15 27 30 ДНК mus musculus 20 27 25 28 9 ДНК mus musculus 30 28 35 29 27 ДНК mus musculus 29 40 45 30 333 ДНК mus musculus 30 21 UA 99601 C2 5 31 24 ДНК mus musculus 31 10 15 32 24 ДНК mus musculus 32 20 33 48 ДНК mus musculus 25 33 30 34 369 ДНК mus musculus 35 34 40 35 30 ДНК mus musculus 35 45 22 UA 99601 C2 5 36 9 ДНК mus musculus 36 10 37 27 ДНК mus musculus 15 37 20 38 333 ДНК mus musculus 25 38 ФОРМУЛА ВИНАХОДУ 30 35 40 45 50 1. Застосування щонайменше одного антитіла або одного з його функціональних фрагментів, здатного зв'язуватися з білком CD151 і інгібувати ріст пухлинних клітин, для одержання лікарського засобу, призначеного для лікування первинних пухлин. 2. Застосуванняза п. 1 для одержання лікарського засобу, призначеного для інгібування проліферації первинних пухлин. 3. Застосування за п. 1 або 2 для одержання лікарського засобу, призначеного для лікування раку. 4. Застосування за п. 1, яке відрізняється тим, що вказане щонайменше одне антитіло до CD151 або один з його функціональних фрагментів здатні зв'язуватися з епітопом, включеним в позаклітинну петлю 1 (ЕС1) і/або 2 (ЕС2), переважно в петлю ЕС2, що відповідає, відповідно, амінокислотам 40-57 (SEQ ID NO: 6) і 113-221 (SEQ ID NO: 4) білка CD151. 5. Застосування за п. 4, яке відрізняється тим, що вказане щонайменше одне антитіло до CD151 або один з його функціональних фрагментів здатні зв'язуватися з епітопом ділянки ЕС2, що включає щонайменше амінокислоти глутамін, аргінін і аспартат, відповідно, в положеннях 194-196 194, 195 і 196 (QRD ) білка CD151. 6. Застосування за п. 1, яке відрізняється тим, що вказане щонайменше одне антитіло до CD151 або один з його функціональних фрагментів являє собою моноклональне антитіло. 7. Застосування за п. 6, яке відрізняється тим, що вказане моноклональне антитіло або один з його функціональних фрагментів являє собою антитіло TS151, причому вказане антитіло TS151 включає: - 3 CDRs важкого ланцюга CDR-H1, CDR-H2 і CDR-H3, що відповідають послідовностям SEQ ID NО: 7, 8 і 9; і - 3 CDRs легкого ланцюга CDR-L1, CDR-L2 і CDR-L3, що відповідають послідовностям SEQ ID NО: 11, 12 і 13. 23 UA 99601 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 8. Застосування за п. 7, яке відрізняється тим, що вказане антитіло включає важкий ланцюг, що містить послідовність SEQ ID NО: 10. 9. Застосування за п. 7, яке відрізняється тим, що вказане антитіло включає легкий ланцюг, що містить послідовність SEQ ID NО: 14. 10. Застосування за п. 6, яке відрізняється тим, що вказане моноклональне антитіло або один з його функціональних фрагментів являє собою антитіло TS151r, причому вказане антитіло TS151r включає: - 3 CDRs важкого ланцюга CDR-H1, CDR-H2 і CDR-H3, що відповідають послідовностям SEQ ID NО: 15, 16 і 17; і - 3 CDRs легкого ланцюга CDR-L1, CDR-L2 і CDR-L3, що відповідають послідовностям SEQ ID NО: 19, 20 і 21. 11. Застосування за п. 10, яке відрізняється тим, що вказане антитіло включає важкий ланцюг, що містить послідовність SEQ ID NO: 18. 12. Застосування за п. 10, яке відрізняється тим, що вказане антитіло включає легкий ланцюг, що містить послідовність SEQ ID NО: 22. 13. Застосування за будь-яким з пп. 1-12, яке відрізняється тим, що вказаний рак являє собою рак товстої кишки, легені, передміхурової залози або підшлункової залози. 14. Застосування за будь-яким з пп. 1-13 для одержання фармацевтичної композиції, що додатково містить щонайменше один фармацевтично прийнятний носій. 15. Композиція для лікування первинних пухлин, яка відрізняється тим, що вона містить як діюче начало щонайменше одне антитіло до CD151 або один з його функціональних фрагментів, здатні зв'язуватися з білком CD151 і інгібувати ріст пухлин. 16. Композиція за п. 15, яка відрізняється тим, що вказане щонайменше одне антитіло до CD151 або один з його функціональних фрагментів здатні зв'язуватися з епітопом, включеним до позаклітинної петлі 1 (ЕС1) і/або 2 (ЕС2), переважно до петлі ЕС2, що відповідає, відповідно, амінокислотам 40-57 (SEQ ID NO: 6) та 113-221 (SEQ ID NO: 4) білка CD151. 17. Композиція за п. 16, яка відрізняється тим, що вказане щонайменше одне антитіло до CD151 або один з його функціональних фрагментів здатні зв'язуватися з епітопом домену ЕС2, що включає щонайменше амінокислоти глутамін, аргінін і аспартат, відповідно, в положеннях 194-196 194, 195 і 196 (QRD ) білка CD151. 18. Композиція за п. 15, яка відрізняється тим, що вказане щонайменше одне антитіло до CD151 або один з його функціональних фрагментів являє собою моноклональне антитіло. 19. Композиція за п. 18, яка відрізняється тим, що вказане щонайменше одне антитіло до CD151 або один з його функціональних фрагментів являє собою антитіло, вибране з антитіл: - TS151, яке включає 3 CDRs важкого ланцюга CDR-H1, CDR-H2 і CDR-H3, що відповідають послідовностям SEQ ID NO: 7, 8 і 9; і 3 CDRs легкого ланцюга CDR-L1, CDR-L2 і CDR-L3, що відповідають послідовностям SEQ ID NO: 11, 12 і 13; - TS151r, яке включає 3 CDRs важкого ланцюга CDR-H1, CDR-H2 і CDR-H3, що відповідають послідовностям SEQ ID NO: 15, 16 і 17; і 3 CDRs легкого ланцюга CDR-L1, CDR-L2 і CDR-L3, що відповідають послідовностям SEQ ID NO: 19, 20 і 21. 20. Композиція за п. 15, яка відрізняється тим, що вона додатково містить як комбінований продукт щонайменше один цитотоксичний/цитостатичний агент і/або один клітинний токсин, і/або один радіоактивний елемент, і/або одне моноклональне антитіло для одночасного, роздільного і/або рознесеного у часі застосування. 21. Застосування композиції за будь-яким з пп. 15-20 для одержання лікарського засобу, призначеного для лікування первинних пухлин. 24 UA 99601 C2 25 UA 99601 C2 26 UA 99601 C2 27 UA 99601 C2 28