Автоматизований пробовідбірник для насіння та способи взяття зразків, тестування та збільшення популяції насіння

1. Автоматизований пробовідбірник для насіння, який включає: пробовідбірну станцію; пробовідбірник для вилучення матеріалу з насіння в пробовідбірній станції; конвеєр для насіння для транспортування насіння із пробовідбірної станції до відділення в лотку для насіння; конвеєр для транспортування матеріалу, вилученого з насіння, до відповідного відділення в лотку для зразків. 2. Пробовідбірник за п. 1, який відрізняється тим, що конвеєр для насіння є пневматичним конвеєром. 3. Пробовідбірник за п. 1, який відрізняється тим, що конвеєр для зразків є пневматичним конвеєром. 4. Пробовідбірник за п. 1, який відрізняється тим, що включає стіл для підтримки щонайменше одного лотка для насіння, який має декілька відділень для окремого насіння, та щонайменше один лоток для зразків, який має декілька відділень для окремих зразків, а також позиціонер для пересування столу, щоб вирівнювати відділення в лотку для насіння на столі з конвеєром для насіння, та також вирівнювати відповідне відділення в лотку для зразків із конвеєром для зразків. 2 (19) 1 3 бовідбірної станції; вилучення матеріалу з кожної одиниці насіння без руйнування його життєздатності; транспортування насіння до першої локації, транспортування матеріалу, вилученого з насіння, до другої локації, що відповідає першій локації; тестування матеріалу, вилученого з кожної одиниці насіння; та відокремлення насіння, ґрунтуючись на результатах тестування матеріалу у відповідних локаціях. 13. Спосіб збільшення кількості насіння рослини, яке має переважну характеристику, який включає: a) перевірку кожної одиниці насіння на наявність бажаної характеристики; b) вирощування рослин лише з насіння, яке дало позитивний результат тестування на переважну характеристику; c) отримання насіння з вирощених рослин; та повторення стадій від (а) до (с) для одного або декількох поколінь. 14. Спосіб за п. 13, який відрізняється тим, що переважною характеристикою є вміст олії, і атестування включає створення зображення насіння за допомогою MR. 15. Спосіб за п. 14, який відрізняється тим, що насіння являє собою кукурудзу. 16. Спосіб за п. 14, який відрізняється тим, що насіння являє собою соєві боби. 17. Спосіб за п. 13, який відрізняється тим, що насіння являє собою кукурудзу. 18. Спосіб за п. 13, який відрізняється тим, що насіння являє собою соєві боби. 19. Спосіб за п. 13, який відрізняється тим, що тестування включає вилучення зразка з кожної одиниці насіння без руйнування його життєздатності та тестування кожного зразка з кожної одиниці насіння на наявність бажаної характеристики, яка є генетичною рисою. 20. Спосіб за п. 13, який відрізняється тим, що включає відокремлення насіння, ґрунтуючись на індивідуальних результатах тестування зразків у відповідних відділеннях у лотку для зразків. 21. Спосіб за п. 13, який відрізняється тим, що тестування кожної одиниці насіння включає: недеструктивне відібрання зразків із кожної одиниці насіння в популяції насіння; аналіз кожного зразка щодо присутності або відсутності щонайменше однієї риси, яка представляє інтерес, та відібрання насіння на підставі присутності або відсутності щонайменше однієї риси, що представляє інтерес; та вирощування рослин, яке включає: вирощування рослин із відібраного насіння. 22. Спосіб аналізу насіння в популяції, яка складається з насіння, що має генетичні відмінності, який включає: вилучення зразка, який включає клітини із ДНК, з насіння в популяції без впливу на здатність до пророщення насіння; скринінг ДНК, екстрагованої зі зразка, на присутність або відсутність генетичного маркера; відбір насіння з популяції, ґрунтуючись на результатах скринінгу ДНК; та вирощування рослин з отриманого насіння. 91985 4 23. Спосіб за п. 22, який відрізняється тим, що включає визначення генотипного характеру нащадка рослини до відбору насіння з популяції. 24. Спосіб за п. 22, який відрізняється тим, що родючі рослини, вирощені з відібраного насіння, використовують або як жіночий, або як чоловічий предок при схрещуванні з іншою рослиною. 25. Спосіб за п. 22, який відрізняється тим, що зразок включає тканину ендосперму, спосіб також включає визначення рівня плоїдності генетичного маркера. 26. Спосіб за п. 23, який відрізняється тим, що диплоїдний рівень плоїдності генетичного маркера є показником батьківської спадковості. 27. Спосіб за п. 22, який відрізняється тим, що генетичний маркер знаходять у материнського предка насіння. 28. Спосіб за п. 22, який відрізняється тим, що генетичний маркер знаходять у батьківського предка насіння. 29. Спосіб за п. 22, який відрізняється тим, що включає відбір насіння, ґрунтуючись на присутності генетичного маркера, який зазвичай зв'язаний з QTL, який вибирають із групи, що складається з урожайності, стійкості до полягання, висоти, родючості, стійкості до захворювань, стійкості до шкідників, стійкості до дефіциту поживних речовин та гранулометричного складу. 30. Спосіб за п. 22, який відрізняється тим, що включає відбір насіння, ґрунтуючись на присутності генетичного маркера, який зазвичай зв'язаний із галотипом, пов'язаним з QTL, який вибирають із групи, що складається з урожайності, стійкості до полягання, висоти, родючості, стійкості до захворювань, стійкості до шкідників, стійкості до дефіциту поживних речовин та гранулометричного складу. 31. Спосіб за п. 22, який відрізняється тим, що включає відбір насіння на підставі присутності генетичного маркера, який зазвичай зв'язаний із трансгеном. 32. Спосіб за п. 22, який відрізняється тим, що включає збирання врожаю насіння з вирощених рослин та повторення стадій за пунктом 22. 33. Спосіб передбачення ембріозиготності гена, який представляє інтерес, який включає: отримання першої клітини з насіння, що містить зародок, яка має відому плоїдність; вимірювання кількості копій згаданого гена, який представляє інтерес, та кількості копій контрольного гена в згаданій першій клітині; та визначення співвідношення згаданої кількості копій згаданого гена, який представляє інтерес, та згаданої кількості копій контрольного гена; за яким згадане співвідношення показує зиготність згаданої першої клітини щодо гена, який представляє інтерес; та за яким зиготність згаданої першої клітини щодо гена, який представляє інтерес, передбачає зиготність згаданого зародка щодо згаданого гена, який представляє інтерес. 34. Спосіб за п. 33, який відрізняється тим, що згадана перша клітина є незародковою клітиною. 35. Життєздатне насіння, частина насіннєвої тканини якого була вилучена за допомогою автоматизованої пробовідбірної системи за п. 1. 5 91985 6 36. Насіння за п. 35, яке також містить полімер та/або фунгіцид. 37. Зразок, який включає тканину насіння за п. 35. 38. Рослина, вирощена з насіння за п. 35. 39. Потомство рослини, вирощеної з насіння за п. 35. Ця заявка претендує на пріоритет щодо попередньої заявки США Серійний № 60/604,604 (U.S. Provisional Application Serial No. 60/604,604), поданої 26 серпня 2004 року, та попередньої заявки США Серійний № 60/691,100 (U.S. Provisional Application Serial No. 60/691,100), поданої 15 червня 2005 року, повне розкриття суті яких включено до даної заявки як посилання. Передумови винаходу Цей винахід стосується систем та способів узяття зразків із біологічних матеріалів, таких як насіння. Підчас еволюції та вдосконалення рослин до рослини вносяться генетичні покращення - або шляхом селективного культивування, або шляхом генетичної маніпуляції, та, при досягненні бажаного покращення, отримують комерційну кількість, саджаючи та вирощуючи насіння протягом декількох поколінь. Не все насіння проявляє бажані риси, і тому таке насіння необхідно відбраковувати з популяції. Для прискорення процесу збільшення популяції беруть та перевіряють статистичні зразки, щоби відбракувати з популяції насіння, яке проявляє переважну рису недостатньою мірою. Однак, таке статистичне відібрання зразків обов'язково дозволяє деякій кількості насіння без бажаних рис залишатися в популяції, а також може випадково виключити деяке насіння з бажаним рисами з бажаної популяції. Коротке викладення суті винаходу Даний винахід стосується систем та способів недеструктивного відібрання зразкового матеріалу з насіння. Способи особливо адаптовані для автоматизації, що дозволяє відібрання більшої кількості зразків, аніж раніше було практично доцільним. З автоматизованим, недеструктивним відібранням зразків, яке дозволяють щонайменше деякі з утілень даного винаходу, є можливою перевірка кожного насіння в популяції та відбраковування того насіння, яке не проявляє бажаної риси. Це сильною мірою прискорює процес збільшення даної популяції насіння та може в результаті призвести до поліпшеної кінцевої популяції. Втілення даного винаходу дозволяють перевірку більшості або всього насіння в популяції перед посадкою, таким чином, час та ресурси не витрачаються на вирощування рослин без бажаних рис. Документ Загалом, система за даним винаходом включає: пробовідбірну станцію; пробовідбірник для вилучення матеріалу з насіння в пробовідбірній станції; конвеєр для насіння для подачі насіння із пробовідбірної станції до відділення в лотку для насіння; та конвеєр для подачі матеріалу, вилученого з насіння, до відповідного відділення в лотку для зразків. Згідно способу за даним винаходом, насіння подається окремо до пробовідбірної станції; та втримується в пробовідбірній станції доки з насін ня береться зразок. Кожен зразок подається конвеєром до щонайменше одного окремого відділення в лотку для зразків, а кожне насіння подається конвеєром до відділення в лотку для насіння з відомим взаємозв'язком із відділенням(и) лотку для зразків, до яких був переданий відповідний зразок. Зразки можна тестувати, а насіння відсортувати згідно результатів тестів. Ця система та спосіб за винаходом дозволяють автоматизоване, недеструктивне відібрання зразків із насіння. Вони дозволяють перевірку та сортування великих обсягів насіння, таким чином, сприяючи збільшенню популяцій насіння з бажаними признаками. Ці та інші риси та переваги будуть частково очевидними, а частково висвітленими тут далі. Короткий опис креслень Фіг. 1 є видом у перспективі першого втілення пробовідбірної системи для насіння, створеного згідно принципів даного винаходу; Фіг. 2 є збільшеним видом у перспективі пробовідбірного вузла пробовідбірної системи; Фіг. З є збільшеним видом у перспективі загрузочного ящика та механізму подачі насіння вузла пробовідбірника; Фіг. 4 є видом у перспективі свердла для відібрання зразків із насіння; [0013] Фіг. 5 є видом у перспективі направляючої для керування свердлом; Фіг. 6 є видом у перспективі клапану в механізмі подачі загрузочного ящика; Фіг. 7 є видом у перспективі платформи з декількома лотками для насіння та лотками для зразків, змонтованих на ній; Фіг. 8 є видом у перспективі двовимірного передаточного механізму; Фіг. 9 є видом у перспективі входу конвеєра для насіння; Фіг. 10 є видом у перспективі виходу конвеєра для насіння; Фіг. 11 є видом у перспективі виходу конвеєра для зразків; Фіг. 12 є видом у перспективі повітряного мультиплікатора, використовуваного в конвеєрах для насіння та зразків; Фіг. 13 є планом у виді згори пробовідбірної системи для насіння з високою пропускною спроможністю згідно принципів цього винаходу; Фіг. 14 є видом збоку пробовідбірної системи з високою пропускною спроможністю; Фіг. 15 є переднім видом у перспективі пробовідбірної системи для насіння; [0024] Фіг. 16 є заднім видом у перспективі пробовідбірної системи для насіння; [0025] Фіг. 17 є видом у перспективі пробовідбірної станції пробовідбірної системи з високою пропускною спроможністю; Фіг. 18А є частковим видом у перспективі однієї частини пробовідбірної станції для насіння згід 7 но принципів цього винаходу, із відведеним назад свердлом; [0027] Фіг. 18В є частковим видом у перспективі однієї частини пробовідбірної станції для насіння згідно принципів цього винаходу, із виведеним уперед свердлом; [0028] Фіг. 19А є видом збоку пробовідбірної станції для насіння, зі свердлом у відведеному назад положенні; Фіг. 19В є видом збоку пробовідбірної станції для насіння, зі свердлом у виведеному вперед положенні; Фіг. 20 є видом у повздовжньому перетині пробовідбірної станції для насіння; Фіг. 21 є видом збоку переднього кінця пробовідбірної станції для насіння; Фіг. 22 є видом у поперечному перетині пробовідбірної станції для насіння; Фіг. 23А є видом збоку колеса для захоплення насіння; Фіг. 23В є покомпонентним зображенням колеса для захоплення насіння; Фіг. 23С є видом у вертикальному перетині колеса для захоплення насіння; Фіг. 24 є видом спереду механізму подачі; Фіг. 25 є видом збоку механізму подачі; Фіг. 26А є видом у перспективі механізму подачі; Фіг. 26В є видом збоку механізму подачі; Фіг. 26С є видом у повздовжньому перетині механізму подачі, узятому за площиною по лінії 26С-26С на Фіг. 26В; Фіг. 26D є видом знизу в плані механізму подачі; Фіг. 27А є видом у вертикальному подовжньому перетині пробовідбірного механізму; Фіг. 27В є збільшеним частковим видом у вертикальному перетині пробовідбірного механізму, показаному на Фіг. 27А; Фіг. 28А є видом у вертикальному поперечному перетині пробовідбірного механізму; Фіг. 28В є збільшеним частковим видом у перетині пробовідбірного механізму, показаного на Фіг. 28А; та Фіг. 29 є Алелограмою, яка зображує зразки тканин ендосперму кукурудзи, які були піддані PCR для визначення конкретного SNP поліморфізму. Однакові числові позначення відмічають відповідні частини на декількох видах на кресленнях. Детальний опис переважних способів втілення Перше втілення автоматичної пробовідбірної системи для насіння, сконструйоване згідно принципів даного винаходу, загалом зазначене як 20 на Фіг. 1. Пробовідбірна система 20 адаптована ізолювати насіння з ящика, подавати до пробовідбірної станції, зіскоблювати зразок із насіння, подавати зразок до контейнера для зразків, та подавати насіння до відповідного контейнера для насіння. Як показано на Фіг. 1, пробовідбірна система для насіння включає опору 22, рамку 24 на опорі; пробовідбірний вузол 26, платформу 28, установлену на двовимірному передаточному механізмі ЗО, конвеєр для насіння 32 для транспортування насіння від пробовідбірного вузла для насіння, та 91985 8 конвеєр 34 для зразків для транспортування зразка, вилученого з насіння, до пробовідбірного вузла для насіння. Як показано на Фіг 1, у першому переважному втіленні опора 22 включає до себе возик 40 із колесами, який має четвірку вертикальних підпірок 42, приєднану верхніми та нижніми повздовжніми компонентами 44 та 46 спереду та ззаду, та верхніми та нижніми перехресними компонентами 48 та 50 у лівому та правому боках, та столетию 52, установлену на них. Для сприяння рухові опори 22 знизу кожної підпірки 42 може бути встановлений шарнір 54. Деталі конструкції опори 22 не є критичними для винаходу, таким чином, опора 22 може мати злегка іншу конфігурацію без відступу від принципів цього винаходу. Як також зображено на Фіг. 1, рамка 24 включає до себе чотири стійки 60, які виступають вертикально, змонтовані на столешні 52, які підтримують загалом горизонтальну плиту 62. Пробовідбірний вузол 26 встановлений на плиті 62, як більш детально описано нижче. Шпиндель 64 також установлений на плиті та виступає загалом горизонтально за її межі. Вільний кінець шпинделя 64 має перший та другий вертикальні підпірки 66 та 68 для встановлення конвеєра 32 для насіння та частин конвеєра 34 для зразків, відповідно. Деталі конструкції рамки 24 не є критичними для винаходу, таким чином, рамка може мати трохи іншу конфігурацію без відхилення від принципів даного винаходу. Як показано на Фіг. 1 та 2, пробовідбірний вузол 26 встановлений на плиті 62 рамки 24. Пробовідбірний вузол включає до себе приймач або ящик 70, пробовідбірну станцію 72, механізм подачі 74 для подачі окремого насіння з ящика 70 до пробовідбірної станції. Як показано на Фіг. 1 та 3, платформа 28 адаптована для безпечного встановлення великої кількості лотків 80 для насіння та лотків 82 для зразків у фіксованих положеннях та орієнтаціях. Кожен із лотків 80 для насіння та лотків 82 для· зразків бажано розділений на декілька відділень. Кількість та розташування відділень у лотках 80 для насіння бажано відповідає кількості та розташуванню відділень у лотках 82 для зразків. Це забезпечує відповідність один-в-один між насінням та його зразком. Однак, у деяких утіленнях може бути бажаним забезпечити декілька відділень у лотку для зразків для кожного відділення у лотку для насіння, наприклад, якщо зі зразками проводять декілька тестів, або якщо з одного насіння можуть бути взяті різні зразки (напр., зразки з різних глибин). Платформа 28 встановлена на двовимірному передаточному механізмі 30, який у цьому переважному втіленні включає до себе основу 90 із першим лінійним позиціонером 92, який має рухому каретку 94, установлену на основі 90, та другий лінійний позиціонер 96, який має каретку 98, установлену на каретці 94 першого лінійного позиціонеру 92. Конвеєр 32 для насіння включає до себе трубу 100 із вхідним кінцем 102, який прилягає до пробовідбірної станції 72, та вихідним кінцем 104, 9 установленим на підпірці 66 рамки 24. На вхідному кінці 102 труби 100 встановлена перша трубка Вентурі 106 для введення потоку повітря до труби в напрямку до вихідного кінця 104 труби, та друга трубка Вентурі 108 встановлена на вихідному кінці 104 труби 100 для введення потоку повітря в напрямку вхідного кінця 102 труби. Перша трубка Вентурі 108 використовується для створення потоку повітря в трубі та перенесення насіння із пробовідбірної станції до труби вздовж першого кінця. Друга трубка Вентурі 108 потім використовується для створення потоку повітря в протилежному напрямкові, таким чином, уповільнюючи насіння для зменшення можливості пошкодження насіння, коли воно виходить із вихідного кінця 104 труби та попадає до відділення в лотку. У цьому переважному втіленні друга трубка Вентурі 108 насправді зупиняє рух насіння, дозволяючи йому падати під впливом сили тяжіння до свого відділення в лотку 90. У трубі 100 для визначення присутності насіння та впевненості у відповідній дії конвеєра 32 для насіння можуть бути встановлені різноманітні позиційні датчики. Конвеєр 34 для зразків включає до себе трубу 120 із вхідним кінцем 122 та прилеглою пробовідбірною станцією 72 та вихідним кінцем 124, установленим на підпірці 68 рамки 24. Також, для введення потоку повітря в трубу в напрямку вихідного кінцю 124 труби, установлена перша трубка Вентурі 126. На вихідному кінці знаходиться сепаратор 128 для відділення матеріалу зразку від потоку повітря, який його переносить, таким чином, щоби потік не видував зразок із відділення у лотку 92. Сепаратор бажано також містить фільтр для запобігання перехресного забруднення зразків. Як показано на Фіг. 2, пробовідбірний вузол 26 для насіння пристосований для встановлення на плиті 62 на підпірці 140. Пробовідбірний вузол 26 для насіння включає до себе монтажну плиту 142 для ящиків, монтажну плиту 144 для направляючих та чотири опори 146 для підтримання жорсткості направляючої між ними. Ящик 70 (показаний на Фіг. 3), який подає окремі насіння до пробовідбірної станції 72, установлений на плиті 142 для ящиків. Пробовідбірна станція 72 містить гніздо 148 для насіння, установлене на утримувачі 150 для гнізда, який підтримується з монтажної плити 144 для направляючих парою стійок 152 жорсткості. Гніздо 148 має отвір до його нижньої поверхні, до якого ящик 70 подає одне насіння. Згори гнізда 148 для насіння є прорізь, через яку є доступ до частини насіння, яке знаходиться в отворі. Свердло 154 (Фіг. 4) установлене на утримувач 156 для свердла, який установлено на рухомій за направляючими плиті 158 на програмованій направляючій 160, із блоком 162 фіксації свердла. Програмована направляюча 160 (Фіг. 5) установлена на нижній стороні монтажної плити 144 для направляючих та пересуває свердло 154 крізь прорізь у гнізді 148 для насіння для вилучення зразку з насіння, яке знаходиться в отворі в гнізді для насіння. Як найкращим чином показано на Фіг. 4, свердло 154 має велику кількість зубчиків 164, які збільшуються по висоті в напрямку кінця, ближчого 91985 10 до місця закріплення, таким чином, коли свердло вводиться до прорізі, воно врізається все глибше до насіння, яке знаходиться в отворі в гнізді 148. Отриманий поступовий зіструг зменшує шкоду, спричинену насінню, захищаючи його життєздатність. Більше того, як більш детально описано нижче, завдяки врізанню на різні глибини в різні рази, можна брати окремо зразки з різних глибин одного й того ж насіння для проведення окремих тестів. Труба 166 для транспортування зразку проходить від отвору в гнізді 148 для насіння та має коннектор 168 на кінці для з'єднання з конвеєром 34 для зразків. Пробовідбірна станція 26 також включає до себе ящик 70, найкраще показаний на Фіг. 3. Ящик 70 містить ліву та праву монтажні плити 170 та 172 для ящиків, а також монтажну плиту 174 для циліндру та верхній кронштейн 176 для циліндру. Ящик 70 також має передню панель 178, задню панель 180, першу та другу кінцеві панелі 182 та 184, а також дно 186. Розділювач 188 ділить ящик на перше та друге відділення 190 та 192. Перше відділення 190 утримує запас насіння, яке по одному переноситься до другого відділення 192. Поршневий позиціонер 194 керує поршнем 196 для підняття насіння з першого відділення. Вузол 198 повітряного ежектора переносить насіння з кінця поршня 196 до другого відділення 192. Друге відділення має фігурне дно 200, із колодязем 202 для отримання насіння та розташування його. Поршневий позиціонер 210 керує поршнем 214 для підняття насіння із другого відділення 192. Вузол 216 повітряного ежектора використовується для перемішування насіння підчас процедури захвату насіння. Як зображено на Фіг. 7, платформа 28 має кронштейни 220 для встановлення лотків 90 для насіння та лотків 92 для зразків у суміщенні, таким чином, конвеєр для насіння та конвеєр для зразків доставляють насіння та зразки до відповідних відділень, у відповідних лотках. Лотки 92 для зразків можуть (як показано) бути пристосовані для втримування окремих пробірок. Звичайно ж, можуть використовуватися лотки різноманітних конфігурацій, наприклад, такі, у яких передбачені декілька відділень для декількох зразків з одного й того ж насіння. Наприклад, якщо один зразок розділюють на декілька зразків, або якщо зразки розрізняються місцем узяття, наприклад, глибиною. Як показано на Фіг. 8, двовимірний передаточний механізм 30 також містить повзун 230, який має рейку 232 та каретку 234, який розташований паралельно до першого лінійного позиціонера 92. Другий лінійний позиціонер 96 встановлений на каретці 94, маючи каретку 98, установлену на каретці 94 першого лінійного позиціонера 92. Платформа 28 встановлена на каретці 98 другого лінійного позиціонера 96, і, таким чином, може точно рухатися у двох вимірах завдяки керуванню першим та другим лінійними позиціонерами 92 та 96. При належному контролюванні, передаточний механізм може з'єднувати окремі відділення лотків 90 для насіння та лотків 92 для зразків із виходами конвеєра для насіння та конвеєра для зразків. 11 Як показано на Фіг. 9, на вхідному кінці 102 труби 100 конвеєра 32 для насіння, кронштейн 240 утримує повітряний підсилювач 242 та сенсорну трубку 244 для насіння. Кронштейн 240 містить частини 246, 248, 250, 252 та 254. Як показано на Фіг. 2, кронштейн 240 встановлений на монтажній плиті 142 для ящиків. Повітряний підсилювач 242 (показаний на Фіг. 12) пристосований для приєднання до джерела стиснутого повітря. Коли повітря подається до повітряного підсилювача, воно спричиняє потік повітря через трубу 100, викликаючи ефект Вентурі. Сенсорна трубка 244 має датчики 256 насіння для детекції проходження крізь неї насіння. Датчики 256, бажано, є оптичними датчиками, суміщеними з отворами в сенсорній трубці 244, які оптично визначають проходження насіння. Як показано на Фіг. 10, випускний вузол 260 для насіння розташований на вихідному кінці 104 труби 100 конвеєра 32 для насіння. Випускний вузол установлений на підпірці 66, із кронштейном 262 та випускною опорою 264. Сенсорна трубка 266 для насіння встановлена в кронштейні 262, та має датчики 268 насіння для визначення проходження насіння через неї. Датчики 256, бажано, є оптичними датчиками, суміщеними з отворами в сенсорній трубці 244, які оптично визначають проходження насіння. Повітряний підсилювач 270 приєднаний до сенсорної трубки 266 для насіння. Повітряний підсилювач 270 (Фіг. 12) пристосований для приєднання до джерела стиснутого повітря. Коли повітря подається до повітряного підсилювача, воно спричиняє потік повітря через трубу 100, викликаючи ефект Вентурі. Під повітряним підсилювачем 270 знаходиться з'єднувальна трубка 272, під якою розташована оснащена клапаном випускна трубка 274 для насіння, яка також підтримується утримувачем 276 для випускної трубки для насіння, розташованим на позиціонері 278 випускної трубки для насіння. Вхідний кінець 122 трубки 120 конвеєра 34 для зразків приєднаний за допомогою з'єднувача 168 до випускної трубки 166 для зразків. Як показано на Фіг. 11, вихідний кінець 124 труби 120 приєднаний до з'єднувача 280 для зразків, який, у свою чергу, приєднаний до повітряного підсилювача 282, який приєднаний до дрібної форсунки 284. Дрібна форсунка 284 встановлена на утримувачеві 286 випускної трубки для насіння, установленому на вивідному позиціонері 288. Вивідний позиціонер установлений на підпірці 68. Фільтри 290 встановлені на вихідних отворах дрібної форсунки 284 для запобігання забруднення інших відділень зразками, що виводяться. Експлуатація пробовідбірної системи При експлуатації, велику кількість насіння, наприклад, соєвих бобів, розміщують у ящику 70. Механізм 74 подачі насіння передає окреме насіння до пробовідбірної станції 72. У пробовідбірній станції з насіння вилучають зразок матеріалу способом, який мінімізує вплив на життєздатність насіння. Зразок вилучають із пробовідбірної станції 72 за допомогою конвеєра 34 для зразків. Трубка Вентурі 126 створює потік повітря в трубі 120 в на 91985 12 прямку вихідного кінця 124. Матеріал зразку переноситься до труби та до відділення лотку для зразків, вирівняного з вихідним кінцем 124 труби 120. Сепаратор 128 відділяє зразок від потоку повітря, який його переносить, та дозволяє зразкові впасти до відділення. У деяких випадках, зразок можна розподілити до двох або більше відділень у тому й самому лотку, у цьому випадку, двовимірний передаточний механізм ЗО застосовується для вирівнювання одного, або більше додаткових відділень із виходом 124. При експлуатації пробовідбірної станції 27 є можливість точно координувати рух лотків для зразків, таким чином, що зразки з різних частин насіння, та, зокрема, з різних глибин насіння, можуть потрапляти до окремих відділень у тому й самому лотку. Після завершення взяття зразків конвеєр 32 для насіння використовується для видалення насіння із пробовідбірної станції. Перша трубка Вентурі 106 використовується для створення потоку повітря в трубі та перенесення насіння із пробовідбірної станції 72 до труби 100. Друга трубка Вентурі 108 потім використовується для створення потоку повітря в протилежному напрямкові, таким чином, уповільнюючи насіння для зменшення можливості пошкодження насіння, коли воно виходить із вихідного кінця 104 труби 100 та попадає до відділення в лотку 92. Друга трубка Вентурі 108 бажано зупиняє рух насіння, дозволяючи йому падати під впливом сили тяжіння до свого відділення в лотку 90. Робота першої та другої трубок Вентурі 106 та 108 може зупинятися через деякий час, або вони можуть запускатися датчиками положення, які моніторять трубу 100. Втілення пробовідбірної системи для насіння з великою пропускною здатністю загалом позначене 500 на Фігурах 13-26. Як показано на Фігурах 13 та 14, пробовідбірна система 500 для насіння включає пробовідбірну станцію 502, станцію 504 для втримування зразків та станцію 506 для втримування насіння. Бажано, але не обов'язково, щоби пробовідбірна система 500 для насіння вміщувалася на одну або більше оснащених колесами візків, які можуть проходити крізь звичайні дверні отвіри, таким чином, щоби систему можна було зручно перевозити. У цьому переважному втіленні пробовідбірна станція 502 для насіння встановлена на візку 508, станція для втримування зразків установлена на візку 510, та станція для втримування насіння встановлена на візку 512. Пробовідбірна станція 502 містить пристрій 514 для подавання насіння та пристрій 516 для узяття зіскобів. З поверхні 520 візка 508 вертикально стирчить велика кількість колон 518. Платформа 522 встановлена на вершині колон 518 та підтримує пристрій 514 для взяття зіскобів із насіння. Дві L-подібні скоби 524 простираються в горизонтальному напрямкові від колон 518 та підтримують платформу 526. Платформа 528 встановлена на платформі 526 за допомогою множини підпірок 530 та підтримує подавач 514 насіння. Множина опор 532 простирається вгору із плити 522. Плита 534 встановлена на опорах 532. Множина підпірок 536 спирається на плиту 534 та підтримує полку 538. 13 Як показано на Фігурах 13, 14, 15 та 16, подавач 514 насіння включає до себе ящик 550 із фігурною поверхнею, пристосованою для подачі насіння, яке потрапляє до ящика через роздільне колесо 552 (див. також Фігури з 23А по 23С). Роздільне колесо 552 встановлене таким чином, щоби воно оберталося у вертикальній площині, прилеглій до ящика 550, та має множину зубчиків 554, розділених відстанню, кожен з яких має отвір 556, який сполучається з вакуумною системою (не показана). Колесо 552 вдосконалене за допомогою індексаторного двигуна 560. Окремі насіння підхоплюються зубчиками 554 у колесі 552. Мітелка 562 змітає окремі насіння із зубчиків 554, дозволяючи їм упасти через направляючу 564 до отвору в розподілювачі 566. Як показано на Фігурах 24-26, розподілювач 566 містить вал 568, який має декілька (у переважному втіленні - шість) каналів 570, розташованих у поперечному напрямкові. Рукави 572 та 574 встановлені з можливістю ковзання на кожному кінці вала 568 для передачі між першим (всередині) та другим (ззовні) положеннями. Рукави 572 та 574 мають множину пар взаємоз'єднаних отворів 576 та 578 на протилежних сторонах. Отвори 576 мають видовжену форму, та отвори 576 та 578 мають такий розмір та розташування, щоби, коли рукави 572 та 574 знаходяться в першому (всередині) положенні (на лівій частині Фіг. 24), частина видовжених отворів 576 вирівняна з каналом 570 у валу 568, а коли рукави знаходяться у своєму другому (ззовні) положенні, видовжені отвори 576 та другі отвори 578 вирівняні з каналом (праворуч на Фіг. 24). Позиціонер 580 селективно пересуває рукави 572 та 574 між першим та другим положеннями. Розподілювач 566 закріплений за допомогою кронштейну 582 на каретці 584 лінійного позиціонера 586 для того, щоби передавати за направляючою 564, успішно вирівнюючи кожен із каналів 570 у валу 568 із направляючою 564, щоби насіння могло бути туди переміщене. Датчик насіння (не показаний) може бути встановлено впритул до направляючої 564 для того, щоби підтверджувати, що насіння потрапило до кожного каналу 570. Велику кількість повітряних сопел 590 встановлено на платформі 528, вони вирівнюються з каналами 570, коли розподілювач 566 пересувається на своє розподільне положення за допомогою позиціонера 586. Труба 592 вирівняна з кожним каналом 570, та кожна труба з'єднує з однією з множини пробовідбірних станцій 600 для насіння в шкребку 516 для насіння. Рукави 572 та 574 пересуваються, дозволяючи насінню в каналах 570 падати до труб 592. Одне із сопел 590 вирівняне з кожним із каналів 570 та позиціонується для того, щоби сприяти рухові насіння з каналів 570 через труби 592 до їхніх відповідних пробовідбірних станцій 600 для насіння. Переважно, існує прохід 596 через ящик 550, який відповідає отвору 556 у кожному зубчику 554 по мірі обертання колеса 552. Порт 596 можна приєднувати до вакууму для усунення будь-якого бруду або шматочків луски насіння, або насіння, яке може забити отвори 556 у колесах 554, блоку 91985 14 ючи здатність колеса 552 вибирати окремі насіння з ящика 550. Шкребок 516 для насіння містить щонайменше одну, а в цьому переважному втіленні, шість пробовідбірних станцій 600. Кожна пробовідбірна станція 600 для насіння вилучає зразок матеріалу з насіння, яке до неї потрапляє. У цьому переважному втіленні пробовідбірні станції 600 організовані або об'єднані у дві групи по три станції, але кількість та розташування станцій може варіюватися. Станція 504 для втримування зразків приймає зразки тканин, видалені з насіння та передані з кожної пробовідбірної станції 600. Аналогічно, станція 506 для втримування насіння приймає насіння після відбирання з насіння зразку, а насіння передається із пробовідбірної станції 600. Кожна пробовідбірна станція 600 для насіння має вхідну втулку 602, приєднану до труби 590, яка відкривається до камери 604. Нижня поверхня камери 604 сформована кінцем стрижня 606 позиціонера 608. Поверхня дна знаходиться нижче вхідної втулки 602 для того, щоби переконатися, що насіння падає до камери 604 цілком та не вловлюється в положенні лише часткового потрапляння до камери. Клапан 610 може бути розташований навпроти вхідної втулки 602, дозволяючи виходити повітрю з повітряних сопел 590. Клапан 610 може бути вкритий решітчастою сіткою 612, щоби втримувати насіння від вискакування з камери 604 та м'яко втримувати насіння, коли воно потрапляє до камери. Цей стрижень 606 підіймає насіння з камери 604 до заглиблення 614, яке приймає насіння, на нижньому боці пробовідбірної пластини 616 для насіння. Ця пробовідбірна пластина 616 має пробовідбірний отвір 618, крізь який проникає насіння в заглиблення 614, яке приймає насіння. Пробовідбірний паз 620 сформований на верхній поверхні пробовідбірної пластини 616 таким чином, щоби частина насіння в заглиблення 614 проникала до паза. Пробовідбірна пластина 616 також має спрямовані вбоки отвори 622 та 624, суміщені із заглибленням 614, що приймає насіння. Коли стрижень 606 підіймає насіння, подане до пробовідбірної станції 600, до заглиблення 614 у пластині 616, пальчики 626 та 628 проникають хрестнавхрест через отвори 622 та 624 та керуються позиціонером 630 для захоплення на стиснення насіння. Було винайдено, що стискання, щонайменше деяких видів насіння, підчас процесу відібрання зразків може покращити життєздатність насіння після відібрання зразків. Для такого насіння, як соєві боби, було знайдено, що компресійний тиск посилює життєздатність насіння, а компресивного тиску між приблизно 1,13 кг та 2,27 кг достатньо для посилення життєздатності. Пробовідбірне свердло 650, яке має множину ріжучих кромок 652, обертається зворотньопоступально в пазу 620, таким чином, ріжучі кромки 652 можуть зішкрібати зразок із насіння, яке втримується в заглибленні 614 за допомогою стрижня 606 та пальчиків 626 та 628. Ріжучі кромки 652, бажано, є паралельними, та розташовані під косим кутом, меншим за 90°, стосовно напрямку пересування свердла. Бажано, але не суттєво, 15 щоби ріжучі кромки 652 мали кут, достатній для того, щоби завжди в контакті з насінням залишалася одна кромка. Оперування кутом ріжучих кромок дозволяє наступній кромці встановлювати контакт із насінням до того, як теперішня кромка втратить контакт із насінням. У переважному втіленні ріжучі кромки спрямовані під кутом приблизно 60°, хоча такий кут буде деякою мірою залежати від ширини свердла. Ширина свердла також є важливою для збереження життєздатності насіння після взяття зразку та може варіюватися, залежно від типу насіння та його вологовмісності. Ріжучі кромки 652 розташовані в шаховому порядку, кожна з них врізається прогресивно глибше, аніж попередня. Кількість матеріалу зразку та глибина зрізу можуть контролюватися за допомогою контролю висунення вперед свердла 650. Для менших зразків та невеликих глибин зрізу, хід свердла 650 коротший, а для більших зразків та більших глибин зрізу, хід свердла є більш довгим. При часткових ходах тканина з насіння може захоплюватися між кромками 652. Свердлом 650 можна рухати взад-уперед для допомоги звільнення всього зразка. Наприклад, після того як насіння вивільнено, свердло може рухатися взад-уперед для допомоги вивільненню тканини насіння, захопленій між ріжучими кромками. Повний діапазон руху свердла 650 показаний на Фігурах 19А та 19В. Пробовідбірне свердло 650, бажано, кероване лінійним позиціонером 654. У переважному втілення три свердла 650 керовані одним позиціонером 654. Використання одного позиціонера для керування багатьма свердлами є більш економічно доцільним. Система 656 транспортування зразка, яка включає до себе трубопровід 658, який має вхід 660, що сполучається із проходом 662, який відкривається до пробовідбірного отвору 618 та паза 620 на пробовідбірній пластині 616, видаляє зразки тканин, отримані дією ріжучих кромок 652 пробовідбірного свердла650. Трубопровід 658 транспортує зразок до виходу 664, де він розміщується до окремого утримувача для зразків у станції 504 для втримування зразків. Цим утримувачем для зразків може бути, наприклад, колодязь 666 у лотку 668, установленому на х-у індексуванному столі 670 на возику 510, і, таким чином, взаємозв'язок між зразками та їхнім відповідним насінням можна визначити. Система 656 транспортування зразків містить повітряний ежектор 672, який спричиняє потік повітря крізь трубопровід 658 для пересування зразка крізь трубопровід. Другий пробовідбірний механізм може бути змонтований на лінійному позиціонері 654 та рухається зі свердлом 650. Другий пробовідбірний механізм може включати бурову установку 674, яка має бур 676 для взяття проби з насіння зі зрізу, зробленого свердлом 650. Тканина в такому зразку береться з більшої глибини, аніж тканина, зіскоблена свердлом 650, та надає іншу інформацію. У деяких утіленнях, матеріал, видалений свердлом 650, може просто викидатися, а втримується лише зразок, узятий буровою установкою 674. У деяких випадках, можуть утримуватися ат окремо зберігатися для різних тестувань обидва зразки. Ще в 91985 16 інших утіленнях єдиним зразком є зразок, вилучений свердлом 650. У втіленнях без другого пробовідбірного механізму, бурова установка 674 та бур 676 можуть бути заміщені на позиціонер із простим поршнем, який проникає через пробовідбірний отвір 618 та допомагає проштовхнути насіння в заглибленні 614. Система 680 транспортування насіння, яка має вхід 682, прилегле заглиблення 614 для отримання насіння після того, як воно випущене пальчиками 626 та 628, та стрижень 606 опускає насіння по завершенні операції з узяття зразка. Система 680 транспортування насіння переносить насіння до окремого утримувача для насіння в станції 506 для втримування насіння на возику 512. Цей утримувач для насіння може являти собою, наприклад, колодязь 684 у лотку 686, установленому на х-у індексованому столі 688 на возику 612, і таким чином, взаємозв'язок між зразками та їхнім відповідним насінням можна визначити. Система 680 транспортування насіння включає повітряний ежектор 690, який спричиняє потік повітря крізь трубопровід 680 для пересування зразка крізь трубопровід. Експлуатація При експлуатації велику кількість насіння, напр., соєвих бобів, зсипають до ящика 550 пробовідбірної системи 500. Насіння під дією гравітації проходить до диска 552, проникнення через отвори 556 затримує одне насіння в кожному заглибленні 554. По мірі того, як диск 552 обертається за допомогою індексаторного мотору 560, окреме насіння змітають із диску за допомогою мітелки 562, та падають під дією гравітації через направляючу 564 до виходу. Лінійний позиціонер 586 рухає розподілювач 566, таким чином, що кожний канал 570 дистриб'ютора вирівнюється з направляючою 564 для завантаження одного насіння через отвір 576 до каналу 570. Коли всі канали 570 розподілювача 566 заповнюються, лінійний позиціонер 586 переміщує розподілювач у положення для завантаження насіння, що знаходиться в ньому, до пробовідбірних станцій 600 у шкребку 516. Рукави 572 та 574 рухаються за допомогою позиціонера 580, який вирівнює отвори 578 із каналами 570, дозволяючи насінню, яке знаходиться в каналах 570, упасти до труб 592, які ведуть до пробовідбірних вузлів 600. Сопла 590 надають поштовх повітря, який допомагає проштовхнути насіння з каналів 570 через труби 592 до камер 604 пробовідбірних вузлів 600. Бажано, усі канали 570 завантажуються серійно та вивільняють своє насіння одночасно до пробовідбірних вузлів 600, але розподілювач можна запрограмувати на роботу якимось іншим способом. Коли насіння потрапляють до пробовідбірних станцій 600, стрижні 606 підіймають насіння до заглиблень 614 на зворотній стороні пластин 616. Заглиблення 614 можуть мати розміри та форму, які допомагають оптимально зорієнтувати насіння. У заглибленнях 614 частина насіння проникає крізь пробовідбірні отвори 618 до пазів 620. Свердла 650 рухаються в пазах 620, дозволяючи їхнім ріжучим кромкам 652 вилучати матеріал із частин насіння, які проникли до пазів 620, та утворюючи 17 невеликі зрізи в насінні. По мірі того, як кожне свердло 650 вилучає матеріал, система 656 транспортування для зразків переносить матеріал зразка через прохід 662 до вхідного отвору 660. Зразки переміщуються по трубопроводах 658 від пробовідбірних станцій 600 до місця збереження зразків, такого як. Колодязі 666 у лотку 668 для зразків. Другий зразок можна брати за допомогою бура 676 пробовідбірника 674 крізь отвір 618 у пробовідбірній пластині 616. Після завершенні процедури відібрання зразка стрижень 606 відходить назад, а насінняпадає до системи 680 транспортування для насіння, з якого вже взятий зразок, яка переносить насіння, з якого відібраний зразок до місця зберігання насіння, такого як колодязь 684 у лотку для насіння 686. Індексовані столи 670 та 688 рухаються для того, щоби вирівняти різні колодязі з вихідними отворами системи 656 транспортування для зразків та системи 680 транспортування для насіння, а процес узяття зразків повторюється. Коли всі колодязі 666 у лотку 668 для зразків заповнюються, зразки в лотку для зразків можна піддавати тестуванням, а насіння у відповідному лотку 686 для насіння можна відбирати згідно результатів тестування зразків. Відібрання зразку бажано не має істотного негативного впливу на життєздатність насіння. Застосування Даний винахід представляє способи аналізу насіння, як має переважну рису, маркер або генотип. В одному аспекті винаходу, аналітичні способи дозволяють проведення аналізу окремих насінин, які наявні в партії, або в усій популяції насіння, таким чином, можна визначати хімічні та/або генетичні характеристики окремих насінин. Зразки, отримані за даним винаходом, можна використовувати для визначення широкого спектру фізичних, хімічних та/або генетичних рис. Приклади хімічних аналізів для використання в способах за даним винаходом включають визначення вмісту крохмалю, умісту протешу, умісту олії, визначення діаграми жирних кислот, інш. В одному втіленні способи та прилади за даним винаходом можна використовувати в програмі селекції для відбору рослин або насіння, які мають переважну рису, або маркерний генотип. Способи даного винаходу можуть використовуватися в комбінації з методологією селекції та можуть використовуватися для відбору одного покоління або відбору декількох поколінь. Вибір способу селекції залежить від способу розмноження рослини, спадковості риси(рис), які покращують, та типу культивару, який використовують комерційно (напр., культивар гібриду Fi, культивар чистої лінії, інш.). Окремі, але не обмежувальні підходи до розведення рослин за даним винаходом зазначені далі. Також зрозуміло, що в програмі селекції можна використовувати будь-які комерційні та некомерційні культивари. Фактори, такі як, наприклад, сила пророщення, сила вегетації, стійкість до стресу, стійкість до захворювань, відгалуження, квітування, кількість насіння у врожаї, розмір насіння, щільність насіння, стійкість та міцність, інш., будуть диктувати вибір. 91985 18 В окремому втіленні способи за даним винаходом використовують для визначення генетичних характеристик насіння в програмі селекції за допомогою маркера. Такі способи дозволяють покращення програм селекції за допомогою маркера, причому може проводитися недеструктивне пряме взяття зразку з насіння при дотриманні ідентифікації окремих насінин від пробовідбірника для насіння до поля. У результаті, програма селекції за допомогою маркера стає «високоефективною» основою, при якій популяцію насіння, яке має переважну рису, маркер або генотип, можна більш ефективно збільшувати за коротший проміжок часу, із меншими затратами земельних та трудових ресурсів. Такі переваги будуть більш докладно описані нижче. В одному втіленні даний винахід описує спосіб проведення аналізу окремих насінин у межах популяції насіння, яке має генетичні відмінності. Спосіб включає вилучення зразків, які містять клітини із ДНК, з насіння в популяції без впливу на здатність до пророщення насіння; скринінг ДНК, екстрагованої зі зразку в присутності або відсутності щонайменше одного генетичного маркера; відбір насіння з популяції, ґрунтуючись на результатах скринінгу ДНК; та вирощування рослин із відібраного насіння. Як описано вище, пробовідбірні системи та способи за даним винаходом захищають здатність до пророщення насіння, будучи не деструктивними. Здатність до пророщення означає, що переважна більшість насіння, з якого були взяті зразки (напр., більше 50% усього насіння, з якого були взяті зразки), залишається життєздатною після відібрання зразків. У даному конкретному втіленні життєздатність зберігає щонайменше 75% насіння, з якого були взяті зразки, а в деяких утіленнях, щонайменше 85% насіння залишається життєздатним. Слід відмітити, що більш низькі частки збереженої життєздатності можуть бути прийнятними при певних обставинах, або для певних застосувань, наприклад, завдяки тому що витрати на генотип зменшуються із часом, оскільки за ту саму вартість витрат на генотип можна перевірити більшу кількість рослин. В іншому втіленні здатність до пророщення підтримують щонайменше на протязі шести місяців після відібрання зразку, щоби переконатися, що насіння буде життєздатним, коли потрапить на поле для вирощування. У цьому конкретному втіленні способи за даним винаходом також включають обробку насіння, з якого були взяті зразки, для підтримування здатності до пророщення. Така обробка може, загалом, включати будь-які способи, відомі фахівцеві в галузі, для захисту насіння від умов навколишнього середовища при зберіганні та транспортуванні. Наприклад, в одному втіленні, насіння, з якого відбирали зразки, можна обробити полімером та/або фунгіцидом для захисту насіння, з якого відібрали зразок при зберіганні, або транспортуванні до поля перед посадкою. ДНК можна екстрагувати зі зразку, використовуючи будь-які способи екстракції ДНК, відомі спеціалістам у галузі, які забезпечують достатній вихід ДНК, якість ДНК та відповідь PCR. Не 19 обмежувальним прикладом придатних способів екстракції ДНК є екстракція, основана на депротеїнізації за допомогою додецилсульфату натрію, із центрифугуванням. Додатково, екстраговану ДНК можна посилювати після екстракції, використовуючи спосіб ампліфікації, відомий фахівцям у даній галузі. Наприклад, придатним способом ампліфікації є препарат для ампліфікації ДНК GenomiPhi® від Amersham Biosciences. Екстраговану ДНК перевіряють на присутність або відсутність підходящого генетичного маркера. Фахівцям у даній галузі відоме та доступне широке розмаїття генетичних маркерів. Скринінг ДНК на присутність або відсутність генетичного маркера можна використовувати для відбору насіння в популяції для селекції. Скринінг можна використовувати для відбору локусів кількісних рис (QTL), алелей, або геномних ділянок (галотипів). Алелі, QTL або галотипи, за якими слід проводити відбір, можна визначати, використовуючи новітні методики молекулярної біології з модифікаціями класичних селективних стратегій. В одному втіленні насіння відбирають, ґрунтуючись на присутності або відсутності генетичного маркера, який генетично зв'язується з QTL. Приклади QTL, які часто являють цікавість, включають, але не обмежені ними, продуктивність, стійкість до полягання, висота, родючість, стійкість до хвороб, стійкість до шкідників, стійкість до дефіциту поживних речовин, та гранулометричний склад. В альтернативному випадку, насіння можна відбирати, базуючись на присутності або відсутності маркера, який генетично зв'язаний із галотипом, пов'язаним з QTL. Приклади такого QTL знову ж таки можуть включати, не обмежуючи, продуктивність, стійкість до полягання, висота, родючість, стійкість до хвороб, стійкість до шкідників, стійкість до дефіциту поживних речовин, та гранулометричний склад. Відбір популяції для селекції має розпочинатися ще на рівні F2, якщо в першому схрещенні використовувалися гомозиготні інбредні батьки. Покоління F1 також можна перевіряти та покращувати, якщо один або більше батьків при схрещуванні був гетерозиготним за алелями або маркерами, які представляють інтерес. Селекціонер може перевіряти популяцію F2 для збереження маркерного генотипу в кожній особині в популяції. Первісні розміри популяції, обмежені лише кількістю доступного насіння для скринінгу, можна регулювати для досягнення бажаної вірогідності успішного визначення бажаної кількості особин. Див. Sedcole, J.R. "Number of plants necessary to recover a trait." («Кількість рослин, необхідна для відновлення риси») Crop Sci. 17:667-68 (1977). Відповідно, вірогідність знаходження бажаного генотипу, розмір початкової популяції та планований розмір кінцевої популяції можна змінювати для різноманітних методологій селекції та рівень самозапилення популяції, з якої беруться зразки. Відібране насіння може зберігатися скопом або втримуватися окремо, залежно від методології селекції та її мети. Наприклад, якщо селекціонер перевіряє популяцію F2 щодо стійкості до хвороб, усі особини з бажаним генотипом можна змішувати в кучу та висаджувати на селекційній ділянці. 91985 20 Навпроти, якщо з даної популяції відбираються багато QTL із різними ефектами на рису, таку як урожайність зерна, селекціонер може зберігати ідентичність особин, збираючись при посадці розділити особини з різними комбінаціями цільового QTL. При передачі насіння із сортувальної лабораторії до поля можна використовувати декілька способів, які зберігають ідентичність окремого насіння. Способи включають, але не обмежуються ними, передачу відібраних особин до насіннєвої стрічки, касетного лотка або індексованого лотка, висадка разом із брикетами торфу, а також посадка вручну з окремих упаковок насіння. Залежно від мети селекції та генетичної складності, можна використовувати декілька циклів відбору. [Переваги застосування способів перевірки за даним винаходом включають, не обмежуючи, зменшення кількості трудових та земельних ресурсів, необхідних на популяцію або· селекційну лінію, збільшену здатність оцінити більшу кількість селекційних популяцій на одиницю площі поля, та збільшену здатність моніторити селекційні популяції щодо бажаних рис до посадки. Витрати земельних ресурсів на популяцію зменшуються з обмеженням площі поля, необхідної для розвинення бажаних генотипів. Наприклад, популяцію з 1000 особин можна посадити із щільністю 25 насінин на рядок, споживаючи загалом 40 рядків із поля. Використовуючи традиційний аналіз тканини, усі 1000 рослин будуть помічені та випробувані вручну, за допомогою підрахунку тканини листя. Перед запиленням будуть необхідні результати молекулярного маркера, і запилені будуть лише ті рослини, які містять переважну генетичну композицію. Таким чином, якщо буде виявлено, що переважну композицію містять 50 насінин, традиційна методологія селекції буде вимагати посадки 1000 рослин для отримання 50 насінин. Навпроти, способи моніторингу за даним винаходом дозволяють селекціонерові перевірити 1000 насінин у лабораторії та обрати бажані 50 насінин ще до посадки. Ці 50 особин потім можна висадити на поле, зайнявши лише 2 рядки по 25 насінин. Додатково, способи моніторингу за даним винаходом не вимагають помічення або взяття зразків на полі, таким чином, значно знижуючи необхідну кількість людських трудових ресурсів. Додатково до зменшення кількості рядків на полі на популяцію, способи моніторингу за даним винаходом можуть також збільшити кількість популяцій, які селекціонер може оцінити на даній селекційній ділянці. Використовуючи вищенаведений приклад, у якому 50 насінин із популяції численністю 1000 насінин містили переважну генетичну композицію, селекціонер, застосовуючи способи за даним винаходом, міг би оцінити 20 популяцій по 50 насінин кожна, використовуючи таку саме площу поля, яка була би зайнята однією популяцією, якби він застосував традиційні методики взяття зразків із тканини листя. Навіть, якщо популяцію відбираються за однією алеллю, використовуючи очікуваний коефіцієнт розподілу популяції F2 1:2:1, селекціонер міг би оцінити 4 популяції на тій площі 21 поля, яку би він використав для однієї популяції при методі взяття зразків тканини. Ще однією потенційною перевагою сортування насіння є можливість його використання для пом'якшення ризиків, пов'язаних із вирощуванням рослин у деяких географічних областях, де рослини можуть рости погано, або на них можуть впливати несприятливі навколишні умови, або навіть можуть бути знищені підчас штормів. Наприклад, насіння з «кращім» генотипом або композицією маркера можна висаджувати в розташуванні 1, а насіння з «другим кращім» генотипом може бути висаджене в розташуванні 2. У цьому випадку розташування 2 може являти собою резерв на випадок, якщо якась проблема знищить рослини в першому розташуванні. Це дуже складно здійснити із традиційним способом узяття зразків тканин із пророщених рослин для встановлення генотипу, оскільки ці рослини потім буде потрібно викопати та перевезти до другого розташування. Використання способів за винаходом виключає проблему трансплантації. Способи моніторингу за винаходом можуть також використовуватися в програмі селекції для інтрогресії риси до рослини. Такі способи включають вилучення зразка, який містить клітини із ДНК, з насіння в популяції, скринінг ДНК, екстрагованої з кожного насіння, на присутність або відсутність щонайменше одного генетичного маркера, відбір насіння з популяції, грунтуючись на результатах скринінгу ДНК; культивування плодоносної рослини з насіння; та використання плодоносної рослини в якості жіночого предка або чоловічого предка при схрещуванні з іншою рослиною. Приклади скринінгу для відбору насіння для інтеграції риси включають, не обмежуючи, визначення повторень високо рекурентної батьківської алелі, відслідковування трансгенів, які є цікавими або скринінг відсутності небажаних трансгенів, відбір насіння для перевірки гібридності та зиготності. Визначення повторень високо рекурентної пари алелей за допомогою способів скринінгу за даним винаходом, знову ж таки, дозволяє зменшити кількість рядків на популяцію та збільшити кількість популяцій або інбредних ліній, які можна посадити на даній одиниці площі поля. Таким чином, способи скринінгу за даним винаходом можуть також ефективно зменшувати кількість ресурсів, необхідних для здійснення конверсії інбредних ліній. Способи за даним винаходом також передбачають гарантію якості (QA) та контроль якості за допомогою того, що регульовані або небажані трансгени визначаються та виключаються ще до посадки. Ця патентна заявка за своєю спроможністю до QA може ефективно виключати ненавмисний забруднення вихідної партії. Способи за даним винаходом можна також застосовувати для визначення гібридного насіння для трансгенного тестування. Наприклад, при конверсії інбридної лінії на стадії BCnFv селекціонер може ефективно створювати лот гібридного насіння (за виключенням гаметного відбору) який буде на 50% гемізиготним за потрібною рисою та на 91985 22 50% гомозиготний за його відсутністю, для того, щоби створити гібридне насіння для тестування. Селекціонер потім може скринінгувати все насіння Fi, отримане в результаті тестового схрещування, та визначити та відібрати ті насіння, які є гемізиготними. Такий спосіб має переваги в тому, що результати гібридних рис будуть являти собою комерційний гібридний генотип стосовно зиготності за рисою. Інші застосування способів скринінгу для ідентифікації та відслідковування потрібних рис мають ті самі переваги, що й зазначені вище, стосовно необхідних земельних та трудових ресурсів. Зазвичай, програми трансгенної конверсії виконуються на багатосезонних ділянках, що мають набагато більшу структуру видатків на землю та управління. Таким чином, або зменшення кількості рядків, потрібних на популяцію, або збільшення кількості популяцій у межах даного поля впливають на витрати істотно більше, аніж при звичайних способах. Також, способи скринінгу за даним винаходом можна використовувати для покращення ефективності програми подвійного гаплоїда за допомогою відбору бажаних генотипів на гаплоїдній стадії та визначення рівня плоїдності, щоби запобігти обробці та потраплянню на поле негаплоїдного насіння. Обидва застосування знову ж таки ведуть до зменшення кількості потрібних на популяцію земельних ресурсів та до здатності оцінити більшу кількість популяцій у межах даної одиниці площі поля. За іншим втіленням, винахід також передбачає аналіз для передбачення ембріозиготності за конкретним геном, який представляє інтерес (GOI). Аналіз передбачає ембріозиготність, ґрунтуючись співвідношенні відповідних кількостей копій GOI та гену внутрішнього контролю (1С) на клітину або на геном. Взагалі, цей аналіз використовує ген 1С, який має відому зиготність, наприклад, гомозиготний у локусі (дві копії 1С на дйплоїдну клітину), для нормування виміряння GOI. Співвідношення відповідної кількості копі 1С та GOI передбачає кількість копій GOI у клітині. У гомозиготній клітині для будь-якого даного гену (або унікальної послідовності генів) кількість копій гену дорівнює рівню плоїдності клітини завдяки тому, що послідовність присутня в одному локусі в усіх гомологічних хромосомах. Якщо клітини є гетерозиготною за конкретним геном, кількість копій гену буде меншою, ніж рівень плоїдності клітини. Зиготність клітини в будь-якому локусі можна, таким чином, визначити за кількістю копій гену в клітині. В окремому втіленні, винахід включає аналіз для передбачення ембріозиготності кукурудзи. У насіння кукурудзи тканина ендосперму є триплоїдною, тоді як зародкова тканина є диплоїдною. Ендосперм, який є гомозиготним за 1С, буде містити три копії 1С. Кількість копій GOI в ендоспермі може варіюватися від 0 (гомозиготний негатив) до 3 (гомозиготний позитив), а кількість копій GOI 1 або 2 можна знайти в насінні, гетерозиготному за GOI (або гемізиготному за GOI, якщо GOI являє собою трансген). Кількість копій в ендоспермі є відображенням зиготності зародка: гомозиготний (позити 23 вний або негативний) ендосперм супроводжує гомозиготний зародок, гетерозиготний ендосперм (коли кількість GOI дорівнює 1 або 2) свідчить про гетерозиготний (із кількістю копій GOI 1) зародок. Кількість копій GOI в ендоспермі (яка може варіюватися від 0 до 3 копій) можна визначити зі співвідношення кількості копій 1С в ендоспермі до кількості копій GOI в ендоспермі (воно може коливатися від 0/3 до З/З, тобто, від 0 до 1), що можна використовувати для передбачення зиготності зародка. Кількість копій GOI або СІ можна визначити за допомогою будь-якої зручної методики аналізу на підрахунок кількості копій, відомому спеціалістам у даній галузі. Приклади придатних аналізів включають, але не обмежуються ними, Real Time (TaqMan®) PCR (Applied Biosystems, Фостер Сіті, Каліфорнія) та Invader® (Third Wave Technologies, Медісон, Вісконсін). Бажано, такі аналізи проводять у такий спосіб, щоби ефективність ампліфікації в обох, 1С та GOI, послідовностях була рівною або дуже подібною. Наприклад, при аналізі Real Time TaqMan® PCR, сигнал з однієї копії GOI (клітина визначена як гетерозиготна за GOI) буде визначатися на один цикл ампліфікації пізніше, аніж сигнал з 1С, який має дві копії, завдяки тому, що кількість GOI вполовину менша за кількість 1С. Для того ж гетерозиготного зразка аналіз Invader® буде вимірювати коефіцієнт GOI/IC значенням приблизно 1:2 або 0,5. Для заїка, який є гомозиготним і за GOI, і за 1С, сигнал від GOI боже зареєстрований одночасно із сигналом від 1С (TaqMan®), а аналіз Invader виміряє коефіцієнт GOI/IC приблизно як 2:2 або 1. Ці принципи застосовні до будь-якої поліплоїдної клітини, або до гаплоїдних клітин (таких як клітини пилку), так як кількість GOI або 1С залишається пропорційною до кількості копій геному (рівня плоїдності) клітини. Таким чином, такі аналізи на зиготність можна проводити на триплоїдних клітинах, таких як ендосперм кукурудзи. Приклади Наступні приклади є, головним чином, ілюстративними, та жодним чином не обмежують даний винахід. Приклад 1 Цей приклад описує аналіз на передбачення зиготності зародка кукурудзи, використовуючи ген внутрішнього контролю (1С), гомозиготний у локусі (тобто, дві копії 1С в диплоїдному зародку та три копії 1С в триплоїдному ендоспермі). В інбредній лінії диплоїдного (або такого, що має більшу плоїдність) організму, такого як кукурудза, ендогенний внутрішній контроль зазвичай використовують 91985 24 гомозиготний; трансгенні події в таких організмах у першому поколінні (у кукурудзи позначається "R0") зазвичай гемізиготні (це означає, що трансген зазвичай присутній лише в одній із двох гомологічних хромосом). Кукурудза (Zea mays) є диплоїдним організмом, таким чином, при R0 події з «однією копією» на клітину приходиться одна копія GOI, але 0,5 копій на гаплоїдний геном, подія R0 з «двома копіями» має дві копії GOI на клітина, а на гаплоїдний геном це буде 1 копія, і так далі. У цьому прикладі, у якості гену 1С використовувався тубулін, a GOI являв собою трансген, який кодує неоміцин фосфотрансферазу II (NPT II), яка використовується при відборі на стійкість до канаміцину. Тканина ендосперму (триплоїдна) бралася з насіння (або за допомогою відбору зразка вручну, або зіскобом із насіння за допомогою автоматичного пробовідбірника за даним винаходом). Насіння, з якого був узятий зразок ендосперму пророщували, з успішно пророщених рослин також брали для генетичного аналізу зразок тканини листа (диплоїдної). Тканина листя прямо корелює з ембріозиготністю, і, таким чином, вона використовувалася для того, щоби продемонструвати, що зиготність ендосперму загалом передбачає зиготність зародка, та підтвердити висновки щодо гомозиготності, зроблені за ендоспермом. Усю геномну ДНК екстрагували із тканини ендосперму та із тканини листя, та підділи кількісному аналізу за допомогою аналізу Invader® з олігонуклеотидними зондами, специфічними для гену, який представляє цікавість, NPT II, або до гену внутрішнього контролю, тубуліну. Співвідношення GOI та 1С вимірювали, використовуючи традиційні методики молекулярної біології. Дивіться Таблицю 1. Підсумок результатів декількох експериментів показаний на Таблиці 2. Результати показали, що зиготність ендосперму загалом передбачала зиготність зародка (визначену за зиготністю листя) та була надійною при передбаченні гомозиготності для всього насіння, які пророщували. Більше того, аналіз зиготності ендосперму дав мало псевдо-негативних гомозиготних передбачень (особливо, коли тканину ендосперму отримували за допомогою автоматичного пробовідбірника). Ці результати показують, що для клітини з відомим рівнем плоїдності співвідношення кількості копій GOI та СІ показує зиготність такої клітини. Більше того, аналіз зиготності за даним винаходом може передбачити зиготність однієї тканини, основуючись на зиготності іншої, що означає, що аналіз може передбачити зиготність зародка, ґрунтуючись на зиготності ендосперму. 25 91985 26 Таблиця 1 Співвідношення в зразку, узятому автоматично 1,39 0,14 0,08 0,13 0,10 1,55 0,84 0,14 1,48 1,39 2,03 0,13 1,71 0,81 1,84 1,54 1,48 0,92 1,51 1,60 0,86 1,81 0,15 1,89 0,21 0,09 0,89 1,50 1,82 2,14 1,22 2,22 0,79 1,23 1,49 1,33 Зиготність у зразку, узятому Співвідношення в зраавтоматично зку, узятому вручну Гетерозиготна нег гомозиготна нег гомозиготна нег гомозиготна нег гомозиготна Гетерозиготна Гетерозиготна нег гомозиготна Гетерозиготна Гетерозиготна ПОЗ гомозиготна нег гомозиготнанеможл. висновок Гетерозиготна ПОЗ гомозиготна Гетерозиготна Гетерозиготна Гетерозиготна Гетерозиготна Гетерозиготна Гетерозиготна ПОЗ гомозиготна нег гомозиготна ПОЗ гомозиготна нег гомозиготна нег гомозиготна Гетерозиготна Гетерозиготна неможл. висновок ПОЗ гомозиготна Гетерозиготна ПОЗ гомозиготна Гетерозиготна Гетерозиготна Гетерозиготна Гетерозиготна 1,42 0,12 0,08 0,10 0,08 1,38 1,45 1,48 1,37 1,47 1,93 0,05 1,81 1,41 1,77 1,43 1,50 1,40 1,42 1,37 1,47 2,02 Мало ДНК 1,85 0,10 0,11 1,50 1,37 2,02 0,99 1,44 2,24 1,40 1,47 1,38 1,37 Зиготність у зразку, узятому вручну Гетерозиготна нег гомозиготна нег гомозиготна нег гомозиготна нег гомозиготна Гетерозиготна Гетерозиготна Гетерозиготна Гетерозиготна Гетерозиготна ПОЗ гомозиготна нег гомозиготна ПОЗ гомозиготна Гетерозиготна ПОЗ гомозиготна Гетерозиготна Гетерозиготна Гетерозиготна Гетерозиготна Гетерозиготна Гетерозиготна ПОЗ гомозиготна ПОЗ гомозиготна нег гомозиготна нег гомозиготна Гетерозиготна Гетерозиготна ПОЗ гомозиготна неможл. висновок Гетерозиготна ПОЗ гомозиготна Гетерозиготна Гетерозиготна Гетерозиготна Гетерозиготна Таблиця 2 Кількість підтвер- Кількість невірних Кількість гомозиготного Кількість передджених гомозиго- негативних гомозиСпосіб узяття зразку насіння, визначеного за бачених гомозитних передбачень готних передбачень з ендосперму допомогою аналізу ендо- готних рослин, які на основі аналізу на основі аналізу сперму не проросли листя ендосперму Вручну 8 з 36 0 8 (усі) 5(13,9%) Автоматизовано 6 з 24 1 5 0 Вручну 6 з 36 0 6 (усі) 2 (5,6%) Автоматизовано 6 з 24 1 5 0 Вручну 5 з 36 0 5 (усі) 7 (19,4%) Автоматизовано 7 з 24 2 5 0 Вручну 7 з 36 1 6 0 Автоматизовано 5 з 24 2 3 0 27 Приклад 2 Цей приклад демонструє використання способів скринінгу за даним винаходом у програмі відбору соєвих бобів щодо низького вмісту ліноленової кислоти за допомогою маркера. Соя є найбільш цінною сільськогосподарською рослиною родини Бобових, із багатьма харчовими та промисловими застосуваннями завдяки своєму унікальному хімічному складу. Насіння сої є важливим джерелом рослинної олії, яку використовують у харчових продуктах по всьому світові. Відносно високий уміст (зазвичай біля 8%) ліноленової кислоти (18:3) у соєвій олії погіршує її стабільність та смак. Для зниження рівня ліноленової кислоти (18:3) та покращення стабільності та смаку соєвих олій використовують гідрогенізацію соєвої олії. Однак, гідрогенізація призводить до отримання trans жирних кислот, що підвищує ризик сердечносудинного захворювання при її споживанні. Виведення сої з низьким умістом ліноленової кислоти ускладнювалося кількісною природою риси. Виведені різновиди сої з низьким умістом ліноленової кислоти давали поганий урожай, що обмежувало їхню корисність у більшості комерційних застосуваннях. Виведення продукту з комерційно істотним урожаєм насіння є високо пріоритетним у більшості програм із виведення культивару сої. Прикладом застосування способів скринінгу за даним винаходом є відбір рослин сої з високою врожайністю та зниженим умістом ліноленової кислоти. Потомство сої відносно низького вмісту ліноленової кислоти залежить, головним чином, від двох головних локусів кількісних рис (QTL) у Fad3-lb та Fad3-lc. Аналіз розподілення рослин показав, що Fad3-lb та Fad3-lc адитивно контролюють уміст ліноленової кислоти в сої. Таким чином, використовуючи комбінацію маркерів для Fad3-lb та Fad3-lc, селекціонер, використовуючи даний винахід, може точно передбачити вміст ліноленової кислоти в рослинах сої. Маркери можна використовувати для висновку щодо генотипного стану насіння на будь-якій стадії процесу селекції, наприклад, на стадії завершеної інбредної лінії, або на Fi, F2, F3, інш. Родючий гібрид Fi можна отримати, схрещуючи дві інбредні лінії сої (наприклад, схрещенням рослини, яка містить алелі Fad3-lb та/або Fad3-lc , які пов'язані зі зменшеним умістом ліноленової кислоти в порівнянні з рослиною, у якій цих алелей немає), за яким слідує природне самозапилення. Так як маркери можна використовувати для висновку щодо генетичного стану окремого насіння, отриманого від поєднання таких інбредних ліній, на ранніх поколіннях (тобто, F2) можна проводити селекцію за допомогою маркера. Насіння сої при кімнатній температурі та вологості зазвичай балансує на рівні 8% вологості відносно сухої маси. Насіння сої на такому рівні вологості має тенденцію до розщеплення при знятті стружки. Для того, щоби зменшити розколювання, насіння необхідно зволожувати до рівня вологості 12%. При підготовці насіння таким чином, розколювання істотно зменшується, до < 5%. 91985 28 Відібране насіння покоління F2, яке має бажаний генотип, може зберігатися вкупі, або втримуватися окремо, залежно від цілей розведення. Якщо з даної популяції були обрані декілька QTL із різними ефектами, селекціонер може зберегти ідентичність окремого насіння, для того, щоби розрізнити окремі особини з різними комбінаціями цільового стійкого QTL. Це насіння можна висаджувати на поле з відповідними позначеннями на полі. При транспортуванні насіння із пробовідбірної лабораторії до поля можна використовувати декілька способів збереження ідентифікації насіння. Способи включають перенесення відібрані насіння до садівничої стрічки для насіння, яка також може містити ідентифікацію частоти співвідношення для допомоги визначення насіння з окремим генотипом. Іншими способами будуть використання індексованого лотка, посадка насіння до брикетів торфу, а потім їхня пересадка, або посадка вручну з окремих пакетів із насінням. Приклад З Цей приклад демонструє використання способів скринінгу за даним винаходом у програмі на рекурентні батьківські алелі при селекційній програмі зворотного схрещування. Способи скринінгу за даним винаходом можна використовувати для відбору трансгенів, а також для ідентифікації рекурентних батьківських алелей. Ідентифікація генотипів із бажаними частотами рекурентної батьківської алелі до посадки дозволяє зменшити кількість рядків на популяцію на протязі всієї програми розведення, одночасно збільшуючи кількість популяцій, які включені в програму конверсії в межах даної одиниці площі поля. Це веде до поліпшування землекористування, зменшених витрат на землю та оплату праці, інш. Приклад скринінгу тканини ендосперму кукурудзи щодо рекурентних батьківських алелей у селекційній програмі зворотного схрещування показаний на Фіг. 29. Приклад 4 Цей приклад демонструє використання способів скринінгу за даним винаходом для використання при отриманні відбитків ланцюжка ДНК та визначенні фази зчеплення генів. У поєднанні зі збільшенням об'єму ДНК окремого насіння, отримання відбитків можна проводити без потреби взяття зразків на полі. Використовуючи тканину ендосперму (покриття насіння сої), отриману з диплоїдної рослини, можна визначати батьківські маркерні галотипи, використовуючи генотипну систему, яка дозволяє визначення різних частот алелей у зразках ДНК. Так як тканина ендосперму є триплоїдною, із двома копіями, отриманими з жіночої гамети, фаза зчеплення генів батьківської лінії може бути визначена за допомогою розсічення гетерозиготних генотипів нащадків. Зразок ДНК із тканини ендосперму дозволяє визначення рівня плоїдності генетичного маркера. Диплоїдний рівень плоїдності генетичного маркера позначає батьківську спадковість. 29 91985 30 31 91985 32 33 91985 34 35 91985 36 37 91985 38 39 91985 40 41 91985 42 43 91985 44 45 91985 46 47 91985 48 49 91985 50 51 91985 52 53 91985 54 55 91985 56 57 91985 58 59 91985 60