Ембріональні клітинні суспензії для лікування функціональних, запальних і/або онкологічних захворювань тонкої і товстої кишок

Нинішній винахід відноситься до області медицини, в частковості - до клітинної терапії і може знайти застосування для лікування функціональних, запальних і онкологічних захворювань кишечника в терапевтичній гастроентерології. Мільйони людей в світі страждають функціональними, запальними і онкологічними захворюваннями нижнього відділу харчового каналу: тонкої і товстої кишок. Кожний з нас хоч раз в житті переносив функціональні або запальні прояви поразки тонкої і товстої кишок. Ці захворювання різноманітні по етіологічним чинникам і механізмам розвитку. Ступінь тяжкості може бути значною і призводити до істотного погіршення загального стану. Ряд захворювань має хронічну течію і позбавляють пацієнтів повноцінного життя, дієздатності, є причиною перенесених тяжких хірургічних операцій, грізних ускладнень, що приводять до загибелі. Єдиних засобів лікування хвороб кишок не існує. В одних випадках необхідно виведення харчового каналу з під впливу етіологічного чинника. В інших - слідує домагатися відновлення функціональних характеристик і морфологічних стр уктур вже враженої кишки. Ми пропонуємо в якості винаходу лікарські препарати на основі ембріональних клітинних суспензій. Клітинна терапія - новий напрямок в медицині. Клітинна терапія - це лікування з допомогою клітин, коли живі клітини одного організму вводяться іншому організму (реципієнту), приживлюються в ньому, починають розмножуватися і виконувати потрібні для організму реципієнта функції. Цими клітинами не можуть бути клітини тварин - чужорідні живі об'єкти будуть виявлені і знищені імунною системою організму реципієнта. Вони можуть використовуватися тільки як джерела біологічних активних речовин. Це можуть бути клітини дорослої людини. Але бар'єр гистосумісності також залишає мізерні шанси на приживлення дорослих клітин і настає відторгнення чужих клітин. Найбільш перспективний шлях використання дуже молодих клітин людини, що майже позбавлені ознаків тканинної індивідуальності. Ці клітини не розпізнаються імунною системою реципієнта як чужі і можуть жити, розмножуватися і функціонувати в організмі реципієнта ("господаря"). Вони дуже молоді, повні життєвої енергії. Молоді клітини забезпечують підтримання або відновлення функцій і тканин організму реципієнта. Оздоровчі та лікувальні ефекти клітинної терапії по своїй глибині, якості і специфічності недосягненні жодними іншими сучасними засобами. Клініка клітинної терапії Національного медичного університету і Центру ембріональних тканин "ЕмСелл" є єдиною спеціалізованою клінікою такого роду. Клініка веде наукову роботу, розробляє, публікує і патентує в країні і за її межами. На базі Клініки в нинішній час минають навчання 5 аспірантів. Фахівці Клініки володіють найбільшим, що опублікувався в науковій літературі досвідом Клітинної терапії з застосуванням ембріональних клітинних суспензій, здатних вижити і дати потомство клітин в організмі реципієнта. В Клініку приїздять для лікування хворі із-за рубежу: Франції, Росії, США (Чикаго, Нью-Йорк, Малібу, Беверлі-хіллз і ін.), Монако, Швейцарії, Італії, Че хії, Греції, Ізраїлю. Пацієнтами Клініки є ряд великих вчених, бізнесменів, діячів культури. Але основна група - це тематичні хворі, що минають лікування в рамках планових наукових досліджень на базі нашої Клініки і базах 14 співпрацюючих з Клінікою великих наукових закладів Києва. Персонал Клініки клітинної терапії складається з 40 вчених, лікарів, інженерів, адміністраторів, фа хівців технічного і допоміжного складу. Клініка володіє банком криоконсервованих в рідкому азоті клітинних суспензій. Це дозволяє вибирати для трансплантації матеріал найбільш підхожий по багатьом критеріям в кожному конкретному випадку. Вибраний матеріал закріплюється за пацієнтом і використовується при повторних трансплантаціях у відповідності з планом лікування. Ідея клітинної терапії достатньо прозора і часто потрібно чути, що це або давно відомо, або вже давно пробували. Однак від ідеї до засобу - великий шлях. Ідея переливання крові, наприклад, існувала декілька тисячоліть раніше, але тільки в нашому сторіччі стала засобом лікування. Численні варіанти використання відповідного тваринного матеріалу, включаючи відому "швейцарську" клітинну терапію, не ставлять метою пересадити клітини і забезпечити їхнє розмноження і функціонування в організмі реципієнта, а використають можливості біологічних активних речовин, завдяки яким і забезпечуються оздоровчі ефекти, термін дії, механізми реалізації і можливості яких відповідно обмежені. Початок сучасного етапу Клітинної терапії відноситься до сімдесятих років, коли клітинну терапію стали вивчати як можливу альтернативу трансплантації костного мозку при захворюваннях крові, радіаційних поразках, природжених станах імунного дефіциту. Основні ефекти, що спостерігаються у пацієнтів в результаті клітинної терапії, зв'язані зі всіма рівнями організації і функціонування організму. Клітинні суспензії, приготовані з різноманітних ембріональних органів, використовуються з урахуванням ембріогенезу органів і тканин з зародкових листків. їхнє застосування з лікувальною метою визначається ведучими патофізиологічними механізмами захворювань. Досвід застосування клітинної терапії дозволив встановити досить чітко висловлену фазність розвитку ефектів клітинної терапії в часу. Ці фази яскраво висловлені і завжди відзначаються пацієнтами. Перша фаза - фаза первинної посттрансплантаційної реакції - розвивається в течію найближчих 4-8 годин після трансплантації і триває 2-5 днів. Це, як правило, дуже висловлена зміна стану, самопочуття, настрою, підйом душевних сил, висока психічна активність в поєднанні з руховою активністю, що в лаві випадків є потрясінням для хворого, що, наприклад, може встати з інвалідного крісла і ходити вперше за багато місяців. Друга фаза - власне клітинні ефекти трансплантації - стартує під час трансплантації, але досягає розвиненого рівня через 1-1.5 місяця. При цьому різні функції відновлюються з різноманітною швидкістю. В цей час ефекти лікування стають істотними. Наступна робота стовбурових клітин в організмі розвиває досягнутий успі х. Найбільш часто в нашій практиці присутність пересаджених клітин відзначається в термін 6-12 місяців. Клінічний ефект клітинної терапії зберігається довше. Потрібно мати на увазі, що більшість хвороб терапевтичного профілю принципово не виліковуються повністю і назавжди, вірніше казати не про вилікування, а про лікування, пом'якшення течії хвороб, збільшення тривалості і глибини ремісій. Застосування клітинних суспензій в багатьох випадках призводить не тільки до зменшення проявів захворювань, але і до їхнього зникнення. Серед ефектів клітинної терапії немає дій негативного спрямування, немає негативних побічних ефектів. Використовуючи клітинні суспензії, приготовані з трупних ембріональних тканин, можна досягнути станів, коли ембріональні клітини, введені в організм хворої людини можуть вижити, знайти свої органи-мішені, дати потомство, заповнивши таким чином що не вистачає функціональній одиниці органів і тканин. Ембріональні клітини часто здатні мігрувати, встановлювати міжклітинні зв'язки, пролиферировати, диференціюватися і відповідати на вплив. Вони здатні виробляти значні кількість біологічних активних речовин, наприклад, гемопоетичні чинники зростання, інтерлейкіни, чинник зростання нервів, аллогенні і нейротрофічні чинники і т. д. Ембріональні клітини викликають більш слабку імунну відповідь, ніж зрілі клітини. В лаві випадків це результат пізньої експресії головних антигенів в процесі їх дозрівання. Крім того, ембріональні клітинні суспензії містять в значно меншій кількості або проводять повну штучн у елімінацію високоактивних клітин, таких як лейкоцити, ендотелій судин, дендритичні клітини і т. інш. Особливістю фетальних клітин є також те, що в ранньому фе тальному періоді трансплантати не мають зрілих лімфоцитів, вони толерантні до тканин реципієнта. Ембріональні клітинні суспензії володіють більшою резистентністю, ніж зрілі клітини. Вони здатні виживати при більш низьких рівнях кисню. Не маючи довгих відростків і не володіючи сильною міжклітинною адгезією, вони менш піддаються травматичному пошкодженню під час всіх етапів приготування суспензій. І, нарешті, вони легше і простіше минають режими програмних кріозаморожувань і відтавання, зберігаючи за собою свої дивні властивості і менш зіпсувавсь, ніж зрілі клітини. В нинішній час застосовуються клітинні суспензії приготовані з ембріонального мозку, спин мозку, печінки, селезінки, тимусу, підшлункової залози, шкіряно-м’язового лоскута. Ембріональні клітинні суспензії містять також гемопоетичні чинники зростання, альфа-фетопротеїн, інтерлейкіни, чинник некрозу пухлин, чинник зростання нервів, ангиогенний чинник, нейротрофічний чинник, інсуліноподібні поліпептіди і та ін. Початок практичного застосування трупних ембріональних органів людини в лікувальній меті зв'язане зрозвитком напрямку Fetal liver transplantation. За останні роки, варіюючи різноманітними засобами приготування клітинних суспензій, а також різноманітними методами їхнього застосування, дослідникам вдалося досягнути позитивних результатів при лікуванні первинних і вторинних мієлодепресивних станів. Ці препарати, в частковості, описані в Izzi Т., Polehi О., et al, Fetal liver transplantation, Alan R. Liss, 1985, pp.237-249). Другим направленням клінічного застосування означених клітинних суспензій з'явилися порушення імунітету, тут найбільш значний досвід належить Touraine J. I (Trans-plantation Proceedings, 1993, ν.25, 1, pp.1012-1013). В прекрасній роботі Baechelta R, et al в І. Clin. Invest, 1993, ν.91, March, 1067-1078) показані віддалені результати лікування хворих з важким що комбінувалися імунним дефіцитом, коли не тільки відновлювалися показники імунітету у цих хворих, але показана наявність расщепленого химерізму і поява толерантності до антигенів як господаря, так і донору. Самий великий досвід, що опублікувався в області Fetal liver transplantation належить J.L.Touraine. Роботи J.L.Touraine добре відомі авторам винаходи. Разом з Тим, J.L.Touraine ніколи не розглядав лікування хвороб кишечнику. Крім того, заявники вважають, що їхній засіб має істотні відзнаки від того, що описане J.L.Touraine та ін. Важкі природжені імунодефіцити, лікуванням яких займається J.L.Touraine та ін. - це велика група спадкових захворювань, при яких є різноманітні природжені дефекти генетичного апарату стовбурових клітин гемопоезу, із-за чого порушуються окремі ланки кровотворення. Трансплантація здорового в генетичному відношенні pool of Stem Cells of Hemopoiesis дозволяє компенсувати природжений дефект. Специфіка цих захворювань вимагає якомога більш раннього втручання (аж до внутрішньоутробного періоду реципієнта), а також веде до загибелі реципієнта за відсутності приживлення трансплантатів. Як видно з цього зіставлення механізмів виникнення і розвитку захворювання, перед трансплантацією J.L.Touraine та ін. і вступом нашого лікарського препарату ставляться принципово різні мета в процесі досягнення лікувального ефекту. J.L.Touraine та ін. Описують використання для лікування трансплантологічного засобу Fetal liver transplantation. Матеріал для трансплантації брався безпосередньо від трупу плоду або декількох трупів. Єдиною характеристикою введеного матеріалу була кількість введених клітин. Жодні особливі характеристики вводимого матеріалу J.L.Touraine не використовувались, окрім визначення антигенів гистосумісництва. Ці параметри приводяться в публікаціях в порядку констатації, а не для рішення питання о здатності трансплантата для лікування. b. Ми використаємо (а) заздалегідь протестований лікарський препарат з (b) технологією, що регламентувала приготування, (с) лікувальні властивості якого можуть бути передречені, (d) інфекційна безпека застосування протестованого, (є) час застосування визначається показаннями лікаря, а не обставинами отримання матеріалу. Іншими словами, ми працюємо з лікарською речовиною з відомими характеристиками, без необхідності додатково досліджувати його прийнятність для реципієнта по HLA антигенам сумісництва і без сюрпризів інфікування при застосуванні ex tempore. При цьому ми вводимо пациенту живі клітини, що дадуть потомство, розмножуються, диференціюються і заповнюють втрачені або послаблені функції пациента. Це принципово новий клас лікарських препаратів, що дозволяє проводити [фармако] терапію з допомогою клітинних суспензій, що містить життєспроможний початок тих або інших функцій організму людини. В зв'язку з цим хочемо підкреслити, що характеристики лікарських речовин, наведені в заяві, не є специфічними характеристиками діючої речовини. Реальний опис і оцінка його поліпотентних властивостей і поліморфної організації, плюс їхня еволюція в організмі на шляхах специфічної диференціації в процесі розмноження і життя з урахуванням специфіки захворювання на сучасному етапі знань не представляються можливими, тим більш в кількісному вираженні. В формулі приводяться неспецифічні характеристики цілості, активності і життєздатності клітинних суспензій після виконання технологічних процедур, кріоконсервування і розморожування. В процесі лікування що заявляються лікарським препаратом, отриманим з ембріональної печінки і селезінки, як-бачимо, значний ефект зв'язаний з чинністю гемопоетичних стовбурових клітин. В статтях, що опублікувалися J.L.Touraine в 90-і роки він також став на позиції, що при лікуванні імунодефіцитів у дітей діючим агентом при Fetal liver transplantation є гемопоетичні стем селлс, хоча характеристики стем і прогеніторних клітин J.L.Touraine не призводить. Разом з тим, клітинні суспензії лікарських препаратів, що заявляються різноманітні по походженню, поліморфні по складу і поліфункціональні по ефектам своєї чинності. Крім того, в клітинній суспензії зберігається безклітинна рідина, що входить в склад ембріонального органу, і містить велику кількість біологічних активних речовин. Вона може впливати окрім відновлення гематологічних імунних порушень, також на обмін речовин, проникність бар'єрів, судин, володіти прямим протизапальним ефектом, викликати зростання судин, зміцнює бар'єрні утворення, виявляє вплив на зростання нервів, зменшувати явища дистрофії. Таким чином, ми використаємо клітинні суспензії з різноманітних ембріональних органів, їхня чинність має специфіку, зв'язану з походженням, поліфункціональність в межах окремих органів, містить неклітинні компоненти характерного оточення, різне спрямування еволюційної програми розвитку в організмі реципієнта. Таким чином ефекти, що заявляються клітинних суспензій не зводяться до чинності стем і прогенітор селлс. Крім того, позитивний ефект лікування імунодефіцитів у J.L.Touraine та ін. Визначається досягненням ефекту приживлення трансплантата. Відторгнення цього трансплантата веде до загибелі хворого. Ефекти, що досягаються при застосуванні наших препаратів, не зв'язані з приживленням клітин, а зв'язані з: тимчасовим заміщенням послаблених функцій за рахунок вводимих клітинних суспензій, заповненням ззовні ресурсів функцій, поповненням пула stem cells, нормалізацією метаболічних і трофічних процесів, нормалізацією параметрів гомеостазу, зниженням прояву ускладнень, оптимізацією психологічної і психофізіологічної сфери пацієнта. Таким чином, препарат, що заявляється лікарський, хоча і відбувається з ембріональних органів людини, минає таку біотехнологічну процедуру, що забезпечує його використання в режимі застосування лікарських речовин при збереженні життєздатності клітин, в тому числі стовбурових і прогеніторних. Стосуючись робіт авторів, працюючих в області Fetal liver transplantation, в частковості, Touraine J.L. та інших, необхідно помітити, що: Використання клітинних суспензій з ембріональної печінки відбувається по законам використання трансплантата Загальна кількість клітин є основною характеристикою матеріалу Суспензії часто готуються з органів декількох ембріонів. Трансплантація вимагає підбору матеріалу по системам антигенів гистосумісності Приготовані клітинні суспензії звичайно не відбирають по оптимальним характеристикам. Використання Fetal liver transplantation ex tempore не забезпечувало інфекційну безпеку лікування. Захворювання кишечнику, що підлягають лікуванню лікарськими препаратами на основі ембріональних клітинних суспензій. Функціональні захворювання I. Дискинезія 3 недостатнім спорожненням (запори) 3 прискореним спорожненням (неврогенна діарея) II. Ки шкова диспепсія (бродильна, гнильна, змішана) III. Алергічні поразки кишок. IV. Синдром подразливої кишки (слизиста колька, мембранозний коліт, секреторний невроз) Захворювання запального характеру Класифікація запального процесу в тонкій і товстій кишках по етіологічним чинникам 1. Інфекційний (постінфекційний) (специфічний, неспецифічний) 2. Паразитарний 3. Токсичний 4. Медикаментозний. 5. Алергічний. 6. Аутоімунний 7. Променевий. 8. Ме ханічний. 9. Генетична неповноцінність епітеліоцитів слизистой оболонки. 10. Генетична неповноцінність гладком'язових клітин. 11. Природжені ензимопатії 12. Вторинний. 13. Нез’ясованої етіології. Клінічні форми запального процесу в кишечникові Дуоденіт Первинний, Вторинний, Гострий, Хронічний Ентерит Первинний, Вторинний, Гострий, Хронічний Ентероколіт Первинний, Вторинний, Гострий, Хронічний Неспецифічний виразковий коліт Класифікація клінічних форм: Форма течії: Гостра (блискавична і гостра), Хронічна (рецидивна і безперервна) Розвиток захворювання: Інтермитуюче, Ремітуюче Тяжкість захворювання: Легка Середнєважка Важка Розповсюдженість поразки: Проктит Проктосигмоідіт Лівостороння Субтотальна Тотальна Активність запалення: Мінімальна Помірна Висловлена Наявність ускладнень: Місцеві Загальні Хвороба Крона Класифікація клінічних форм: Форма течії: Гостра Хронічна (рецидивна і безперервна) Тяжкість захворювання: Легка Середнєважка Важка Розповсюдженість поразки: Проктит Проктосигмоідіт Лівостороння Субтотальна Тотальна Термінальний ілеїт Активність запалення Мінімальна Помірна Висловлена Наявність ускладнень: Місцеві Загальні Ішемічний коліт Пухлини кишечнику Доброякісні Злоякісні Спайкова хвороба Лікарські препарати на основі ембріональних клітинних суспензій, засоби їхнього приготування і засоби лікування функціональних, запальних і онкологічних захворювань тонкої і товстої кишок з використанням цих препаратів. Заявляються вісім лікарських препаратів - являючі собою клітинні суспензії, приготовані на основі ембріональних органів людини: Препарат 1 - Гемопоетичні клітини ембріональної печінки людини (ГКЕПЛ) Препарат 2 Гемопоетичні клітини ембріональної селезінки людини (ГКЕСЛ) Препарат 3 - Стволові клітини гемопоезу ембріональної печінки людини (СКГЕПЛ) Препарат 4 - Стволові клітини гемопоезу ембріональної селезінки людини (СКГЕСЛ) Препарат 5 - Гепатоціти ембріональної печінки людини (ГЦЕПЛ) Препарат 6 - Тимоціти ембріонального тимусу людини (ТЦЕТЛ) Препарат 7 - Епителіоціти ембріонального первинного харчового каналу (ЕЦЕПХК) Препарат 8 - Нервові клітини ембріонального мозку людини (НКЕМЛ) Препарат 1 - Гемопоетичні клітини ембріональної печінки людини Приготування лікарського препарату Використають ембріони 5-14 тижнів гестації. Ембріони одержують при штучному перериванні вагітності у здорових, заздалегідь на наявність вірусних і гемічних інфекцій жінок, що обстежилися. В меті збереження цілісності ембріону аборт проводять вакуумекстракцією. Ембріони переносять в стерильні чашки Петрі, заповнені розчином Хенкса з доданням антибіотика аміногликозидного ряду (напр., гентаміцин в концентрації 160мг гентамицина на 1000мл розчину Хенксу). Приготування розчину Хенкса (Hanks, Wallace, 1949): Розчин Хенкса (Hanks, Wallace, 1949) використовувався в якості середи для приготування клітинних суспензій. Цей розчин є загальноприйнятим для приготування поживнихних середовищ. NaCl 8.0г Kcl 0.4г СаС12 0.14г МдСІ2 0.1г MgSO47H2O* 0.1г Na2HPO4 0.06г КН2РО4 0.06г NaHCO3 0.07г Глюкоза 1.00г Фенол (водорозчинна форма) 0.02г (води бідистильованої переграної в склі до 1л) Хлористий кальцій (СаСІ2) заздалегідь розчиняють в 30-50мл води і поволі додають до розчину інших солей. За наявності цієї солі з більшим змістом кристалізаційної води (Na2HP0412H2O*) її додають в кількості 2г. Отриманий розчин фільтрують через паперовий або ватно-марлевий фільтр. Після цього розчин розливають в скляний посуд, закривають ватно-марлевими пробками і стерилізують поточним паром при температурі 100 градусів Цельсія без тиску по 20 хвилин 3 дні підряд. Розчин при доданні індикатора фенолового червоного має червоно-рожевий колір. Для настанови рН в розчин Хенкса додають стерильний 1.41 розчин двовуглекислого натрію (NaHCO3). Розчин Хенкса при роботі з культурою тканин повинен мати рН 7.2-7.4. При доданні в клітинну суспензію після гомогенізації використовується розчин Хенкса, що не містить фенолового червоного. Зберігають розчин при 4-60С, але можна також і при кімнатній температурі. Термін придатності один місяць. Подальша робота проводиться в стерильних умовах боксу. Ембріони переносять в стерильні чашки Петрі, заповнені середою Хенкса з антибіотиками, де, обережно розчинивши черевну полость, витягають селезінку, з якої окремо готують клітинну суспензію. Кровотворний орган помішують в гомогенізатори, розрізають на невеликі фрагменти і здрібнюють до отримання однорідної маси. Клітини змивають зі стін і пестика гомогенізатора середою Хенкса в мірні пробірки, пропускаючи через фільтр для переливу препаратів крові, а після цього через голки діаметру, що зменшується. Порція приготованої таким чином суспензії переноситься в поліетиленовий циліндр і герметично закривається. Ця порція може бути використана для трансплантації нативної суспензії. Інші порції будуть піддані криоконсервації. Ембріональні клітинні суспензії розливаються в поліетиленові контейнери ємністю від 0.5 до 2.0мл (в залежності від подальшого призначення) Приготування і використання нативних клітинних суспензій. Нативні клітинні суспензії одержують після пропущення гомогената ембріональних тканин через фільтр для переливу препаратів крові і голки діаметру, що зменшується. Нативні клітинні суспензії застосовують по тим же показанням і з допомогою тих же засобів вступ у, що і кріоконсервовані клітинні суспензії. Нативні клітинні суспензії використовуються в течію 6-8 годин від моменту взяття матеріалу. Від моменту отримання і до моменту вступ у нативни х клітинних суспензій реципієнту вони зберігаються при температурі +5-7 градусів Цельсія. Стислі терміни від моменту приготування до моменту вступ у нативних клітинних суспензій зумовлюють особливості їх тестування, а саме редуційовану програму тестування у порівнянні з кріоконсервованими клітинними суспензіями. В нативних клітинних суспензіях виробляється підрахунок ядровмістних клітин в 1мл суспензії. Однак тестування нативних клітинних суспензій на КОЕ-ГМ ('colony-'forming units of the granulocyte/macrophage (CFU GM)"), KOE-EMM ('colony-' forming units of the granulocyte, erythrocyte, monocyte/macrophage, megakaryocyte (CFU GEMM)") і СД34 ("progenitor cells (CD34)") перед трансплантацією не проводиться. Програма вірусологічного і бактеріологічного контролю нативних клітинних суспензій також обмежена. Дослідження на бактеріальну стерильність проводиться, однак його результати стають відомі після трансплантації. Тому печінка в цьому випадку береться тільки з цілого ембріону зі розтинанням черевний порожнині в стерильних умовах. Такий матеріал вважається умовно бактеріологічно стерильним. Фетальна діагностика на наявність вич-інфекції, вірусного гепатиту В, і С, токсоплазмозу, цитомегаловірусної інфекції, вірусу краснухи і герпеса проводиться також ретроспективно. Тому нативні клітинні суспензії готуються тільки при повній пренатальній діагностиці донора, включаючої в себе дослідження крові донора на наявність сифілісу, віл-інфекції, вірусного гепатиту В, і С, токсоплазмозу, цитомегаловірусноі інфекції. При застосуванні нативних клітинних суспензій проводиться також дослідження крові реципієнта на наявність вірусних інфекцій: вірусного гепатиту В, і С, токсоплазмозу, цитомегаловірусноі інфекції, герпеса. Незважаючи на те, що з застосуванням нативних клітинних суспензій зв'язувалася надія отримання більш висловленого клінічного ефекту трансплантації, наш досвід використання нативних і кріокснсервованих клітинних суспензій дозволив прийти до укладення, що ефект застосування нативних клітинних суспензій не перевищує ефект кріоконсервованих клітинних суспензій. В нинішній час ми не схильні рекомендувати нативні клітинні суспензії для трансплантації і віддаємо перевагу кріоконсервованим клітинним суспензіям. Кріоконсервування клітинних суспензій. Після приготування клітинної суспензії, включаючи додання кріопротектора, отримані клітинні суспензії розливаються в поліетиленові контейнери які закручуються пробками ємністю 2мл. В кожний контейнер вміщується суспензія в кількості від 0.5 до 2мл. В якості кріопротектора використовується діметилсульфоксид (ДМСО, хімічно чистий). ДМСО є добре відомим кріопротектором. Перед використанням ДМСО пропускається через мілішпоровий фільтр (діаметр шпор 0.22mm). При легком змішуванні клітинної суспензії в неї перед криоконсевирвуванням додається по краплям рівній кількості КС обсяг свіжезробленого робітничого розчину ДМСО (1.4моль на літр). Підсумкова концентрація ДМСО в отриманої КС складає 3-10%. Відмивання препарату від ДМСО перед трансплантацією не вимагається. Його концентрація в контейнерах складає від 3 до 10%. При його розведенні в ізотонічному розчині хлористого натрію при вступі реципієнту вона відповідно падає в 50-100 разів і не є токсичною для організму. Більш того, ДМСО є провідником біологічних активних речовин через біологічні бар'єри і мембрани, сприяючи біологічному ефекту трансплантації. Для клітинній суспензії кожного ембріону обов'язково є 6 контрольних контейнерів наступного призначення: 1 контейнер, що містить 0.5мл клітинній суспензії, передвизначені для тестування функціональної спроможності КС після розморожування; З контейнера, що містять по 1.0-1.5мл клітинній суспензії, передвизначені для вірусологічного контролю цього ембріону. Клітинні суспензії для цих контейнерів готуються з шкіряно-м’язового лоскута цього ж ембріону також як клітинні суспензії з печінки. Один контейнер досліджується на наявність вірусних інфекцій в лабораторії установи-виготівника клітинній суспензії, другий контейнер передається для паралельного дослідження державної контролюючої лабораторії. Третій контейнер залишається в кріосховищі для постійного зберігання з метою підтвердження в подальшому безпеки матеріалу, включаючи вірусологічну і бактеріальну). Матеріал, в якому хоча б в 1 контейнері виявляються віруси, знищується разом зі всім матеріалом від цього ж ембріону шляхом зпалювання. 2 контейнера, що містять по 1.0-1.5мл змивної води з лабораторного посуду і інструментів, передвизначені для дослідження бактеріальної стерильності. 1-й контейнер досліджується в лабораторії установи-виготівника, 2-й в державній контрольній лабораторії. Всі контейнери, за винятком 2-х призначених для вірусологічного контролю і 2-х, призначених для бактеріологічного контролю, наражаються у програмному кріозаморожувачі до -196 градусів Цельсія. Контейнери приміщають до камери програмного заморожування вертикально. Заморожування проводять в 3 етапи: 1 - від температури приміщення до -4 градусів Цельсія зі швидкістю 1 градус Цельсія в хвилину; 2 – від -4 до -10 градусів - зі швидкістю 0.1 градус в хвилину; 3 – від -10 до -190 градусів - зі швидкістю 7 градусів в хвилину. Після цього контейнери переносять в біосейфи, де зберігають в рідкому азоті необмежений час до використання. Операції кріокорсервування і розморожування безумовно відбиваються на характеристиках матеріалу. Тому в засобі, що заявляється дослідження характеристик клітинних суспензій виробляється після виконання обох цих процедур, то є вже після розморожування раніше кріоконсервированного матеріалу. Таким чином забезпечується контроль результатів роботи відносно якості кріокорсервування і розморожування. Крім того, ми визнали доцільним використати один з відомих засобів кріоконсервування, що, певно, є одним з кращих по відношенню до нашого об'єкту, складається з трьох стадій заморожування (Федотенков А.Г., Шишкін І.Д., Данілова Л.А. та ін. Кріоконсервування костного мозку при низьких температурах для клінічної мети. Проблеми гематології 1966, т.10,12, стор.45-50). Разом з тим, спеціальні роботи, проведені для оцінки впливу кріоконсервування, свідчать "cryopreservation did not adversely change the population, viability or immunological capacity of human Fetal liver transplantation" (Ek S., Ringden 0., Markling L., Westgren M. Cryopreservation of fetal stem Cells. Bone Marrow transplantation, 11 Suppl, 1: 123, 1993). Розморожування клітинних суспензій. Розморожування клітинних суспензій виробляється безпосередньо перед їхнім застосуванням. Програма розморожування включає дві фази - швидку і повільну. Швидку фазу розморозки матеріал минає шляхом приміщення контейнера у водяну лазню з температурою 40гр Цельсія до появи рухомої центральної льдинки в контейнері. Далі слідує повільна фаза при звичайній кімнатній температурі, доки в контейнері витягнутому з води не зникне льдинка. При кімнатній температурі розморожена клітинна суспензія зберігатися до трансплантації не більш 2 годин. Тестування функціонального стану кріоконсервованих клітинних суспензій. Після приготування клітинної суспензії і її кріоконсервування контрольний контейнер, що містить 0.5мл клітинній суспензії, використовується для тестування функціонального стану матеріалу. Для цього він розморожується по програмі, по якій перед трансплантацією виробляється розморожування всіх інших контейнерів. В розмороженої порції клітинній суспензії узвичаєними засобами визначається: Загальна кількість ядровмістних клітин в 1мл (клітинним аналізатором або візуально під мікроскопом в рахувальній камері), 'Colony-'forming units of the granulocyte/macrophage (CFU GM)" used in international scientific publications; this·term means "an hematopoietic cell which is capable of producing a colony composed of granulocyte and macrophage progeny in semi-solid medium". КОЕ ГМ в 1мл (засобами клонування КОЕ в метилцелюлозі Hann V., Bodger M., Hoffbrand a. Development of pluripotent hematopoietic progenitor cells in the human fetus//Blood. 1983. - Vol.62. - N.4 - P.118-123.) 'Colony-'forming units of the granulocyte, erythrocyte, monocyte/macrophage, megakaryocyte (CFU GEMM)", meaning "a multipotential hematopoietic cell which is capable of producing a colony composed of granulocyte, erythrocyte, monocyte/macrophage, and megakaryocyte progeny in semi-solid medium". КОЕ ГЕММ в 1мл (тіж) (ibid). "contents of early precursors of hemopoiesis", the authors propose to replace it with a commonly used English term "progenitor cells (CD34)". СД34 в 1мл (indirect immunofluorescenct test with the panel of monoclonal antibodies). Саме на ці характеристики КС, отримані після розморожування, ми орієнтуємося при оцінці функціональної спроможності КС при виборі матеріалу для трансплантації. Ми не проводимо прижиттєве забарвлення мазків КС для визначення відсотка пошкодження клітин т. до. При відпрацьованої технології приготування клітинних суспензій ці характеристики мало корелюють з клінічним ефектом і не відповідають на питання про функціональну повноцінність КС. Тестування вірусної і бактеріальної стерильності. З контейнера, що містять по 1.0-1.5мл клітинній суспензії, передвизначені для вірусологічного контролю даного ембріону. Клітинні суспензії для цих контейнерів готується з шкіряно-м'язового лоскута цього же ембріону так же як клітинні суспензії з печінки. Один контейнер досліджується на наявність вірусних інфекцій в лабораторії установи-виготівника клітинній суспензії, другий контейнер передається для паралельного дослідження державної контролюючої лабораторії. Третій контейнер залишається в кріосховищі для постійного зберігання з метою підтвердження в подальшому безпеки матеріалу, включаючи вірусологічну і бактеріальну). Матеріал, в якому хоча б в 1 контейнері виявляються віруси, знищується разом зі всім матеріалом від цього же ембріону шля хом зпалювання. 2 контейнера, що містять по 1.0-1.5мл змивної води з лабораторного посуду і інструментів, передвизначені для дослідження бактеріальної стерильності. 1-й контейнер досліджується в лабораторії установи-виготівника, 2-й в державній контрольній лабораторії. Пренатальна діагностика донора ембріонального матеріалу включає дослідження на сифіліс, вілінфекцію, вірусні гепатити В, і С, токсоплазмоз, цитомегаловірус. Фетальна діагностика матеріалу включає віл-інфекцію, вірусні гепатити В, і С, токсоплазмоз, цитомегаловірус, вір уси рубелли, герпесу. Повторна діагностика донора на наявність віл-інфекції проводиться через 90-100 днів після аборту. Властивості лікарського препарату. 1. Відновлення показників імунітету: загальної кількості лімфоцитів, субпопуляцій лімфоцитів Т4. Т8, NK клітин, В-лімфоцитів, корекція їхнього співвідношення, зняття явищ імунологічної атаки, аутоімунної поразки, імунної агресії, феномену супрессії. 2. Формування противопухлинного імунітету. 3. Відновлення показників крові: відновлення кількості лейкоцитів, еритроцитів, тромбоцитів. 4. Поліпшення трофіки органів, поліпшення мікроциркуляції, досягнення повнокров'я стінки кишки. 5. Підсилення процесів регенерації, до швидкого заживления виразкових дефектів, що приводяться і закриття їх епітеліальним пластом. 6. Підсилення кишечного бар'єру, зменшення явищ кишкової інтоксикації, зменшення або зникнення пропасниці. 7. Поліпшення психоемоційного стану пациента, поява волі до видужання, нормалізація формули сна, поява апетиту, зростання обсягу р ухів. 8. Нормалізація функціональної активності кишки: при діареї, зменшення частоти стільця, при запорах поява регулярного стільця. 9. Обезболюючий ефект. 10. Запобігання розвитку сполучної тканини в результаті перитоніту і операційної травми. Терапевтичне використання препарату. Показання до застосування лікарського препарату. 1. Імунні і аутоімунні, алергічні поразки кишечнику. 2. Хвороби кишечнику, що супроводжуються глибокою лейкопенією, агранулоцитозом, анемією, тромбоцитопенією. 3. Кишковий синдром при цитостатичній хворобі, включаючи променеві поразки. 4. Ішемічні поразки кишечнику (ішемічний коліт). 5. Пухлини кишечнику до і після оперативного лікування, до і після курсів хіміо- і рентгенотерапії. 6. Атонія, гипокинезія, спастичні стани кишок. 7. Виразковий ерозивний процеси. 8. Розвиток сполучної тканини в стінці кишки. 9. Явища інтоксикації: слабість, пітливість, підвищення температури, порушення дієздатності, зниження ваги (кахексія). 10. Астено-невротичний синдром, депресивні стани. Шляхи введення до організму. Клітинні суспензії, приготовані з ембріональної печінки, найбільш часто вводяться внутрішньовенно хоча можливий шлях внутрішньочеревний, внутрішньокістковий. А саме: Лікарський препарат вводять внутрішньовенно крапельно в складі 100мл ізотонічного розчину хлористого натрію зі швидкістю 20-40 крапель в хвилину. Можливо внутрішньочеревний вступ (доцільно здебільшого в педіатричній практиці), коли клітинна суспензія розбавляється ізотонічним розчином хлористого натрію до обсягу 50мл і вводиться струйно внутрішньочеревно. За наявності у хворих свіжих тромбоутворень або гемоофтальмопатій (крововилив в тканини ока), а також при явищах гіперспленізму рекомендуємо клітинну суспензію вводити внутрикістково в грудину в обсязі до 50мл ізотонічного розчину хлористого натрію струйно. Обсяг вводимого препарату може бути від 0.5 до 8мл. При цьому число 2-х мілілітрових контейнерів, що використаються, в яких зберігається препарат, може бути від 1 до 4-5. Можливо спільне використання клітинних суспензій, що рекомендувалися для лікування захворювань, що заявляються кишечника, в будь-яких сполученнях. При сполученном використанні лікарських препаратів з різноманітних ембріональних органів більш прийнятним є використання препаратів, приготованих з одного і того ж ембріону. Вибір обсягу, що пропонується для вступ у клітинної суспензії. 5.0мл це максимальний обсяг клітинної суспензії, що може бути отриманий з вхідного матеріалу при означених кількісних характеристиках (п.1.); 0.5мл - це мінімальний обсяг, зручний для технічного обслуговування маніпуляцій, оскільки частина клітин завжди залишається у флаконі, в тр убках, в голках і та.ін. Тому контейнер повинен містити препарат в означених межах обсягу. Звичайно в течію одного лікувального сеансу вводять 0.5-2.0мл клітинної суспензії. Повторний вступ препарату. При повторному вступі препарату на наступних етапах лікування пациента більш прийнятним є використання клітинної суспензії з того-ж ембріону, що був використаний в перший раз. Саме для реалізації цієї особливості засобу приготована з ембріонального органу суспензія розливається в декілька контейнерів. Ембріональна суспензія закріплюється за конкретним пацієнтом і зберігається в кріобанкі для наступного використання у цього-ж пациента. Автори відносять до позитивних якостей засобу, що пропонується можливість досягнути повноцінного лікувального ефекту при застосуванні малих доз фетального матеріалу. Протипоказання до застосування. 1. Васкуліт в гострій фазі. Капіляріт, флебіт, артрит. Трансплантація можлива після активного лікування і досягнення ремісії через 2-3 місяця. 2. Гострий тромбоз. Лікування можливо через 3-6 місяців. 3. Гемофтальмопатія. Лікування можливо тільки через 2-3 місяця після розвитку гемофтальмопатії. 4. Різко виражена гіпертензія малого кола, зв'язана з васкулітом, тромбозом, долевою пневмонією, з розвитком гострого або підгострого cor pulmonale. 5. Мієлокарціноз. 6. Термінальні стадії захворювання (висловлена інтоксикація, глибокі розлади обміну речовин, важка загальна декомпенсація). 7. Наявність очагів хронічної інфекції. Необхідна їхня санація. Препарат 2 - Гемопоетичні клітини ембріональної селезінки людини. Приготування лікарського препарату. Використають ембріони 5-14 тижнів гестації. Ембріони одержують при штучному припиненні вагітності у здорових, заздалегідь на наявність вірусних і гемічних інфекцій жінок, що обстежилися. В меті збереження цілісності ембріону аборт проводять вакуумекстракцією. Ембріони переносять в стерильні чашки Петрі, заповнені розчином Хенкса з доданням антибіотику аміноглікозидного ряду (напр., гентаміцин в концентрації 160мг гентаміцина на 1000мл розчину Хенкса). Приготування розчину Хенкса (Hanks, Wallace, 1949): Розчин Хенкса (Hanks, Wallace, 1949) використовувався в якості середи для приготування клітинних суспензій. Цей розчин є загальноприйнятим для приготування поживних середовищ. NaCl 8.0г Kcl 0.4г СаСl2 0.14г МдСl2 0.1г MgSO47H2O* 0.1г Na2HPO4 0.06г КН2РО4 0.06г NaHCO3 0.07г Глюкоза 1.00г Фенол (водорозчинна форма) 0.02г (води бідистильованої перегнаної в склі до 1л) Хлорістий кальцій (СаСl2) заздалегідь розчиняють в 30-50 мл води і поволі додають до розчину інших солей. За наявності цієї солі з більшим змістом кристалізаційної води (Na2HPO412H2O*) її додають в кількості 2г. Отриманий розчин фільтрують через паперовий або ватно-марлевий фільтр. Після цього розчин розливають в скляний посуд, закривають ватно-марлевими пробками і стерилізують текучим паром при температурі 100 градусів Цельсія без тиску по 20 хвилин 3 дні підряд. Розчин при доданні індикатора фенолового червоного має червоно-рожевий колір. Для настанови рН в розчин Хенкса додають стерильний 1.4% розчин двовуглекислого натрію (NaHCO3). Розчин Хенкса при роботі з культурою тканин повинен мати рН 7.2-7.4. При доданні в клітинну суспензію після гомогенізації використовується розчин Хенкса, що не містить фенолового червоного. Зберігають розчин при 4-60С, але можна також і при кімнатній температурі. Термін придатності один місяць. Подальша робота проводиться в стерильних умовах боксу. Ембріони переносять в стерильні чашки Петрі, заповнені середою Хенкса з антибіотиками, де, обережно розчинивши черевну полость, витягають селезінку, з якої окремо готують клітинну суспензію. Кровотворний орган помішують в гомогенізатори, розрізають на невеликі фрагменти і подрібнюють до отримання однорідної маси. Клітини змивають зі стінок і пестика гомогенізатора середою Хенкса у мірні пробірки, пропускаючи через фільтр для переливання препаратів крові, а після цього через голки діаметру ,що зменшується. Порція приготованої таким чином суспензії переноситься в поліетиленовий циліндр і герметично закривається. Ця порція може бути використана для трансплантації нативної суспензії. Інші порції будуть піддані кріоконсервації. Ембріональні клітинні суспензії розливаються в поліетиленові контейнери ємністю від 0.5 до 2.0мл (в залежності від подальшого призначення). Приготування і використання нативних клітинних суспензій. Нативні клітинні суспензії одержують після пропущення гомогената ембріональних тканин через фільтр для переливу препаратів крові і голки діаметру, що зменшується. Нативні клітинні суспензії застосовують по тим же показанням і з допомогою тих же засобів введення, що і кріоконсервовані клітинні суспензії. Нативні клітинні суспензії використовуються в течію 6-8 годин від моменту взяття матеріалу. Від моменту отримання і до моменту вступу нативних клітинних суспензій реціпієнту вони зберігаються при температурі +5-7 градусів Цельсія. Стислі терміни від моменту приготування до моменту вступ у нативних клітинних суспензій зумовлюють особливості їх тестування, а саме редуційовану програму тестування у порівнянні з кріоконсервованими клітинними суспензіями. В нативних клітинних суспензіях виробляється підрахунок ядровміщуючи х клітин в 1мл суспензії. Однак тестування нативних клітинних суспензій на КОЕ-ГМ ('colony-'forming units of the granulocyte/macrophage (CFU GM)"), ΚΟΕ-ΓΜΜ ('colony-'forming units of the granulocyte, erythrocyte, monocyte/macrophage, megakaryocyte (CFU GEMM) ") і СД34 ("progenitor cells (CD34)") перед трансплантацією не проводиться. Програма вірусологічного і бактеріологічного контролю нативних клітинних суспензій також обмежена. Дослідження на бактеріальну стерильність проводиться, однак його результати стають відомі після трансплантації. Тому ембріональна селезінка в цьому випадку береться тільки з цілого ембріону зі розтинанням черевної порожнини в стерильних умовах. Такий матеріал вважається умовно бактеріологічно стерильним. Фетальна діагностика на наявність віл-інфекції, вірусного гепатіту В, і С, токсоплазмозу, цітомегаловірусної інфекції, вірусу краснухи і герпеса проводиться також ретроспективно. Тому нативні клітинні суспензії готуються тільки при повній пренатальній діагностиці донора, включаючої в себе дослідження крові донора на наявність сифілісу, віл-інфекції, вір усного гепатиту В, і С, токсоплазмоза, цітомегаловірусної інфекції. При застосуванні нативних клітинних суспензій проводиться також дослідження крові реципієнта на наявність вірусних інфекцій: вірусного гепатиту В, і С, токсоплазмозу, цітомегаловірусної інфекції, герпеса. Незважаючи на те, що з застосуванням нативних клітинних суспензій зв'язувалася надія отримання більш висловленого клінічного ефекту трансплантації, наш досвід використання нативних і кріоконсервованих клітинних суспензій дозволив прийти до укладення, що ефект застосування нативних клітинних суспензій не перевищує ефект кріоконсервованих клітинних суспензій. В нинішній час ми не схильні рекомендувати нативні клітинні суспензії для трансплантації і віддаємо перевагу кріоконсервованим клітинним суспензіям. Кріоконсервування клітинних суспензій. Після приготування клітинної суспензії, включаючи додання кріопротектора, отримані клітинні суспензії розливаються в поліетиленові контейнери які закручуються пробками ємністю 2мл. У кожний контейнер вміщується суспензія в кількості від 0.5 до 2мл. В якості кріопротектору використовується диметилсульфоксид (ДМСО, хімічно чистий). ДМСО є добре відомим кріопротектором. Перед використанням ДМСО пропускається через мілішпоровний фільтр (діаметр шпор 0.22mm) . При легком змішуванні клітинної суспензії в неї перед кріоконсервацією додається по краплинам рівної кількості КС обсяг свіжезробленого робітничого розчину ДМСО (1.4моль на літр). Підсумкова концентрація ДМСО в отриманої КС складає 3-10%. Відмиття препарату від ДМСО перед трансплантацією не вимагається. Його концентрація в контейнерах складає" від 3 до 10%. При його розведенні в ізотонічному розчині хлористого натрію при вступі реципієнту вона відповідно падає у 50-100 разів і не є токсичною для організму. Більш того, ДМСО є провідником біологічних активних речовин через біологічні бар'єри і мембрани, сприяючи біологічному ефекту трансплантації. Для клітинної суспензії кожного ембріону обов'язково є 6 контрольних контейнерів наступного призначення: 1 контейнер, що містить 0.5мл клітинній суспензії, передвизначений для тестування функціональної спроможності КС після розморожування; З контейнера, що містять по 1.0 - 1.5мл клітинній суспензії, передвизначені для вірусологічного контролю даного ембріону. Клітинні суспензії для цих контейнерів готуються з шкіряно-м'язового лоскута цього ж ембріону також як клітинні суспензії з печінки і селезінки. Один контейнер досліджується на наявність вірусних інфекцій в лабораторії установи-виготівника клітинній суспензії, другий контейнер передається для паралельного дослідження державної контролюючої лабораторії. Третій контейнер залишається в кріосховищі для постійного зберігання з метою підтвердження в подальшому безпеки матеріалу, включаючи вір усологічну і бактеріальну. Матеріал, в якому хоча б в 1 контейнері виявляються віруси, знищується разом зі всім матеріалом від цього же ембріону шля хом зпалювання. 2 контейнера, що містять по 1.0-1.5мл змивної води з лабораторного посуду і інструментів, передвизначені для дослідження бактеріальної стерильності. 1-й контейнер досліджується в лабораторії установи-виготівника, 2-й в державній контрольній лабораторії. Всі контейнери, за винятком 2-х призначених для вірусологічного контролю і 2-х, призначених для бактеріологічного контролю, наражаються на програмному кріозаморожувачі до -196 градусів Цельсія. Контейнери містять до камери програмного заморожування вертикально. Заморожування проводять в 3 етапи: 1 - від температури приміщення до -4 градусів Цельсія зі швидкістю 1 градус Цельсія в хвилину; 2 – від -4 до -10 градусів - зі швидкістю 0.1 градус в хвилину; 3 – від -10 до -190 градусів - зі швидкістю 7 градусів в хвилину. Після цього контейнери переносять в біосейфи, де зберігають в рідкому азоті необмежений час до використання. Операції кріоконсервування і розморожування безумовно відбиваються на характеристиках матеріалу. Тому в засобі, що заявляється дослідження характеристик клітинних суспензій виробляється після виконання обох цих процедур, то є вже після розморожування раніше кріоконсервованного матеріалу. Таким чином забезпечується контроль результатів роботи відносно якості кріоконсервування і розморожування. Крім того, ми визнали доцільним використати один з відомих засобів кріоконсервування, що, певно, є одним з кращих по відношенню к нашому об'єкту, складатися з трьох стадій заморожування (Федотенков А.Г., Шишкін І.Д., Данілова Л.А. та ін. Кріоконсервування костного мозку при низьких температурах для клінічної мети. Проблеми гематології 1966, т.10, 12, стор.45-50) . Разом з тим, спеціальні роботи, проведені для оцінки впливу кріоконсервування, свідчать "cryopreservation did not adversely change the population, viability or immunological capacity of human Fetal liver transplantation" (Ek S., Ringden 0., Markling L., Westgren M. Cryopreservation of fetal stem Cells. Bone Marrow transplantation, 11 Suppl, 1: 123, 1993). Розморожування клітинних суспензій. Розморожування клітинних суспензій виробляється безпосередньо перед їхнім застосуванням. Програма розморожування включає дві фази - швидку і повільну. Швидку фазу разморозки матеріал минає шляхом приміщення контейнера у водяну лазню з температурою 40гр Цельсія до появи рухомої центральної льдинки в контейнері. Далі слідує повільна фаза при звичайній кімнатній температурі, доки в контейнері витягнутому з води не зникне льдинка. При кімнатній температурі розморожена клітинна суспензія зберігається до трансплантації не більш 2 годин. Тестування функціонального стану кріоконсервованих клітинних суспензій. Після приготування клітинній суспензії і її кріоконсервування контрольний контейнер, що містить 0.5мл клітинній суспензії, використовується для тестування функціонального стану матеріалу. Для цього він розморожується по програмі, по якій перед трансплантацією виробляється розморожування всіх інших контейнерів. В розмороженої порції клітинної суспензії узвичаєними засобами визначається: Загальна кількість ядровмістних клітин в 1мл (клітинним аналізатором або візуально під мікроскопом в рахувальній камері), 'Colony-'forming units of the granulocyte/macrophage (CFU GM)" used in international scientific publications; this term means "an hematopoietic cell which is capable of producing a colony composed of granulocyte and macrophage progeny in semi-solid medium". КОЕ ГМ в 1мл (засобами клонування КОЕ в метилцелюлозі Hann V., Bodger M., Hoffbrand a. Development of pluripotent hematopoietic progenitor cells in the human fetus//Blood. - 1983. - Vol.62. N.4 - P.118-123.) 'Colony-'forming units of the granulocyte, erythrocyte, monocyte/macrophage, megakaryocyte (CFU GEMM)", meaning "a multipotential hematopoietic cell which is capable of producing a colony composed of granulocyte, erythrocyte, monocyte/raacrophage, and megakaryocyte progeny in semi-solid medium". КОЕ ГЕММ в 1мл (ті ж самі) (ibid). "contents of early precursors of hemopoiesis", the authors propose to replace it with a commonly used English term "progenitor cells (CD34)". СД34 в 1мл (indirect immunofluorescenct test with the panel of monoclonal antibodies). Саме на ці характеристики КС, отримані після розморожування, ми орієнтуємося при оцінці функціональної спроможності КС при виборі матеріалу для трансплантації. Ми не проводимо прижиттєву забарвлення мазков КС для визначення відсотка пошкодження клітин т. до. При відпрацьованої технології приготування клітинних суспензій ці характеристики мало корелюють з клінічним ефектом і не відповідають на питання про функціональну повноцінність КС. Тестування вірусної і бактеріальної стерильності. З контейнера, що містять по 1.0-1.5мл клітинній суспензії, передвизначені для вірусологічного контролю даного ембріону. Клітинні суспензії для цих контейнерів готуються з шкіряно-м'язового лоскута цього же ембріону так же як клітинні суспензії з печінки і селезінки. Один контейнер досліджується на наявність вірусних інфекцій в лабораторії установи-виготівника клітинній суспензії, другий контейнер передається для паралельного дослідження державної контролюючої лабораторії. Третій контейнер залишається в кріосховищі для постійного зберігання з метою підтвердження в подальшому безпеки матеріалу, включаючи вір усологічну і бактеріальну). Матеріал, в якому хоча б в 1 контейнері виявляються віруси, знищується разом зі всім матеріалом від цього же ембріону шля хом зпалювання. 2 контейнера, що містять по 1.0-1.5мл змивної води з лабораторного посуду і інструментів, передвизначені для дослідження бактеріальної стерильности. 1-й контейнер досліджується в лабораторії установи-виготівника, 2-й в державній контрольній лабораторії. Пренатальна діагностика донора ембріонального матеріалу включає дослідження на сифіліс, вілінфекцію, вірусні гепатити В, і С, токсоплазмоз, цитомегаловірус. Фетальна діагностика матеріалу включає віл-інфекцію, вірусні гепатити В, і С, токсоплазмоз, цитомегаловірус, вір уси рубелли, герпеса. Повторна діагностика донора на наявність віл-інфекцію проводиться через 90-100 днів після аборту. Властивості лікарського препарату. 1. Відновлення показників крові: відновлення кількості еритроцитів, тромбоцитів. 2. Поліпшення трофіки органів, поліпшення мікроциркуляції, досягнення повнокров'я стінки кишки. 3. Підсилення процесів регенерації, до швидкого заживления виразкових дефектів, що приводяться і закриття їх епітеліальним пластом. 4. Підсилення кишкового бар'єру, зменшення явищ кишечної інтоксикації. 5. Поліпшення психоемоційного стану пациента, поява волі до видужання, нормалізація формули сна, поява апетиту, зростання обсягу р ухів. 6. Нормалізація функціональної активності кишки: при діареї, зменшення частоти стільця, при запорах поява регулярного стільця. 7. Запобігання розвитку сполучної тканини в результаті перитоніту і операційної травми. Терапевтичне використання препарату. Показання до застосування лікарського препарату. 1. Хвороби кишечника, що супроводжуються анемією, тромбоцитопениєю. 2. Ішемічні поразки кишечника (ішемічний коліт) 3. Атонія, гипокинезія, спастичні стани кишок. 4. Виразкові і ерозивні процеси. 5. Явища інтоксикації: слабість, пітливість, порушення дієздатності, зниження ваги (кахексія). 6. Астено-невротичний синдром, депресивні стани. Шляхи введення до організму. Клітинні суспензії, приготовані з ембріональної селезінки, найбільш часто вводяться внутришньовенно, хоча можливий шлях внутрішньочеревний, внутришньокістковий. А саме: Лікарський препарат вводять внутришньовенно крапельно в складі 100 мл ізотонічного розчину хлористого натрію зі швидкістю 20-40 крапель у хвилину. Можливий внутрішньочеревний вступ (доцільно здебільшого в педіатричній практиці), коли клітинна суспензія розбавляється ізотонічним розчином хлористого натрію до обсягу 50мл і вводиться струйно внутрішньочеревно. За наявності у хворих свіжого тромбоутворення або гемоофтальмопатії (кровозливу в тканини ока), а також при явищах гіперспленізму рекомендуємо клітинну суспензію вводити внутрішньокістково в грудину в обсязі до 50мл ізотонічного розчину хлористого натрію струйно. Обсяг вводимого препарату може бути від 0.5 до 8мл. При цьому число 2-х мілілітрових контейнерів ,що використаються, в яких зберігається препарат, може бути від 1 до 4-5. Можливо спільне використання клітинних суспензій, для лікування захворювань кишечника ,що рекомендувалися. Вибір для введення обсягу клітинної суспензії/ що пропонується. 5.0мл це максимальний обсяг клітинній суспензії, що може бути отриманий з вхідного матеріалу при означених кількісних характеристиках. 0.5мл - це мінімальний обсяг, придатний для технічного обслуговування маніпуляцій трансплантації, оскільки частина клітин завжди залишається у флаконі, в трубках, в голках і та. ін. Тому контейнер завжди повинен містити препарат в означених межах обсягу. Як вказувалося вище, звичайно в течію одного лікувального сеансу вводять 0.5-2.0мл клітинній суспензії. Повторне введення препарату. При повторному введені препарату на наступних етапах лікування пациента більш прийнятним є використання клітинної суспензії з того же ембріону, що був використаний в перший раз. Саме для реалізації цієї особливості засобу приготована з ембріонального органу суспензія розливається в декілька контейнерів. Ембріональна суспензія закріплюється за конкретним пацієнтом і зберігається -в кріобанкі для наступного використання у цього же пациента. Автори відносять до позитивних якостей засобу ,що пропонується можливість досягнути повноцінного лікувального ефекту при застосуванні малих доз фетального матеріалу. Протипоказання до застосування. 1. Васкуліт в гострій фазі. Капілляріт, флебіт, артріт. Трансплантація можлива після активного лікування і досягнення ремісії через 2-3 місяця. 2. Гострий тромбоз. Лікування можливо через 3-6 місяці. 3. Гемофтальмопатія. Лікування можливо тільки через 2-3 місяця після гемофтальмопатії. 4. Різко виражена гіпертензія малого кола, зв'язана з васкулітом, тромбозом, долевою пневмонією з розвитком гострого або підгострого cor pulmonale. 5. Мієлокарціноз. 6. Термінальні стадії захворювання (висловлена інтоксикація, глибокі розлади обміну речовин, важка загальна декомпенсація). 7. Наявність очагів хронічної інфекції. Необхідна їхня санація. Препарат 3 - Стволові клітини гемопоезу ембріональної печінки людини. Приготування лікарського препарату. Ембріони одержують при штучному припиненні вагітності у здорових, заздалегідь на наявність вірусних і гемічних інфекцій жінок , що обстежилися. Використають ембріони терміном від 5-12 тижнів гестации. В меті збереження цілісності ембріону аборт проводять вакуумекстракцією. Ембріон переносять в стерільну судину зі середою МакКоя 5А і антибіотиками. Подальша робота проводиться в стерильних умовах боксу. Ембріони переносять в стерильні чашки Петрі, заповнені середою МакКоя 5А з антибіотиками, де, обережно розчинивши черевну полость, витягають печінку, з якої окремо готують клітинну суспензію. Кровотворний орган містять в гомогенізатори, розрізають на невеликі фрагменти і подрібнюють до отримання однорідної маси. Клітини змивають зі стінок і пестика гомогенізатора середою МакКоя 5А в мірні пробірки, пропускаючи через фільтр для переливу препаратів крові, а після цього через голки діаметру ,що зменшується. Клітинну суспензію переносять в стерильний мірний циліндр на 5мл. Зразок розводять середою МакКоя 5А як 1:1. Центрифугують біля 10 хвилин, приблизно 400хg (1500 оборотів у хв.), при температурі 40С. Переносять пипеткою надосадочну рідину в поліпропіленову пробірку на 10мл, де знаходиться 3мл FicollHypaque. Ретельно на вагах врівноважують порожньою пробіркою. Центрифугують 00хg (1500 оборотів у хв.) 30 хвилин, при температурі 40С. Обережно знімають супернатант і поміщають його в стерильну пробірку. Розбавляють середою МакКоя 5А 1:1. Знов центрифугують в течії 10хв., при 40С. Надосадочну рідина переносять в контейнер, знов розводять 1:1. Виробляють підрахунок клітин. Приготування середи МакКоя 5А. Готується наступним засобом: Одна упаковка середи МакКоя 5А NaНСО3, в кількості 2.2гр. Обсяг доводять до одного літру, використовуючи двічі дистильовану воду, рН до 7.0-7.1. Розчин середи стерилізують з використанням 0.2мкм фільтру. Для інкубіровання клітин в середу додають: На 1 літр середи. 8мл МЕМ основних амінокислот 4мл МЕМ неосновних амінокислот 10мл МЕМ натрій піруват 4мл МЕМ вітаміни 10мл Пеніцилін-стрептомицин 15мл Сірчано/аспарагіно/глютамінова суміш. Суміш серин/аспарагін/глютамін готується по наступній формулі: L-аспарагін - 800мг L-серин - 420мг L-глютамін - 2 00мг. Серин і аспарагін розчиняють в 450мг двічі дистильованої Н2О, обсяг доводять до 500мл і стерилізують через фільтр 0.2мкм. В цю стерильну суміш додають 200мг L-глютаміна і добре змішують. Зберігають при температурі-200С. Частина приготованої суспензії переносять в поліетиленовий контейнер і герметично закривають. Вона буде використана для трансплантації нативной клітинній суспензії. Інша частина підлягає кріоконсервуванню. Клітинні суспензії розливають в поліетиленові контейнери в залежності від подальших мети обсягом від 0.5 до 2мл. Приготування і використання нативних клітинних суспензій. Нативні клітинні суспензії одержують після пропущення гомогената ембріональних тканин через фільтр для переливу препаратів крові і голки діаметру , що зменшується. Нативні клітинні суспензії застосовують по тим же показанням і з допомогою тих же засобів вступ у, що і кріоконсервовані клітинні суспензії. Нативні клітинні суспензії використовуються в течію 6-8 годин від моменту взяття матеріалу. Від моменту отримання і до моменту вступ у нативни х клітинних суспензій реципієнту вони зберігаються при температурі +5-7 градусів Цельсія. Стислі терміни від моменту приготування до моменту вступ у нативних клітинних суспензій зумовлюють особливості їх тестування, а саме редуцированну програму тестування у порівнянні з кріоконсервованими клітинними суспензіями. В нативних клітинних суспензіях виробляється підрахунок ядровмістних клітин в 1мл суспензії. Однак тестування нативних клітинних суспензій на КОЕ-ГМ ('colony-1forming units of the granulocyte/macrophage (CFU GM) ), КОЕ-ГЕММ ('colony-' forming units of the granulocyte, erythrocyte, monocyte/macrophage, megakaryocyte (CFU GEMM)) і СД34 ("progenitor cells (CD34) ") перед трансплантацією не проводиться. Програма вірусологічного і бактеріологічного контролю нативних клітинних суспензій також обмежена. Дослідження на бактеріальну стерильность проводиться, однак його результати стають відомі після трансплантації. Тому ембріональний мозок в цьому випадку береться тільки з цілого ембріону зі розтинанням черепної порожнини в стерильних умовах. Такий матеріал вважається умовно бактеріологічно стерильним. Фетальна діагностика на наявність віл-інфекції, вірусного гепатиту В, і С, токсоплазмоза, цитомегаловірусної інфекції, вірусу краснухи і герпеса проводиться також ретроспективно. Тому нативні клітинні суспензії готуються тільки при повній пренатальній діагностиці донора, включаючої в себе дослідження крові донора на наявність сифілісу, віл-інфекції, вірусного гепатиту В, і С, токсоплазмозу, цитомегаловірусної інфекції. При застосуванні нативних клітинних суспензій проводиться також дослідження крові реципієнта на наявність вірусних інфекцій: вірусного гепатиту В, і С, токсоплазмозу, цитомегаловірусної інфекції, герпеса. Незважаючи на те, що з застосуванням нативних клітинних суспензій зв'язувалася надія на отримання більш висловленого клінічного ефекту трансплантації, наш досвід використання нативних і кріоконсервованих клітинних суспензій дозволив прийти до укладення, що ефект застосування нативних клітинних суспензіїй не перевищує ефект кріоконсервованих клітинних суспензій. В нинішній час ми не схильні рекомендувати нативні клітинні суспензії для трансплантації і віддаємо перевагу кріоконсервованим клітинним суспензіям. Кріоконсервування клітинних суспензій. Після приготування клітинної суспензії, включаючи додання кріопротектора, отримані клітинні суспензії розливаються в поліетиленові контейнери з закручивающимися пробками ємністю 2мл. В кожний контейнер міститься суспензія в кількості від 0.5 до 2мл. В якості кріопротектора використовується діметилсульфокис (ДМСО, хімічні чистий). ДМСО є добре відомим кріопротектором. Перед використанням ДМСО пропускається через мілішпоровий фільтр (діаметр шпор 0.22mm). При легком перемішуванні клітинної суспензії в неї перед кріоконсервуванням додається по краплям рівний кількості КС обсяг свіжезробленого робітничого розчину ДМСО (1.4моль на літр). Підсумкова концентрація ДМСО в отриманій КС складає 3-10%. Відмиття препарату від ДМСО перед трансплантацією не вимагається. Його концентрація в контейнерах складає від 3 до 10%. При його розведенні в ізотонічному розчині хлористого натрію при вступі реципієнту вона відповідно падає в 50-100 раз і не є токсичною для організму. Більш того, ДМСО є провідником біологічних активних речовин через біологічні бар'єри і мембрани, сприяючи біологічному ефекту трансплантації. Для клітинній суспензії кожного ембріону обов'язково є 6 контрольних контейнерів наступного призначення: 1 контейнер, що містить 0.5мл клітинній суспензії, передвизначений для тестування функціональної спроможності КС після розморожування; З контейнера, що містять по 1.0 - 1.5мл клітинній суспензії, передвизначені для вірусологічного контролю даного ембріону. Клітинні суспензії для цих контейнерів готується з шкіряно-м'язового лоскута цього же ембріону так же як клітинні суспензії з мозку. Один контейнер досліджується на наявність вірусних інфекцій в лабораторії установи-виготівника клітинній суспензії, другий контейнер передається для паралельного дослідження державної контролюючої лабораторії. Третій контейнер залишається в кріосховище для постійного зберігання з метою підтвердження в подальшому безпеки матеріалу, включаючи вірусологічну і бактеріальну. Ма теріал, в якому хоча б в 1 контейнері виявляються віруси, знищується разом зі всім матеріалом від цього ж ембріону шляхом зпалювання. 2 контейнера, що містять по 1.0-1.5мл змивної води з лабораторного посуду і інструментів, передвизначені для дослідження бактеріальної стерильності. 1-й контейнер досліджується в лабораторії установи-виготівника, 2-й в державній контрольній лабораторії. Всі контейнери, за винятком 2-х призначених для вірусологічного контролю і 2-х, призначених для бактеріологічного контролю, наражаються на програмному кріозаморожувачі до-196 градусів Цельсія. Контейнери містять в камеру програмного заморожувача вертикально. Заморожування проводять в 3 етапу: 1 - від температури приміщення до -4 градусів Цельсія зі швидкістю 1 градус Цельсія в хвилину; 2 – від -4 до -10 градусів - зі швидкістю 0.1 градус в хвилину; 3 – від -10 до -190 градусів - зі швидкістю 7 градусів в хвилину. Після цього контейнери переносять в біосейфи, де зберігають в рідкому азоті необмежений час до використання. Операції кріокорсервування і розморожування безумовно відбиваються на характеристиках матеріалу. Тому в засобі, що заявляється дослідження характеристик клітинних суспензій виробляється після виконання обох цих процедур, то є вже після розморожування раніше кріоконсервованого матеріалу. Таким чином забезпечується контроль результатів роботи відносно якості кріоконсервування і розморожування. Крім того, ми визнали доцільним використати один з відомих засобів кріоконсервування, що, певно, є одним з кращих по відношенню до нашого об'єкту, складеться з трьох стадій заморожування (Федотенков А.Г., Шишкін I.Д., Данілова Л.А. та ін. Кріоконсервування костного мозку при низьких температурах для клінічної мети. Проблеми гематології 1966, т.10, 12, стор.45-50). Разом з тим, спеціальні роботи, проведені для оцінки впливу кріоконсервування, свідчать "cryopreservation did not adversely change the population, viability or immunological capacity of human Fetal liver transplantation" (Ek S., Ringden 0., Markling L., Westgren M. Cryopreservation of fetal stem Cells. Bone Marrow transplantation, 11 Suppl, 1: 123, 1993). Розморожування клітинних суспензій. Розморожування клітинних суспензій виробляється безпосередньо перед їхнім застосуванням. Програма розморожування включає дві фази - швидку і повільну. Швидку фазу розморозки матеріал минає шляхом приміщення контейнера у водяну лазню з температурою 40гр. Цельсія до появи рухомої центральної льодинки в контейнері. Далі слідує повільна фаза при звичайній кімнатній температурі, доки в контейнері витягнутому з води не зникне льодинка. При кімнатній температурі розморожена клітинна суспензія зберігається до трансплантації не більш 2 годин. Тестування функціонального стану кріоконсервованих клітинних суспензій. Після приготування клітинної суспензії і її кріоконсервування контрольний контейнер, що містить 0.5мл клітинної суспензії, використовується для тестування функціонального стану матеріалу. Для цього він розморожується по програмі, по якій перед трансплантацією виробляється розморожування всіх інших контейнерів. В розмороженої порції клітинної, суспензії узвичаєними засобами визначається: Загальна кількість ядровмістних клітин в 1мл (клітинним аналізатором або візуально під мікроскопом в рахувальній камері), 'Colony-'forming units of the granulocyte/macrophage (CFU GM)" used in international scientific publications; this term means "an hematopoietic cell which is capable of producing a colony composed of granulocyte and macrophage progeny in semi-solid medium". КОЕ ГМ в 1мл (засобами клонування КОЕ в метилцелюлозі Hann V., Bodger M., Hoffbrand a. Development of pluripotent hematopoietic progenitor cells in the human fetus//Blood. - 1983. - Vol.62. N.4 - P.118-123.) 'Colony-'forming units of the granulocyte, erythrocyte, monocyte/macrophage, megakaryocyte (CFU GEMM)", meaning "a multipotential hematopoietic cell which is capable of producing a colony composed of granulocyte, erythrocyte, monocyte/macrophage, and megakaryocyte progeny in semi-solid medium". КОЕ ГЕММ в 1мл (тіж самі) (ibid). "contents of early precursors of hemopoiesis", the authors propose to replace it with a commonly used English term "progenitor cells (CD34)". СД34 в 1мл (indirect immunofluorescenct test with the panel of monoclonal antibodies). Саме на ці характеристики КС, отримані після розморожування, ми орієнтуємося при оцінці функціональної спроможності КС при виборі матеріалу для трансплантації. Ми не проводимо прижиттєву забарвлення мазков КС для визначення відсотка пошкодження клітин т. до. При відпрацьованої технології приготування клітинних суспензій ці характеристики мало корелюють з клінічним ефектом і не відповідають на питання про функціональну повноцінність КС. Тестування вірусної і бактеріальної стерильності. З контейнера, що містять по 1.0 - 1.5мл клітинній суспензії, передвизначені для вірусологічного контролю даного ембріону. Клітинні суспензії для цих контейнерів готується з шкіряно-м'язового лоскута цього же ембріону так же як клітинні суспензії з мозку. Один контейнер досліджується на наявність вірусних інфекцій в лабораторії установи-виготівника клітинній суспензії, другий контейнер передається для паралельного дослідження державної контролюючої лабораторії. Третій контейнер залишається в кріосховище для постійного зберігання з метою підтвердження в подальшому безпеці матеріалу, включаючи вірусологічну і бактеріальну). Матеріал, в якому хоча б в 1 контейнері виявляються віруси, знищується разом зі всім матеріалом від цього же ембріону шля хом зпалювання. 2 контейнера, що містять по 1.0-1.5мл змивної води з лабораторного посуду і інструментів, передвизначені для дослідження бактеріальної стерильности. 1-й контейнер досліджується в лабораторії установи-виготівника, 2-й в державній контрольній лабораторії. Пренатальна діагностика донора ембріонального матеріалу включає дослідження на сифіліс, вілінфекцію, вірусні гепатити В, і С, токсоплазмоз, цитомегаловирус. Фетальная діагностика матеріалу включає віл-інфекцію, вірусні гепатити В, і С, токсоплазмоз, цитомегаловірус, вір уси рубелли, герпеса. Повторна діагностика донора на наявність віл-інфекції проводиться через 90-100 днів після аборту. Властивості лікарського препарату. 1. Відновлення показників імунітету: загальної кількості лімфоцитів, субпопуляцій лімфоцитів Т4. Т8, NK клітин, В- лімфоцитів, корекція їхні співвідношення; 2. Зняття явищ иммунологической атаки, аутоиммунного поразки, иммунной агресії, феномену супресії. 3. Формування противопухлинного імунітету. 4. Відновлення показників крові: відновлення кількості лейкоцитів, еритроцитів, тромбоцитів. 5. Підсилення процесів регенерации, до швидкого заживлению язвенных дефектів, що приводяться і закриття їх епітеліальним пластом. 6. Підсилення кишечного бар'єру, зменшення явищ кишечной интоксикации, зменшення або зникнення пропасниці. 7. Запобігання розвитку сполучної тканини в результаті перитонита і операційної травми. Терапевтичне використання препарату. Показання до застосування лікарського препарату. 1. Імунні і аутоімунні, аллергические поразки кишечнику. 2. Хвороби кишечника, що супроводжуються глибокою лейкопенией, агранулоцитозом, анемією, тромбоцитопенієй. 3. Кишечний синдром при цитостатичній хворобі, включаючи променеві поразки. 4. Ішемічні поразки кишечника (ішемічний коліт). 5. Пухлини кишечнику до і після оперативного лікування, до і після курсів хіміо - і рентгенотерапії. 6. Виразкові і ерозивні процеси. 7. Розвиток сполучної тканини в стінці кишки. Шляхи введення до організму. Клітинні суспензії, приготовані з ембріонального мозку, найбільш часто вводяться внутрішньовенно, хоча можливий шлях внутрішньочеревний, внутрішньокістковий. А саме: Лікарський препарат вводять внутрішньовенно крапельно у складі 100мл ізотонічного розчину хлористого натрію зі швидкістю 20-40 капель в хвилину. Можливо внутрішньочеревно вступ (доцільно здебільшого в педіатричній практиці), коли клітинна суспензія розбавляється ізотонічним розчином хлористого натрію до обсягу 50мл і вводиться струйно внутрішньочеревно. За наявності у хворих свіжого тромбоутворювання або гемоофтальмопатії (крововиливу в тканини ока), а також при явищах гиперспленізму рекомендуємо клітинну суспензію вводити внутришньокістково в грудину в обсязі до 50мл ізотонічного розчину хлористого натрію струйно. Обсяг вводимого препарату може бути від 0.5 до 8мл. При цьому число 2-х мілілітрових контейнерів, що використаються, в яких зберігається препарат, може бути від 1 до 4-5. Можливо спільне використання клітинних суспензій, для лікування захворювань кишечника. Вибір для вступ у обсягу ,що пропонується клітинній суспензії. 5.0мл - це максимальний обсяг клітинної суспензії, що може бути отриманий з вхідного материла при означених кількісних характеристиках; 0.5мл - це мінімальний обсяг, придатний для технічного обслуговування манипуляции трансплантації, оскільки частина клітин завжди залишається в флаконі, в тр убках, в голках і т. ін. Тому контейнер завжди повинен містити препарат в означених межах обсягу. Як вказувалось вище, звичайно в течію одного лікувального сеансу вводять 0.5-2.0мл клітинній суспензії. Повторне введення препарату. При повторному введенні препарату на наступних етапах лікування пациента більш прийнятним є використання клітинній суспензії з того же ембріону, що був використаний в перший раз. Саме для реалізації цієї особливості засобу приготована з ембріонального органу суспензія розливається в декілька контейнерів. Ембріональна суспензія закріплюється за конкретним пацієнтом і зберігається в кріобанці для наступного використання у цього же пацієнта. Автори відносять до позитивних якостей засобу, що пропонується можливість досягнути повноцінного лікувального ефекту при застосуванні малих доз фетального матеріалу. Протипоказання до застосування. 1.Васкуліт в гострій фазі. Капілляріт, флебіт, артрит. Трансплантація можлива після активного лікування і досягнення ремісії через 2-3 місяця. 2. Гострий тромбоз. Лікування можливо через 3-6 місяці. 3. Гемофтальмопатія. Лікування можливо тільки через 2-3 місяця після розвитку гемофтальмопатії. 4. Різко виражена гипертензия малого кола, зв'язана з васкулитом, тромбозом, долевий пневмонией з розвитком гострого або підгострого cor pulmonale. 5. Мієлокарциноз. 6. Термінальні стадії захворювання (висловлена інтоксикація, глибокі розлади обміну речовин, важка загальна декомпенсація). 7. Наявність очагів хронічної інфекції. Необхідна їхня санація. Препарат 4 - Стволові клітини гемопоезу ембріональної селезінки людини. Приготування лікарського препарату. Ембріони одержують при штучному припиненні вагітності у здорових жінок, заздалегідь обстежених на наявність вірусних і гемических інфекцій. Використають ембріони терміном від 5-12 тижнів гестації. В меті збереження цілісності ембріону аборт проводять вакуумекстракції. Ембріон переносять в стерильну судин у зі середою МакКоя 5А і антибіотиками. Подальша робота проводиться в стерильних умовах боксу. Ембріони переносять в стерильні чашки Петрі, заповнені середою МакКоя 5А з антибіотиками, де, обережно розчинивши черевну полость, витягають селезенку, з якої окремо приготавливают клітинну суспензію. Кровотворний орган містять в гомогенізатори, розрізають на невеликі фрагменти і подрібнюють до отримання однорідної маси. Клітини змивають зі стінок і пестика гомогенізатора середою МакКоя 5А в мерные пробирки, пропускаючи через фільтр для переливу препаратів крові, а після цього через голки діаметру, що зменшується. Клітинну суспензію переносять в стерильный мерный циліндр на 5мл. Зразок розводять середою МакКоя 5А як 1:1. Центрифугують біля 10 хвилин, приблизно 400хg (1500 оборотів в хв.), при температурі 40°С. Переносять пипеткой надосадочну рідину в полипропиленовую пробирку на 10мл, де знаходиться 3мл Ficoll-Hypaque. Ретельно на вагах врівноважують порожній пробіркою. Центрифугир уют 400xg (1500 оборотів в мин.) ·30 хвилин, при температурі 40°С. Акуратно знімають супернатант і поміщають його в стерильну пробірку. Розбавляють середою МакКоя 5А 1:1. Знов центрифугируют в течії 10 хв., при 40°С. Надосадочну рідина переносять в контейнер, знов розводять 1:1. Виробляють підрахунок клітин. Приготування середи МакКоя 5А. Готується наступним засобом: Одна упаковка середи МакКоя 5А NaHCO3, в кількості 2.2гр. Обсяг доводять до одного літру, використовуючи двічі дистильовану воду, рН до 7.0-7.1. Розчин середи стерилізують з використанням 0.2мкм фільтру. Для інкубування клітин в середу додають: На 1 літр середи. 8мл МЕМ основних амінокислот 4мл МЕМ неосновних амінокислот 10мл МЕМ натрий пируват 4мл МЕМ вітаміни 10мл Пеніцилін-стрептоміцин 15мл Сірчано/аспарагино/глютамінова суміш. Суміш серин/аспарагин/глютамин готується по наступній формулі: L- аспарагін - 800мг L-серин - 420мг L-глютамін - 200мг. Серин і аспарагін розчиняють в 450мг двічі дистильовані Н2О, обсяг доводять до 500мл і стерилізують через фільтр 0.2мкм. В цю стерильну суміш додають 200мг L-глютаміна і добре змішують. Зберігають при температурі-200°С. Частина приготованої суспензії переносять в поліетиленовий контейнер і герметично закривають. Вона буде використана для трансплантації нативной клітинній суспензії. Інша частина підлягає кріоконсервуванню. Клітинні суспензії розливають в поліетиленові контейнери в залежності від подальших мети обсягом від 0.5 до 2мл. Приготування і використання нативних клітинних суспензій. Нативні клітинні суспензії одержують після пропущення гомогената ембріональних тканин через фільтр для переливу препаратів крові і голки діаметру ,що зменшується. Нативні клітинні суспензії застосовують по тим же показанням і з допомогою тих же засобів вступ у, що і кріоконсервовані клітинні суспензії. Нативні клітинні суспензії використовуються в течію 6-8 годин від моменту взяття матеріалу. Від моменту отримання і до моменту вступ у нативни х клітинних суспензій реципієнту вони храниться при температурі +5-7 градусів Цельсія. Стислі терміни від моменту приготування до моменту вступ у нативних клітинних суспензій зумовлюють особливості їх тестування, а саме редуційованну програму тестування у порівнянні з кріоконсервованими клітинними суспензіями. В нативних клітинних суспензіях виробляється підрахунок ядровмістних клітин в 1мл суспензії. Однак тестування нативних клітинних суспензій на КОЕ-ГМ ('colony-'forming units of the granulocyte/macrophage (CFU GM)), КОЕ-ГЕММ ('colony-'forming units of the granulocyte, erythrocyte, monocyte/macrophage, megakaryocyte (CFU GEMM)) і СД34 ("progenitor cells (CD34) ") перед трансплантацією не проводиться. Програма вірусологічного і бактеріологічного контролю нативних клітинних суспензій також обмежена. Дослідження на бактеріальну стерильность проводиться, однак його результати стають відомі післятрансплантації. Тому ембріональний мозок в цьому випадку береться тільки з цілого ембріону зі розтинанням черепної порожнини в стерильних умовах. Такий матеріал вважається умовно бактеріологічно стерильним. Фетальна діагностика на наявність віл-інфекції, вірусного гепатиту В, і С, токсоплазмозу, цитомегаловирусної інфекції, вірусу краснухи і герпеса проводиться також ретроспективно. Тому нативні клітинні суспензії готуються тільки при повній пренатальній діагностиці донора, включаючої в себе дослідження крові донора на наявність сифілісу, віл-інфекції, вірусного гепатиту В, і С, токсоплазмозу, цитомегаловірусної інфекції. При застосуванні нативних клітинних суспензій проводиться також дослідження крові реципієнта на наявність вірусних інфекцій: вірусного гепатиту В, і С, токсоплазмозу, цитомегаловірусної інфекції, герпеса. Незважаючи на те, що з застосуванням нативних клітинних суспензій зв'язувалася надія отримання більш вираженого клінічного ефекту трансплантації, наш досвід використання нативних і кріоконсервованих клітинних суспензій дозволив прийти до укладення, що ефект застосування нативних клітинних суспензій не перевищує ефект кріоконсервованих клітинних суспензій. В нинішній час ми не схильні рекомендувати нативні клітинні суспензії для трансплантації і віддаємо перевагу кріоконсервованим клітинним суспензіям. Кріоконсервування клітинних суспензій. Після приготування клітинних суспензії, включаючи додання кріопротектора, отримані клітинні суспензії розливаються в поліетиленові контейнери з закручивающимися пробками ємністю 2мл. В кожний контейнер міститься суспензія в кількості від 0.5 до 2мл. В якості кріопротектору використовується діметилсульфокис (ДМСО, хімічно чистий). ДМСО є добре відомим кріопротектором. Перед використанням ДМСО пропускається через миллипоровий фільтр (діаметр пор 0.22mm). При легкому перемішуванні клітинної суспензії в неї перед кріоконсервуванням додається по краплинам рівний кількості КС обсяг свіжезробленого робітничого розчину ДМСО (1.4моль на літр). Підсумкова концентрація ДМСО в отриманої КС складає 3-10%. Відмиття препарату від ДМСО перед трансплантацією не вимагається. Його концентрація в контейнерах складає від 3 до 10%. При його розведенні в изотоническом розчині хлористого натрію при вступі реципієнту вона відповідно падає в 50-100 раз і не є токсичною для організму. Більш того, ДМСО є провідником біологічних активних речовин через біологічні бар'єри і мембрани, сприяючи біологічному ефекту трансплантації. Для клітинній суспензії кожного ембріону обов'язково є б контрольних контейнерів наступного призначення: 1 контейнер, що містить 0.5мл клітинній суспензії, передвизначений для тестування функціональної спроможності КС після розморожування; З контейнера, що містять по 1.0 - 1.5мл клітинній суспензії, передвизначені для вірусологічного контролю даного ембріону. Клітинні суспензії для цих контейнерів готується з шкіряно-м'язового лоскута цього же ембріону так же як клітинні суспензії з мозку. Один контейнер досліджується на наявність вірусних інфекцій в лабораторії установи-виготівника клітинній суспензії, другий контейнер передається для паралельного дослідження державної контролюючої лабораторії. Третій контейнер залишається в кріосховищі для постійного зберігання з метою підтвердження в подальшому безпеки матеріалу, включаючи вірусологічну і бактеріальну. Ма теріал, в якому хоча б в 1 контейнері виявляються віруси, знищується разом зі всім матеріалом від цього же ембріону шля хом зпалювання. 2 контейнера, що містять по 1.0-1.5мл змивної води з лабораторного посуду і інструментів, передвизначені для дослідження бактеріальної стерильности. 1-й контейнер досліджується в лабораторії установи-виготівника, 2-й в державній контрольній лабораторії. Всі контейнери, за винятком 2-х призначених для вірусологічного контролю і 2-х, призначених для бактеріологічного контролю, наражаються на програмний кріозаморожуванню до-196 градусів Цельсія. Контейнери помещают в камеру програмного заморожувателя вертикально. Замораживание проводять в 3 етапу: 1 - від температури приміщення до -4 градусів Цельсія зі швидкістю 1 градус Цельсія в хвилину; 2 – від -4 до -10 градусів - зі швидкістю 0.1 градус в хвилину; 3 – від -10 до -190 градусів - зі швидкістю 7 градусів в хвилину. Після цього контейнери переносять в біосейфи, де зберігають в рідкому азоті необмежений час до використання. Операції криіконсервування і розморожування безумовно відбиваються на характеристиках матеріалу. Тому в засобі ,що заявляється дослідження характеристик клітинних суспензій виробляється після виконання обох цих процедур, те є вже після розморожування раніше кріоконсервованого матеріалу. Таким чином забезпечується контроль результатів роботи відносно якості кріоконсервування і розморожування. Крім того, ми визнали доцільним використати один з відомих засобів кріоконсервування, що, певно, є одним з кращих по відношенню з нашому об'єкту, складатися з трьох стадій замораживания (Федотенков А.Г., Шишкин І.Д., Данилова Л.А. та ін. Кріоконсервування костного мозку при низьких температурах для клінічної мети. Проблеми гематології 1966, т.10, 12, стор.45-50). Разом з тим, спеціальні роботи, проведені для оцінки впливу кріоконсервування, свідчать "cryopreservation did not adversely change the population, viability or immunological capacity of human Fetal liver transplantation" (Ek S., Ringden 0., Markling L., Westgren M. Cryopreservation of fetal stem Cells. Bone Marrow transplantation, 11 Suppl, 1: 123, 1993). Розморожування клітинних суспензій. Розморожування клітинних суспензій виробляється безпосередньо перед їхнім застосуванням. Програма розморожування включає дві фази - швидку і повільну. Швидку фазу розморозки матеріал минає шляхом приміщення контейнера в водяну лазню з температурою 40гр. Цельсія до появи рухомої центральної льодинки в контейнері. Далі слідує повільна фаза при звичайній кімнатній температурі, доки в контейнері витягнутому з води не зникне льодинка. При кімнатній температурі розморожена клітинна суспензія зберігатися до трансплантації не більш 2 годин. Тестування функціонального стану кріоконсервованих клітинних суспензій. Після приготування клітинній суспензії і її кріоконсервування контрольний контейнер, що містить 0.5мл клітинній суспензії, використовується для тестування функціонального стану матеріалу. Для цього він розморожується по програмі, по якій перед трансплантацією виробляється розморожування всіх інших контейнерів. В розмороженої порції клітинної суспензії узвичаєними засобами визначається: Загальна кількість ядровмістних клітин в 1мл (клітинним аналізатором або візуально під мікроскопом в рахувальній камері), 'Colony-'forming units of the granulocyte/macrophage (CFU GM)" used in international scientific publications; this term means "an hematopoietic cell which is capable of producing a colony composed of granulocyte and macrophage progeny in semi-solid medium". КОЕ ГМ в 1мл (засобами клонування КОЕ в метилцеллюлозе Hann V., Bodger M., Hoffbrand a. Development of pluripotent hematopoietic progenitor cells in the human fetus//Blood. - 1983. Vol.62. - N.4 - P.118-123.) 'Colony-'forming units of the granulocyte, erythrocyte, monocyte/macrophage, megakaryocyte (CFU GEMM)", meaning "a multipotential hematopoietic cell which is capable of producing a colony composed of granulocyte, erythrocyte, monocyte/macrophage, and megakaryocyte progeny in semi-solid medium". КОЕ ГЕММ в 1мл (засобами клонування КОЕ в метилцеллюлозе Hann V., Bodger M., Hoffbrand a. Development of pluripotent hematopoietic progenitor cells in the human fetus//Blood. - 1983. - Vol.62. - N.A - P.118-123.)(теж саме) (ibid). "contents of early precursors of hemopoiesis", the authors propose to replace it with a commonly used English term "progenitor cells (CD34)". СД34 в 1мл (indirect immunofluorescenct test with the panel of monoclonal antibodies). Саме на ці характеристики КС, отримані після розморожування, ми орієнтуємося при оцінці функціональної спроможності КС при виборі матеріалу для трансплантації. Ми не проводимо прижиттєве забарвлення мазков КС для визначення відсотка пошкодження клітин т. до. При відпрацьованої технології приготування клітинних суспензій ці характеристики мало корелюють з кліничним ефектом і не відповідають на питання про функціональну повноцінність КС. Тестування вірусної і бактеріальної стерильности. З контейнера, що містять по 1.0-1.5мл клітинній суспензії, передвизначені для вірусологічного контролю даного ембріону. Клітинні суспензії для цих контейнерів готується з шкіряно-м'язового лоскута цього же ембріону так же як клітинні суспензії з мозку. Один контейнер досліджується на наявність вірусних інфекцій в лабораторії установи-виготівника клітинній суспензії, другий контейнер передається для паралельного дослідження державної контролюючої лабораторії. Третій контейнер залишається в кріосховищі для постійного зберігання з метою підтвердження в подальшому безпеки матеріалу, включаючи вірусологічну і бактеріальну. Матеріал, в якому хоча б в 1 контейнері виявляються віруси, знищується разом зі всім матеріалом від цього же ембріону шля хом зпалювання. 2 контейнера, що містять по 1.0-1.5мл змивної води з лабораторного посуду і інструментів, передвизначені для дослідження бактеріальної стерильности. 1-й контейнер досліджується в лабораторії установи-виготівника, 2-й в державній контрольній лабораторії. Пренатальна діагностика донора ембріонального матеріалу включає дослідження на сифіліс, ВІЛінфекцію, вірусні гепатити В, і С, токсоплазмоз, цитомегаловирус. Фетальна діагностика матеріалу включає віл-інфекцію, вірусні гепатити В, і С, токсоплазмоз, цитомегаловірус, вір уси рубелли, герпеса. Повторна діагностика донора на наявність віл-інфекції проводиться через 90-100 днів після аборту. Властивості лікарського препарату. 1. Відновлення показників імунітету: загальної кількості лімфоцитів, субпопуляцій лімфоцитів Т4. Т8, NK клітин, В-лімфоцитів, корегування їх співвідношення. 2. Зняття явищ імунологічної атаки, аутоімунної поразки, імунної агресії, феномену супрессії. 3. Формування противоопухолевого імунітету. 4. Відновлення показників крові: відновлення кількості лейкоцитів, еритроцитів, тромбоцитів. 5. Підсилення процесів регенерации, до швидкого заживлению язвенных дефектів ,що приводяться і закриття їх епітеліальним пластом. 6. Підсилення кишечного бар'єру, зменшення явищ кишечної інтоксикації, зменшення або зникнення пропасниці. 7. Запобігання розвитку сполучної тканини в результаті перитонита і операційної травми. Терапевтичне використання препарату. Показання до застосування лікарського препарату. 1. Імунні і аутоімунні, алергічні поразки кишечника. 2. Хвороби кишечника, що супроводжуються глибокою лейкопенией, агранулоцитозом, анемією, тромбоцитопенією. 3. Кишечний синдром при цитостатичній хворобі, включаючи променеві поразки. 4. Ішемічні поразки кишечника (ішемічний коліт) 5. Пухлини кишечника до і після оперативного лікування, до і після курсів хіміо - і рентгенотерапії. 6. Виразковий і ерозивний процеси. 7. Розвиток сполучної тканини в стінці кишки. 8. Лікарський препарат 4 може використовуватися для продовження лікування, початого препаратом 3, враховуючи близькість їхніх властивостей. Шляхи введення до організму. Клітинні суспензії, приготовані з ембріонального мозку, найбільш часто вводяться внутришньовенно, хоча можливий шлях внутрішньочеревний, внутрішньокістковий. А саме: Лікарський препарат вводять внутришньовенно крапельно в складі 100мл ізотонічного розчину хлористого натрію зі швидкістю 20-40 краплин в хвилину. Можливо внутрішньочеревне введення (доцільно здебільшого в педіатричній практиці), коли клітинна суспензія розбавляється ізотонічним розчином хлористого натрію до обсягу 50мл і вводиться струйно внутрішньочеревно. За наявності у хворих свіжого тромбоутворення або гемоофтальмопатії (крововиливу в тканини ока), а також при явищах гиперспленизма рекомендуємо клітинну суспензію вводити внутрикістно в грудину в обсязі до 50мл ізотонічного розчину хлористого натрію струйно. Обсяг вводимого препарату може бути від 0.5 до 8мл. При цьому число 2-х мілілітрових контейнерів, що використаються, в яких зберігається препарат, може бути від 1 до 4-5. Можливо спільне використання клітинних суспензій, для лікування захворювань кишечника. Вибір для введення обсягу, що пропонується клітинної суспензії. 5.0мл це максимальний обсяг клітинній суспензії, що може бути отриманий з вхідного материла при означених кількісних характеристиках; 0.5мл - це мінімальний обсяг, придатний для технічного обслуговування маніпуляцій трансплантації, оскільки частина клітин завжди залишається в флаконі, в трубках, в голках і т. ін. Тому контейнер завжди повинен містити препарат в означених межах обсягу. Як вказувалося вище, звичайно в течію одного лікувального сеансу вводять 0.5-2.0мл клітинній суспензії. Повторне введення препарату. При повторному введенні препарату на наступних етапах лікування пациента більш прийнятним є використання клітинній суспензії з того же ембріону, що був використаний в перший раз. Саме для реалізації цієї особливості засобу приготована з ембріонального органу суспензія розливається в декілька контейнерів. Ембріональна суспензія закріплюється за конкретним пацієнтом і зберігається в кріобанці для наступного використання у цього же пацієнта. Автори відносять до позитивних якостей засобу, що пропонується, можливість досягнути повноцінного лікувального ефекту при застосуванні малих доз фетального матеріалу. Протипоказання до застосування. 1. Васкуліт в гострій фазі. Капиллярит, флебит, артрит. Трансплантація можлива після активного лікування і досягнення ремісії через 2-3 місяця. 2. Гострий тромбоз. Лікування можливо через 3-6 місяці. 3. Гемофтальмопатія. Лікування можливо тільки через 2-3 місяця після розвитку гемофтальмопатії. 4. Різко виражена гіпертензія малого кола, зв'язана з васкулітом, тромбозом, долевою пневмонією з розвитком гострого або підгострого cor pulmonale. 5. Мієлокарциноз. 6. Термінальні стадії захворювання (висловлена інтоксикація, глибокі розлади обміну речовин, важка загальна декомпенсація). 7. Наявність очагів хронічної інфекції. Необхідна їхня санація. Препарат 5 - Гелатоцити ембріональної печінки людини. Приготування лікарського препарату. Ембріони одержують при штучному припиненні вагітності у здорових жінок, що заздалегідь обстежилися на наявність вірусних і гемических інфекцій. Використають ембріони терміном від 5-14 тижнів гестації. В меті збереження цілісності ембріону аборт проводять вакуумекстракцієй. Ембріон переносять в стерильну судин у зі середою МакКоя 5А і антибіотиками. Подальша робота проводиться в стерильних умовах боксу. Ембріони переносять в стерильні чашки Петрі, заповнені середою МакКоя 5А з антибіотиками, де, обережно розчинивши черевну порожнину, ви тягають печінка, з якої окремо готують клітинні суспензії. Печінку містять в гомогенізатор, розрізають на невеликі фрагменти і подрібнюють до отримання однорідної маси. Клітини змивають зі стінок і пестика гомогенізатора середою МакКоя 5А в мірні пробірки, пропускаючи через фільтр для переливу препаратів крові, а після цього через голки діаметру, що зменшується. Клітинну суспензію переносять в стерильний мірний циліндр на 5мл. Зразок розводять середою МакКоя 5А як 1:1. Центрифугують біля 10 хвилин, приблизно 400хg (1500 оборотів в хв.), при температурі 40°С. Надосадочна рідина використовується далі для виділення стовбурови х клітин гемопоезу. Ембріональні гепатоцити знаходяться в осадкі. Після акуратного зняття надосадочной рідини, до осадку додають 5мл середи МакКоя 5А. Збовтують. Центрифугують 10 хвилин, 4 00 хg, при температурі 40°С. Зливають надосадочную рідину. До осадку додають середу, складатися з наступних компонентів: RPMI 1640 Глютамін (2Mm) Пеніцилін-стрептоміцин (10мл на літр при 1000ед. На мл) 10% ембріональної бичачої сироватки (інактивованої підігрівом). Осадок переносять в пластикові пробірки величиною від 2 до 10мл і містять в інкубатор з атмосферою 5% СО2, звичайним 02 на 3-5 днів, при температурі 400С. Через 5 днів центрифугують 10хв., при 500хg; надосадочну рідина удаляють. Осадок розбавляють середою МакКоя 5А - 3мл. Підраховують кількість клітин і розводять середою МакКоя так, щоб концентрація клітин в пробірці була х106/мл. В якості кріопротектора використають діметилсульфокис (ДМСО, хімічні чистий). Перед використанням ДМСО пропускають через мілішпоровий фільтр (з діаметром пор 0.22мкм.). При легкому перемішуванні клітинної суспензії додають по краплинам рівний обсяг робітничого розчину ДМСО, досягаючи концентрації в більш прийнятному варіанті 5%. Клітинні суспензії розливають в поліетиленові контейнери, в залежності від подальших мети обсягом, від 2.0 до 10.0мл. Приготування і використання нативних клітинних суспензій. Нативні клітинні суспензії одержують після пропущення гомогената ембріональних тканин через фільтр для переливу препаратів крові і голки діаметру ,що зменшується. Нативні клітинні суспензії застосовують по тим же показанням і з допомогою тих же засобів вступ у, що і кріоконсервовані клітинні суспензії. Нативні клітинні суспензії використовуються в течію 6-8 годин від моменту взяття матеріалу. Від моменту отримання і до моменту вступ у нативни х клітинних суспензій реципієнту вони зберігаються при температурі +5-7 градусів Цельсія. Стислі терміни від моменту приготування до моменту вступ у нативних клітинних суспензій зумовлюють особливості їх тестування, а саме редуційовану програму тестування у порівнянні з кріоконсервованими клітинними суспензіями. В нативних клітинних суспензіях виробляється підрахунок ядровмістних клітин в 1мл суспензії. Перевіряють їх життєздатність приготуванням мазка і забарвленням трипановою синькою. Програма вірусологічного і бактеріологічного контролю нативних клітинних суспензій обмежена. Дослідження на бактеріальну стерильність проводиться, однак його результати стають відомі після трансплантації. Тому ембріональна печінка в цьому випадку береться тільки з цілого ембріону зі розтинанням черевній порожнині в стерильних умовах. Такий матеріал вважається умовно бактеріологічно стерильним. Фетальная діагностика на наявність віл-інфекції, вірусного гепатиту В, і С, токсоплазмозу, цитомегаловірусної інфекції, вірусу краснухи і герпеса проводиться також ретроспективно. Тому нативні клітинні суспензії готуються тільки при повній пренатальної діагностиці донора, включаючої в себе дослідження крові донора на наявність сифілісу, віл-інфекції, вірусного гепатиту В, і С, токсоплазмозу, цитомегаловірусної інфекції. При застосуванні нативних клітинних суспензій проводиться також дослідження крові реципієнта на наявність вірусних інфекцій: вірусного гепатиту В, і С, токсоплазмозу, цитомегаловірусної інфекції, герпеса. Незважаючи на те, що з застосуванням нативних клітинних суспензій зв'язувалася надія отримання більш висловленого клінічного ефекту трансплантації, наш досвід використання нативних і кріоконсервованих клітинних суспензій дозволив прийти до укладення, що ефект застосування нативних клітинних суспензій не перевищує ефект кріоконсервованих клітинних суспензій. В нинішній час ми не схильні рекомендувати нативні клітинні суспензії для трансплантації і віддаємо перевагу кріоконсервованим клітинним суспензіям. Кріоконсервування клітинних суспензій. Після приготування клітинній суспензії, включаючи додання кріопротектора, отримані клітинні суспензії розливаються в поліетиленові контейнери з закручуючимися пробками ємністю 2мл. В кожний контейнер міститься суспензія в кількості від 0.5 до 2мл. В якості кріопротектора використовується диметилсульфокис (ДМСО, хімічно чистий). ДМСО є добре відомим кріопротектором. Перед використанням ДМСО пропускається через мілішпоровий фільтр (діаметр пор 0.22mm). При легкому змішуванні клітинній суспензії в неї перед кріоконсервуванням додається по краплинам рівної кількості КС обсяг свіжезробленого робітничого розчину ДМСО (1.4моль на літр). Підсумкова концентрація ДМСО в отриманої КС складає 3-10%. Відмиття препарату від ДМСО перед трансплантацією не вимагається. Його концентрація в контейнерах складає від 3 до 10%. При його розведенні в изотоническом розчині хлористого натрію при вступі реципієнту вона відповідно падає в 50-100 раз і не є токсичною для організму. Більш того, ДМСО є провідником біологічних активних речовин через біологічні бар'єри і мембрани, сприяючи біологічному ефекту трансплантації. Для клітинній суспензії кожного ембріону обов'язково є 6 контрольних контейнерів наступного призначення: 1 контейнер, що містить 0.5мл клітинній суспензії, передвизначений для тестування функціональної спроможності КС після розморожування; З контейнера, що містять по 1.0-1.5мл клітинній суспензії, передвизначені для вірусологічного контролю даного ембріону. Клітинні суспензії для цих контейнерів готується з шкіряно-м'язового лоскута цього же ембріону так же як клітинні суспензії з мозку. Один контейнер досліджується на наявність вірусних інфекцій в лабораторії установи-виготівника клітинній суспензії, другий контейнер передається для паралельного дослідження державної контролюючої лабораторії. Третій контейнер залишається в кріосховище для постійного зберігання з метою підтвердження в подальшому безпеці матеріалу, включаючи вірусологічну і бактеріальну). Матеріал, в якому хоча б в 1 контейнері виявляються віруси, знищується разом зі всім матеріалом від цього же ембріону шля хом зпалювання. 2 контейнера, що містять по 1.0-1.5мл змивної води з лабораторного посуду і інструментів, передвизначені для дослідження бактеріальної стерильності. 1-й контейнер досліджується в лабораторії установи-виготівника, 2-й в державній контрольній лабораторії. Всі контейнери, за винятком 2-х призначених для вірусологічного контролю і 2-х, призначених для бактеріологічного контролю, наражаються на програмному кріозаморожувачі до -196 градусів Цельсія. Контейнери містять в камеру програмного заморожувача вертикально. Заморожування проводять в 3 етапу: 1 - від температури приміщення до -4 градусів Цельсія зі швидкістю 1 градус Цельсія в хвилину; 2 – від -4 до -10 градусів - зі швидкістю 0.1 градус в хвилину; 3 – від -10 до -190 градусів - зі швидкістю 7 градусів в хвилину. Після цього контейнери переносять в биосейфи, де зберігають в рідкому азоті необмежений час до використання. Операції кріоконсервування і розморожування безумовно відбиваються на характеристиках матеріалу. Тому в засобі, що заявляється дослідження характеристик клітинних суспензій виробляється після виконання обох цих процедур, те є вже після розморожування раніше кріоконсервованого матеріалу. Таким чином забезпечується контроль результатів роботи відносно якості кріоконсервування і розморожування. Крім того, ми визнали доцільним використати один з відомих засобів кріоконсервування, що, певно, є одним з кращих по відношенню з нашому об'єкту, складатися з трьох стадій заморожування (Федотенков А.Г., Шишкін І.Д., Данілова Л.А. та ін. Кріоконсервування кісткового мозку при низьких температурах для клінічної мети. Проблеми гематології 1966, т.10, 12, стор.45-50). Разом з тим, спеціальні роботи, проведені для оцінки впливу кріоконсервування, свідчать "cryopreservation did not adversely change the population, viability or iinmunological capacity of human Fetal liver transplantation" (Ek S., Ringden 0., Markling L., Westgren M. Cryopreservation of fetal stem Cells. Bone Marrow transplantation, 11 Suppl, 1: 123, 1993). Розморожування клітинних суспензій. Розморожування клітинних суспензій виробляється безпосередньо перед їхнім застосуванням. Програма розморожування включає дві фази - швидку і повільну. Швидку фазу розморозки матеріал минає шляхом приміщення контейнера в водяну лазню з температурою 40гр. Цельсія до появи рухомої центральної льодинки в контейнері. Далі слідує повільна фаза при звичайній кімнатній температурі, доки в контейнері витягнутому з води не зникне льодинка. При кімнатній температурі розморожена клітинна суспензія зберігатися до трансплантації не більш 2 годин. Тестування функціонального стану кріоконсервованих клітинних суспензій. Після приготування клітинній суспензії і її кріоконсервування контрольний контейнер, що містить 0.5мл клітинній суспензії, використовується для тестування функціонального стану матеріалу. Для цього він розморожується по програмі, по якій перед трансплантацією виробляється розморожування всіх інших контейнерів. В розмороженої порції клітинній суспензії узвичаєними засобами визначається: Загальна кількість ядровмістних клітин в 1мл (клітинним аналізатором або візуально під мікроскопом в рахувальній камері). Перевіряють їх життєздатність приготуванням мазка і забарвленням трипановою синькою. Тестування вірусної і бактеріальної стерильності. З контейнера, що містять по 1.0-1.5мл клітинній суспензії, передвизначені для вірусологічного контролю даного ембріону. Клітинні суспензії для цих контейнерів готується з шкіряно-м'язового лоскута цього же ембріону так же як клітинні суспензії з мозку. Один контейнер досліджується на наявність вірусних інфекцій в лабораторії установи-виготівника клітинній суспензії, другий контейнер передається для паралельного дослідження державної контролюючої лабораторії. Третій контейнер залишається в кріосховищі для постійного зберігання з метою підтвердження в подальшому безпеки матеріалу, включаючи вірусологічну і бактеріальну. Матеріал, в якому хоча б в 1 контейнері виявляються віруси, знищується разом зі всім матеріалом від цього же ембріону шля хом зпалювання. 2 контейнера, що містять по 1.0-1.5мл змивної води з лабораторного посуду і інструментів, передвизначені для дослідження бактеріальної стерильності. 1-й контейнер досліджується в лабораторії установи-виготівника, 2-й в державній контрольній лабораторії. Пренатальна діагностика донора ембріонального матеріалу включає дослідження на сифіліс, вілінфекцію, вірусні гепатити В, і С, токсоплазмоз, цитомегаловірус. Фетальная діагностика матеріалу включає віл-інфекцію, вірусні гепатити В, і С, токсоплазмоз, цитомегаловірус, вір уси рубелли, герпеса. Повторна діагностика донора на наявність віл-інфекції проводиться після 90-100 днів після аборту. Властивості лікарського препарату. 1. Відновлення показників крові: відновлення кількості лейкоцитів, еритроцитів, тромбоцитів. 2. Поліпшення трофіки органів, поліпшення мікроциркуляції, досягнення повнокров’я стінки кишки. 3. Підсилення процесів регенерації, до швидкого загоєння виразкових дефектів, що приводяться і закриття їх епітеліальним пластом. 4. Підсилення кишечного бар'єру, зменшення явищ кишечної інтоксикації, зменшення або зникнення пропасниці. Терапевтичне використання препарату. Показання до застосування лікарського препарату. 1. Хвороби кишечника, що супроводжуються глибокою лейкопенією, агранулоцитозом, анемією, тромбоцитопенієй. 2. Кишковий синдром при цитостатичній хворобі, включаючи променеві поразки. 3. Виразковий і ерозивний процеси. 4. Явища інтоксикації: слабість, пітливість, підвищення температури, порушення дієздатності, зниження ваги (кахексія). Шляхи введення до організму. Клітинні суспензії, приготовані з печінки, найбільш часто вводяться внутрішньовенно, хоча можливий шлях підшкіряний, підкапсульний і внутрішньопорожнинний. Лікарський препарат вводять внутришньовенно крапельно в складі 100мл ізотонічного розчину хлористого натрію зі швидкістю 20-40 краплин в хвилину. Можливо спільне використання клітинних суспензій, для лікування захворювань, що рекомендувалися кишечника. Вибір для введення обсягу клітинної суспензії. 5.0мл це максимальний обсяг клітинної суспензії, що може бути отриманий з вхідного матеріалу при означених кількісних характеристиках; 0.5 мл - це мінімальний обсяг, придатний для технічного обслуговування маніпуляцій трансплантації, оскільки частина клітин завжди залишається в флаконі, в тр убках, в голках і та. ін. Тому контейнер завжди повинен містити препарат в означених межах обсягу. Як вказувалося вище, звичайно в течію одного лікувального сеансу вводять 0.5-2.0мл клітинній суспензії. Повторне введення препарату. При повторному введенні препарату на наступних етапах лікування пацієнта більш прийнятним є використання клітинній суспензії з того же ембріону, що був використаний в перший раз. Саме для реалізації цієї особливості засобу приготована з ембріонального органу суспензія розливається в декілька контейнерів. Ембріональна суспензія закріплюється за конкретним пацієнтом і зберігається в кріобанці для наступного використання у цього же пацієнта. Автори відносять до позитивних якостей засобу, що пропонується можливість досягнути повноцінного лікувального ефекту при застосуванні малих доз фетального матеріалу. Протипоказання до застосування. 1. Васкуліт в гострій фазі. Капіляріт, флебіт, артрит. Трансплантація можлива після активного лікування і досягнення ремісії через 2-3 місяця. 2. Гострий тромбоз. Лікування можливо через 3-6 місяці. 3. Гемофтальмопатія. Лікування можливо тільки через 2-3 місяця після розвитку гемофтальмопатії. 4. Різко виражена гіпертензія малого кола, зв'язана з васкулітом, тромбозом, долевою пневмонією з розвитком гострого або підгострого cor pulmonale. 5. Мієлокарциноз. 6. Термінальні стадії захворювання (висловлена інтоксикація, глибокі розлади обміну речовин, важка загальна декомпенсація). 7. Наявність очагів хронічної інфекції. Необхідна їх санація. Препарат 6 - Тимоціти ембріонального тимуса людини. Приготування лікарського препарату. Використають ембріони 7-12 тижнів гестації. Ембріони одержують при штучному припиненні вагітності у здорових жінок, заздалегідь обстежених на наявність вірусних і гемических інфекцій. В меті збереження цілісності ембріону аборт проводять вакуумекстракцією. Ембріони переносять в стерильні чашки Петрі, заповнені розчином Хенкса з доданням антибіотика аминогликозидного ряду (напр., гентамицин в концентрації 160мг гентамицина на 1000мл розчину Хенкса). Приготування розчину Хенкса (Hanks, Wallace, 1949): Розчин Хенкса (Hanks, Wallace, 1949) використовувався в якості середи для приготування клітинних суспензій. Цей розчин є загальноприйнятим для приготування живильних середовищ. NaCl 8.0г Kcl 0.4г СаСl2 0.14г MgCl2 0.1г MgSO47H2O* 0.1г Na2HPO4 0.06г KH2PO4 0.06г NaHCO3 0.07г Глюкоза 1.00г Фенол (водорозчинна форма) 0.02г (води бідистильованої перегнаної склі до 1л) Хлористий кальцій (СаСl2) заздалегідь розчиняють в 30-50мл води і поволі додають до розчину інших солей. За Наявності цієї соли з більшим змістом кристалізаціонной води (Na2HPO412H2O*) її додають в кількості 2г. Отриманий розчин фільтрують через паперовий або ватно-марлевий фільтр. Після цього розчин розливають в скляний посуд, закривають ватно-марлевими пробками і стерилізують текучим паром при температурі 100 градусів Цельсію без тиску по 20 хвилин 3 дні підряд. Розчин при доданні індикатора фенолового червоного має червоно-рожевий колір. Для настанови рН в розчин Хенкса додають стерильний 1.4% розчин двовуглекислого натрію (NaHCO3). Розчин Хенкса при роботі з культурою тканин повинен мати рН 7.2-7.4. При доданні в клітинну суспензію після гомогенізації використовується розчин Хенкса, не що містить фенолового червоного. Зберігають розчин при 4-60 градусів Цельсія, але можна також і при кімнатній температурі. Термін придатності один місяць. Подальша робота проводиться в стерильних умовах боксу. Ембріони переносять в стерильні чашки Петрі, заповнені середою Хенкса з антибіотиками, де, обережно розчинивши черевну порожнину, витягають тимус, з якого окремо готують клітинну суспензію. Кровотворний орган помішують в гомогенізатори, розрізають на невеликі фрагменти і подрібнюють до отримання однорідної маси. Клітини змивають зі стінок і пестика гомогенізатора середою Хенкса в мірні пробірки, пропускаючи через фільтр для переливання препаратів крові, а після цього через голки діаметру, що зменшується. Порція приготованої таким чином суспензії переноситься в поліетиленовий циліндр і герметичні закривається. Ця порція може бути використана для трансплантації нативної суспензії. Інші порції будуть піддані кріоконсервуванню. Ембріональні клітинні суспензії розливаються в поліетиленові контейнери ємністю від 0.5 до 2.0мл (в залежності· від подальшого призначення) Приготування і використання нативних клітинних суспензій. Нативні клітинні суспензії одержують після пропущення гомогената ембріональних тканин через фільтр для переливання препаратів крові і голки діаметру, що зменшується. Нативні клітинні суспензії застосовують по тим же показанням і з допомогою тих же засобів вступ у, що і кріоконсервовані клітинні суспензії. Нативні клітинні суспензії використовуються в течію 6-8 годин від моменту взяття матеріалу. Від моменту отримання і до моменту вступ у нативни х клітинних суспензій реципієнту вони зберігаються при температурі +5-7 градусів Цельсія. Стислі терміни від моменту приготування до моменту вступ у нативних клітинних суспензій зумовлюють особливості їх тестування, а саме редуційованну програму тестування у порівнянні з кріоконсервованими клітинними суспензіями. В нативних клітинних суспензіях виробляється підрахунок ядровмістних клітин в 1мл суспензії. Програма вірусологічного і бактеріологічного контролю нативних клітинних суспензій обмежена. Дослідження на бактеріальну стерильність проводиться, однак його результати стають відомі після трансплантації. Тому ембріональний тимус в цьому випадку береться тільки з цілого ембріону зі розтинанням грудної порожнині в стерильних умовах. Такий матеріал вважається умовно бактеріологічно стерильним. Фетальна діагностика на наявність віл-інфекції, вірусного гепатиту В, і С, токсоплазмозу, цитомегаловірусної інфекції, вірусу краснухи і герпеса проводиться також ретроспективно. Тому нативні клітинні суспензії готуються тільки при повній пренатальній діагностиці донора, включаючої в себе дослідження крові донора на наявність сифілісу, віл-інфекції, вірусного гепатиту В, і С, токсоплазмозу, цитомегаловірусної інфекції. При застосуванні нативних клітинних суспензій проводиться також дослідження крові реципієнта на наявність вірусних інфекцій: вірусного гепатиту В, і С, токсоплазмозу, цитомегаловірусної інфекції, герпеса. Незважаючи на те, що з застосуванням нативних клітинних суспензій зв'язувалася надія отримання більш висловленого клінічного ефекту трансплантації, наш досвід використання нативних і кріоконсервованих клітинних суспензій дозволив прийти до укладення, що ефект застосування нативних клітинних суспензій не перевищує ефект кріоконсервованих клітинних суспензій. В нинішній час ми не схильні рекомендувати нативні клітинні суспензії для трансплантації і віддаємо перевагу кріоконсервованим клітинним суспензіям. Кріоконсервування клітинних суспензій. Після приготування клітинній суспензії, включаючи додання кріопротектора, отримані клітинні суспензії розливаються в поліетиленові контейнери які закручуються пробками ємністю 2мл. В кожний контейнер вміщується суспензія в кількості від 0.5 до 2мл. В якості кріопротектора використовується диметилсульфокис (ДМСО, хімічно чистий). ДМСО є добре відомим кріопротектором. Перед використанням ДМСО пропускається через мілішпоровий фільтр (діаметр шпор 0.22mm). При легкому змішуванні клітинної суспензії в неї перед кріоконсервуванням додається по краплинам рівної кількості КС обсяг свіжезробленого робітничого розчину ДМСО (1.4моль на літр). Підсумкова концентрація ДМСО в отриманої КС складає 3-10%. Відмиття препарату від ДМСО перед трансплантацією не вимагається. Його концентрація в контейнерах складає від 3 до 10%. При його розведенні в ізотонічному розчині хлористого натрію при вступі реципієнту вона відповідно падає в 50-100 раз і не є токсичною для організму. Більш того, ДМСО є провідником біологічних активних речовин через біологічні бар'єри і мембрани, сприяючи біологічному ефекту трансплантації. Для клітинній суспензії кожного ембріону обов'язково є б контрольних контейнерів наступного призначення: 1 контейнер, що містить 0.5мл клітинній суспензії, передвизначений для тестування функціональної спроможності КС після розморожування; З контейнера, що містять по 1.0-1.5мл клітинній суспензії, передвизначені для вірусологічного контролю даного ембріону. Клітинні суспензії для цих контейнерів готується з шкіряно-м'язового лоскута цього же ембріону так же як клітинні суспензії з тимуса. Один контейнер досліджується на наявність вірусних інфекцій в лабораторії установи-виготівника клітинній суспензії, другий контейнер передається для паралельного дослідження державної контролюючої лабораторії. Третій контейнер залишається в кріосховищі для постійного зберігання з метою підтвердження в подальшому безпеки матеріалу, включаючи вірусологічну і бактеріальну. Матеріал, в якому хоча б в 1 контейнері виявляються віруси, знищується разом зі всім матеріалом від цього ж ембріону шляхом зпалювання. 2 контейнера, що містять по 1.0-1.5мл змивної води з лабораторного посуду і інструментів, передвизначені для дослідження бактеріальної стерильності. 1-й контейнер досліджується в лабораторії установи-виготівника, 2-й в державній контрольній лабораторії. Всі контейнери, за винятком 2-х призначених для вірусологічного контролю і 2-х, призначених для бактеріологічного контролю, наражаються на програмний кріозаморожуванню до -196 градусів Цельсія. Контейнери поміщають в камеру програмного заморожувателя вертикально. Заморожування проводять в 3 етапу: 1 - від температури приміщення до -4 градусів Цельсія зі швидкістю 1 градус Цельсія в хвилину; 2 – від -4 до -10 градусів - зі швидкістю 0.1 градус в хвилину; 3 – від -10 до -190 градусів - зі швидкістю 7 градусів в хвилину. Після цього контейнери переносять в біосейфи, де зберігають в рідкому азоті необмежений час до використання. Операції кріоконсервування і розморожування безумовно відбиваються на характеристиках матеріалу. Тому в засобі, що заявляється дослідження характеристик клітинних суспензій виробляється після виконання обох цих процедур, то є вже після розморожування раніше кріоконсервованого матеріалу. Таким чином забезпечується контроль результатів роботи відносно якості кріоконсервування і розморожування. Крім того, ми визнали доцільним використати один з відомих засобів кріоконсервування, що, певно, є одним з кращих по відношенню з нашому об'єкту, складатися з трьох стадій заморожування (Федотенков А.Г., Шишкин І.Д., Данилова Л.А. та ін. Кріоконсервування кісткового мозку при низьких температурах для клінічної мети. Проблеми гематології 1966, т.10, 12, стор.45-50). Разом з тим, спеціальні роботи, проведені для оцінки впливу кріоконсервування, свідчать "cryopreservation did not adversely change the population, viability or immunological capacity of human Fetal liver transplantation" (Ek S., Ringden O., Markling L., Westgren M. Cryopreservation of fetal stem Cells. Bone Marrow transplantation, 11 Suppl, 1: 123, 1993). Розморожування клітинних суспензій. Розморожування клітинних суспензій виробляється безпосередньо перед їхнім застосуванням. Програма розморожування включає дві фази - швидку і повільну. Швидку фазу разморозки матеріал минає шляхом приміщення контейнера в водяну лазню з температурою 40гр. Цельсія до появи рухомий центральної льодинки в контейнері. Далі слідує повільна фаза при звичайній кімнатній температурі, доки в контейнері витягнутому з води не зникне льодинка. При кімнатній температурі розморожена клітинна суспензія зберігається до трансплантації не більш 2 годин. Тестування функціонального стану кріоконсервованих клітинних суспензій. Після приготування клітинній суспензії і її кріоконсервування контрольний контейнер, що містить 0.5мл клітинній суспензії, використовується для тестування функціонального стану матеріалу. Для цього він розморожується по програмі, по якій перед трансплантацією виробляється розморожування всіх інших контейнерів. В розмороженої порції клітинній суспензії узВІЛаєними засобами визначається: Загальна кількість ядровмістних клітин в 1мл (клітинним аналізатором або візуально під мікроскопом в рахувальній камері), 'Colony-'forming units of the granulocyte/macrophage (CFU GM)" used in international scientific publications; this term means "an hematopoietic cell which is capable of producing a colony composed of granulocyte and macrophage progeny in semi-solid medium". КОЕ ΙΉ в 1мл (засобами клонування КОЕ в метилцелюлозі Hann V., Bodger M., Hoffbrand a. Development of pluripotent hematopoietic progenitor cells in the human fetus//Blood. - 1983. - Vol.62. N.4 - P.118-123.) 'Colony-'forming units of the granulocyte, erythrocyte, monocyte/macrophage, megakaryocyte (CFU GEMM)", meaning "a multipotential hematopoietic cell which is capable of producing a colony composed of granulocyte, erythrocyte, monocyte/macrophage, and megakaryocyte progeny in semi-solid medium". КОЕ ГЕММ в 1мл (теж саме) (ibid). Саме на ці характеристики КС, отримані після розморожування, ми орієнтуємося при оцінці функціональної спроможності КС при виборі матеріалу для трансплантації. Ми не проводимо прижиттєву забарвлення мазков КС для визначення відсотка пошкодження клітин т. до. При відпрацьованої технології приготування клітинних суспензій ці характеристики мало корелюють з клінічним ефектом і не відповідають на питання про функціональну повноцінність КС. Тестування вірусної і бактеріальної стерильності. З контейнера, що містять по 1.0-1.5мл клітинній суспензії, передвизначені для вірусологічного контролю даного ембріону. Клітинні суспензії для цих контейнерів готується з шкіряно-м'язового лоскута цього же ембріону так же як клітинні суспензії з тимуса. Один контейнер досліджується на наявність вірусних інфекцій в лабораторії установи-виготівника клітинній суспензії, другий контейнер передається для паралельного дослідження державної контролюючої лабораторії. Третій контейнер залишається в кріосховищі для постійного зберігання з метою підтвердження в подальшому безпеки матеріалу, включаючи вірусологічну і бактеріальну). Матеріал, в якому хоча б в 1 контейнері виявляються віруси, знищується разом зі всім матеріалом від цього же ембріону шля хом зпалювання. 2 контейнера, що містять по 1.0-1.5мл змивної води з лабораторного посуду і інструментів, передвизначені для дослідження бактеріальної стерильності. 1-й контейнер досліджується в лабораторії установи-виготівника, 2-й в державній контрольній лабораторії. Пренатальна діагностика донора ембріонального матеріалу включає дослідження на сифіліс, вілінфекцію, вірусні гепатити В, і С, токсоплазмоз, цитомегаловірус. Фетальная діагностика матеріалу включає віл-інфекцію, вірусні гепатити В, і с, токсоплазмоз, цитомегаловірус, вір уси рубелли, герпеса. Повторна діагностика донора на наявність віл-інфекції проводиться після 90-100 днів після аборту. Властивості лікарського препарату. 1. Відновлення показників імунітету: загальної кількості лімфоцитів, субпопуляцій лімфоцитів Т4. Т8, NK клітин, В-лімфоцитів, корекція їхні співвідношення. 2. Зняття явищ імунологічної атаки, аутоімунної поразки, імунної агресії, феномену супресії. 3. Формування противопухлинного імунітету. 4. Підсилення процесів регенерації, до швидкого загоювання виразкових дефектів, що приводяться і закриття їх епітеліальним пластом. 5. Запобігання розвитку сполучної тканини в результаті перитоніту і операційної травми. Терапевтичне використання препарату. 1. Показання до застосування лікарського препарату. 2. Імунні і аутоімунні, алергічні поразки кишечника. 3. Кишечний синдром при цитостатичній хворобі, включаючи променеві поразки. 4. Пухлини кишечника до і після оперативного лікування, до і після курсів хіміо- і рентгенотерапії. 5. Виразковий і ерозивний процеси. 6. Розвиток сполучної тканини в стінці кишки. Шляхи введення до організму. Клітинні суспензії, приготовані з ембріонального тимуса, найбільш часто вводяться внутрішньовенно, хоча можливий шлях підшкірний, внутрішньопорожнинний і підкапсульний. А саме: Лікарський препарат вводять внутрішньовенно крапельно в складі 100мл ізотонічного розчину хлористого натрію зі швидкістю 20-40 краплин в хвилину. Можливо підшкірне введення. Внутрішньопорожнинне і підкапсульне з використанням ендоскопічної апаратури. Можливо спільне використання клітинних суспензій, що рекомендувалися для лікування захворювань кишечника. Вибір для введення обсягу /що пропонується клітинній суспензії. 5.0мл це максимальний обсяг клітинній суспензії, що може бути отриманий з вхідного материла при означених кількісних характеристиках; 0.5мл - це мінімальний обсяг, придатний для технічного обслуговування манипуляции трансплантації, оскільки частина клітин завжди залишається в флаконі, в трубках, в голках і т. д. Тому контейнер завжди повинен містити препарат в означених межах обсягу. Як вказувалося вище, звичайно в течію одного лікувального сеансу вводять 0.5-2.0 мл клітинної суспензії. Повторне введення препарату. При повторному введенні препарату на наступних етапах лікування пацієнта більш прийнятним є використання клітинній суспензії з також ембріону, що був використаний в перший раз. Саме для реалізації цієї особливості засобу приготована з ембріонального органу суспензія розливається в декілька контейнерів. Ембріональна суспензія закріплюється за конкретним пацієнтом і зберігається в криобанці для наступного використання у цього же пацієнта. Автори відносять до позитивних якостей засобу, що пропонується можливість досягнути повноцінного лікувального ефекту при застосуванні малих доз фетального матеріалу. Протипоказання до застосування. 1. Васкуліт в гострій фазі. Капіляріт, флебіт, артрит. Трансплантація можлива після активного лікування і досягнення ремісії через 2-3 місяця. 2. Гострий тромбоз. Лікування можливо через 3-6 місяці. 3. Гемофтальмопатія. Лікування можливо тільки через 2-3 місяця після розвитку гемофтальмопатії. 4. Різко виражена гіпертензія малого кола, зв'язана з васкулітом, тромбозом, долевій пневмонією з розвитком гострого або підгострого cor pulmonale. 5. Мієлокарціноз. 6. Термінальні стадії захворювання (висловлена інтоксикація, глибокі розлади обміну речовин, важка загальна декомпенсація). 7. Наявність очагів хронічної інфекції. Необхідна їхня санація. Препарат 7 - Епітеліоціти ембріонального первинного харчового каналу людини. Приготування лікарського препарату. Використають ембріони 8-14 тижнів гестации. Ембріони одержують при штучному припиненні вагітності у здорових, заздалегідь на наявність вірусних і гемических інфекцій жінок ,що обстежилися. В меті збереження цілісності ембріону аборт проводять вакуумекстракцієй. Ембріони переносять в стерильні чашки Петрі, заповнені розчином Хенкса з доданням антибіотика аміно глікозидного ряду (напр., гентаміцин в концентрації 160мг гентаміцина на 1 000мл розчину Хенкса). Приготування розчину Хенкса (Hanks, Wallace, 1949): Розчин Хенкса (Hanks, Wallace, 1949) використовувався в якості середи для приготування клітинних суспензій. Цей розчин є загальноприйнятим для приготування поживних середовищ. NaCl 8.0г Kcl 0.4г СаСІ2 0.14г МдСІ2 0.1г MgSO47H2O* 0.1г Na2HPO4 0.06г КН2РО4 0.06г NaHCO3 0.07г Глюкоза 1.00г Фенол (водорозчинна форма) 0.02г (води бідистильованої перегнаної в склі до 1 л) Хлористий кальцій (СаС12) заздалегідь розчиняють в 30-50мл води і поволі додають до розчину інших солей. За наявності цієї солі з більшим змістом кристалізаційної води (Na2HPO412H2O*) її додають в кількості 2г. Отриманий розчин фільтрують через паперовий або ватно-марлевий фільтр. Після цього розчин розливають в скляний посуд, закривають ватно-марлевими пробками і стерилізують текучим паром при температурі 100 градусів Цельсію без тиску по 20 хвилин 3 дня підряд. Розчин при доданні індикатора фенолового червоного має червоно-оранжевий колір. Для настанови рН в розчин Хенкса додають стерильний 1.4% розчин двовуглекислого натрію (NаНСОЗ). Розчин Хенкса при роботі з культурою тканин повинен мати рН 7.2-7.4. Зберігають розчин при 4-60 градусів Цельсія, але можна також і при кімнатній температурі. Термін придатності один місяць. Обережно розчиняють черевну порожнину, витягають харчовий канал, який складається з виросту страховода, шлунку, підшлункової залози, в вигляді невеликий крапки величиною з просяне зерно, і кишок. Харчовий канал поміщують в гомогенізатори, розрізають на невеликі фрагменти і подрібнюють до отримання однорідної маси. Клітини змивають зі стінок і пестика гомогенізатора розчином Хенкса в мірні пробірки, пропускають суспензію через фільтр для переливання препаратів крові, а після цього через голки діаметру, що зменшуються. Клітинну суспензію переносять в стерильний мірний циліндр на 5мл. Зразок розводять розчином Хенкса 1:1. Центрифугують 5хв., зі швидкістю приблизно 400хg (1500 оборотів в хв.), при температурі 40°С. Супернатант акуратно переносять в стерильну пробірку, розбавляють розчином Хенкса 1:1. Центрифугують другий раз 5 хвилин, зі швидкістю приблизно 400хg (1500 оборотів в хв.), при температурі 40°С. Надосадочну рідину переносять в контейнер, розводять 1:1. Виробляють підрахунок клітин. Клітинні суспензії розливають в поліетиленові контейнери, в залежності від подальшої мети, обсягом від 0.5 до 2мл. Приготування і використання нативних клітинних суспензій. Нативні клітинні суспензії одержують після пропущення гомогената ембріональних тканин через фільтр для переливу препаратів крові і голки діаметру, що зменшується. Нативні клітинні суспензії застосовують по тим же показанням і з допомогою тих же засобів вступ у, що і кріоконсервовані клітинні суспензії. Нативні клітинні суспензії використовуються в течію 6-8 годин від моменту взяття матеріалу. Від моменту отримання і до моменту вступу нативних клітинних суспензій реціпієнту вони храняться при температурі +5-7 градусів Цельсія. Стислі терміни від моменту приготування до моменту вступ у нативних клітинних суспензій зумовлюють особливості їх тестування, а саме редуковану програму тестування у порівнянні з кріконсервованими клітинними суспензіями. В нативних клітинних суспензіях виробляється підрахунок ядровмістних клітин в 1мл суспензії. Програма вірусологічного і бактеріологічного контролю нативних клітинних суспензій обмежена. Дослідження на бактеріальну стерильність проводиться, однак його результати стають відомі після трансплантації. Тому первинний харчовий канал береться тільки з цілого ембріону зі розтинанням черевної порожнини в стерильних умовах. Такий матеріал вважається умовно бактеріологично стерильним. Фетальная діагностика на наявність віл-інфекції, вірусного гепатиту В, і С, токсоплазмозу, цитомегаловірусної інфекції, вірусу краснухи і герпеса проводиться також ретроспективно. Тому нативні клітинні суспензії готуються тільки при повній пренатальній діагностиці донора, включаючої в себе дослідження крові донора на наявність сифілісу, віл-інфекції, вірусного гепатиту В, і С, токсоплазмозу, цитомегаловірусної інфекції. При застосуванні нативних клітинних суспензій проводиться також дослідження крові реципієнта на наявність вірусних інфекцій: вірусного гепатиту В, і С, токсоплазмозу, цитомегаловирусної інфекції, герпеса. Незважаючи на те, що з застосуванням нативних клітинних суспензій зв'язувалася надія отримання більш висловленого клінічного ефекту трансплантації, наш досвід використання нативних і кріоконсервованих клітинних суспензій дозволив прийти до укладення, що ефект застосування нативних клітинних суспензій не перевищує ефект кріоконсервованих клітинних суспензій. В нинішній час ми не схильні рекомендувати нативні клітинні суспензії для трансплантації і віддаємо перевагу кріоконсервованим клітинним суспензіям. Кріоконсервування клітинних суспензій. Після приготування клітинній суспензії, включаючи додання кріопротектора, отримані клітинні суспензії розливаються в поліетиленові контейнери з пробками, які закручуються, ємністю 2мл. В кожний контейнер вміщується суспензія в кількості від 0.5 до 2мл. В якості кріопротектору використовується діметилсульфокис (ДМСО, хімічно чистий). ДМСО є добре відомим кріопротектором. Перед використанням ДМСО пропускається через мілліпоровий фільтр (діаметр пор 0.22mm). При легкому змішуванні клітинної суспензії в неї перед кріоконсервуванням додається по краплинам рівної кількості КС обсяг свіжезробленого робітничого розчину ДМСО (1.4моль на літр). Підсумкова концентрація ДМСО в отриманої КС складає 3-10%. Відмиття препарату від ДМСО перед трансплантацією не вимагається. Його концентрація в контейнерах складає від 3 до 10%. При його розведенні в ізотонічному розчині хлористого натрію при вступі реципієнту вона відповідно падає в 50-100 раз і не є токсичною для організму. Більш того, ДМСО є провідником біологічних активних речовин через біологічні бар'єри і мембрани, сприяючи біологічному ефекту трансплантації. Для клітинній суспензії кожного ембріону обов'язково є 6 контрольних контейнерів наступного призначення: 1 контейнер, що містить 0.5мл клітинній суспензії, передвизначений для тестування функціональної спроможності КС після розморожування; З контейнера, що містять по 1.0-1.5мл клітинній суспензії, передвизначені для вірусологічного контролю даного ембріону. Клітинні суспензії для цих контейнерів готується з шкіряно-м'язового лоскута цього же ембріону також як клітинні суспензії з печінки. Один контейнер досліджується на наявність вірусних інфекцій в лабораторії установи-виготівника клітинної суспензії, другий контейнер передається для паралельного дослідження державної контролюючої лабораторії. Третій контейнер залишається в кріосховищі для постійного зберігання з метою підтвердження в подальшому безпеки матеріалу, включаючи вірусологічну і бактеріальну. Матеріал, в якому хоча б в 1 контейнері виявляються віруси, знищується разом зі всім матеріалом від цього же ембріону шля хом зпалювання. 2 контейнера, що містять по 1.0-1.5мл змивної води з лабораторного посуду і інструментів, передвизначені для дослідження бактеріальної стерильності. 1-й контейнер досліджується в лабораторії установи-виготівника, 2-й в державній контрольній лабораторії. Всі контейнери, за винятком 2-х призначених для вірусологічного контролю і 2-х, призначених для бактеріологічного контролю, наражаються на програмному кріозаморожувачі до -196 градусів Цельсія. Контейнери містять в камеру програмного заморожувача вертикально. Заморожування проводять в 3 етапу: 1 - від температури приміщення до -4 градусів Цельсія зі швидкістю 1 градус Цельсія в хвилину; 2 – від -4 до -10 градусів - зі швидкістю 0.1 градус в хвилину; 3 – від -10 до -190 градусів - зі швидкістю 7 градусів в хвилину. Після цього контейнери переносять в біосейфи, де зберігають в рідкому азоті необмежений час до використання. Операції кріоконсервування і розморожування безумовно відбиваються на характеристиках матеріалу. Тому в засобі ,що заявляється дослідження характеристик клітинних суспензій виробляється після виконання обох цих процедур, то є вже після розморожування раніше кріоконсервованого матеріалу. Таким чином забезпечується контроль результатів роботи відносно якості кріоконсервування і розморожування. Крім того, ми визнали доцільним використати один з відомих засобів кріоконсервування, що, певно, є одним з кращих по відношенню до нашого об'єкту, складається з трьох стадій заморожування (Федотенков А.Г., Шишкін І.Д., Данілова Л.А. та ін. Кріоконсервування кісткового мозку при низьких температурах для клінічної мети. Проблеми гематології 1966, т.10, 12, стор.45-50). Разом з тим, спеціальні роботи, проведені для оцінки впливу кріоконсервування, свідчать "cryopreservation did not adversely change the population, viability or immunological capacity of human Fetal liver transplantation" (Ek S., Ringden 0., Markling L., Westgren M. Cryopreservation of fetal stem Cells. Bone Marrow transplantation, 11 Suppl, 1: 123, 1993). Розморожування клітинних суспензій. Розморожування клітинних суспензій виробляється безпосередньо перед їхнім застосуванням. Програма розморожування включає дві фази - швидку і повільну. Швидку фазу разморозки матеріал минає шляхом приміщення контейнера в водяну лазню з температурою 40гр. Цельсія до появи рухомий центральної льодинки в контейнері. Далі слідує повільна фаза при звичайній кімнатній температурі, доки в контейнері витягнутому з води не зникне льодинка. При кімнатній температурі розморожена клітинна суспензія зберігатися до трансплантації не більш 2 годин. Тестування функціонального стану кріоконсервованих клітинних суспензій. Після приготування клітинній суспензії і її кріоконсервування контрольний контейнер, що містить 0.5мл клітинній суспензії, використовується для тестування функціонального стану матеріалу. Для цього він розморожується по програмі, по якій перед трансплантацією виробляється розморожування всіх інших контейнерів. В розмороженої порції клітинній суспензії узвичаєними засобами визначається загальна кількість ядровмістних клітин в 1мл (клітинним аналізатором або візуально під мікроскопом в рахувальній камері). Саме на ці характеристики КС, отримані після розморожування, ми орієнтуємося при оцінці функціональної спроможності КС при виборі матеріалу для трансплантації. Ми не проводимо прижиттєву забарвлення мазков КС для визначення відсотка пошкодження клітин т. До. При відпрацьованої технології приготування клітинних суспензій ці характеристики мало корелюють з клінічним ефектом і не відповідають на питання про функціональну повноцінність КС. Тестування вірусної і бактеріальної стерильності. З контейнера, що містять по 1.0-1.5мл клітинній суспензії, передвизначені для вірусологічного контролю даного ембріону. Клітинні суспензії для цих контейнерів готується з шкіряно-м'язового лоскута цього же ембріону так же як клітинні суспензії з печінки. Один контейнер досліджується на наявність вірусних інфекцій в лабораторії установи-виготівника клітинній суспензії, другий контейнер передається для паралельного дослідження державної контролюючої лабораторії. Третій контейнер залишається в кріосховищі для постійного зберігання з метою підтвердження в подальшому безпеки матеріалу, включаючи вірусологічну і бактеріальну. Матеріал, в якому хоча б в 1 контейнері виявляються віруси, знищується разом зі всім матеріалом від цього же ембріону шля хом зпалювання. 2 контейнера, що містять по 1.0-1.5мл змивної води з лабораторного посуду і інструментів, передвизначені для дослідження бактеріальної стерильності. 1-й контейнер досліджується в лабораторії установи-виготівника, 2-й в державній контрольній лабораторії. Пренатальна діагностика донора ембріонального матеріалу включає дослідження на сифіліс, вілінфекцію, вірусні гепатити В, і С, токсоплазмоз, цитомегаловірус. Фетальная діагностика матеріалу включає віл-інфекцію, вірусні гепатити В, і С, токсоплазмоз, цитомегаловірус, вір уси рубелли, герпеса. Повторна діагностика донора на наявність віл-інфекції проводиться через 90-100 днів після аборту. Властивості лікарського препарату. 1. Поліпшення трофіки органів, поліпшення мікроциркуляції, досягнення повнокров'я в стінці кишки. 2. Підсилення процесів регенерації, до швидкого загоювання виразкових дефектів, що приводяться і закриття їх епітеліальним пластом. 3. Підсилення кишечного бар'єру, зменшення явищ кишечної інтоксикації, зменшення або зникнення пропасниці. 4. Поліпшення психоемоційного стану пацієнта, поява волі до видужання, нормалізація формули сну, поява апетиту, зростання обсягу р ухів. Терапевтичне використання препарату. Показання до застосування лікарського препарату. 1. Імунні і аутоімунні, алергічні поразки кишечника. 2. Кишковий синдром при цитостатичній хворобі, включаючи променеві поразки. 3. Ішемічні поразки кишечника (ішемічний коліт). 4. Виразкові і ерозивні процеси. 5. Явища інтоксикації: слабість, пітливість, підвищення температури, порушення дієздатності, зниження ваги (кахексія). Шляхи введення клітинних суспензій. Клітинні суспензії, приготовані з харчового каналу, найбільш часто вводяться внутришньовенно, підшкірно, субкапсульно, всередину порожнини, в підслизистий шар, у виразковий дефект. Можливо спільне використання клітинних суспензій, що рекомендувалися для лікування захворювань кишечника. Вибір для введення обсягу клітинній суспензії, що пропонується. 5.0мл - це максимальний обсяг клітинній суспензії, що може бути отриманий з вхідного матеріалу при означених кількісних характеристиках; 0.5мл - це мінімальний обсяг, придатний для технічного обслуговування маніпуляції трансплантації, оскільки частина клітин завжди залишається в флаконі, в трубках, в голках і т. ін. Тому контейнер завжди повинен містити препарат в означених межах обсягу. Як вказувалося вище, звичайно в течію одного лікувального сеансу вводять 0.5-2.0мл клітинній суспензії. Повторне введення препарату. При повторному введенні препарату на наступних етапах лікування пацієнта більш прийнятним є використання клітинної суспензії з того же ембріону, що був використаний в перший раз. Саме для реалізації цієї особливості засобу приготована з ембріонального органу суспензія розливається в декілька контейнерів. Ембріональна суспензія закріплюється за конкретним пацієнтом і зберігається в кріобанці для наступного використання у цього же пацієнта. Автори відносять до позитивних якостей засобу, що пропонується можливість досягнути повноцінного лікувального ефекту при застосуванні малих доз фетального матеріалу. Протипоказання до застосування. 1. Васкуліт в гострій фазі. Капіляріт, флебіт, артрит. Трансплантація можлива після активного лікування і досягнення ремісії через 2-3 місяця. 2. Гострий тромбоз. Лікування можливо через 3-6 місяці. 3. Гемофтальмопатія. Лікування можливо тільки через 2-3 місяця після розвитку гемофтальмопатії. 4. Різко виражена гіпертензія малого кола, зв'язана з васкулітом, тромбозом, долевою пневмонією, з розвитком гострого або підгострого cor pulmonale. 5. Мієлокарциноз. 6. Термінальні стадії захворювання (висловлена інтоксикація, глибокі розлади обміну речовин, важка загальна декомпенсація). 7. Наявність очагів хронічної інфекції. Необхідна їх санація. Препарат 8 - Нервові клітини ембріонального мозку людини. Приготування лікарського препарату. Використають ембріони 5-14 тижнів гестації. Ембріони одержують при штучному припиненні вагітності у здорових жінок, що заздалегідь обстежилися на наявність вірусних і гемических інфекцій. В меті збереження цілісності ембріону аборт проводять вакуумекстракцією. Ембріони переносять в стерильні чашки Петрі, заповнені розчином Хенкса з доданням антибіотика аміноглікозидного ряду (напр., гентаміцин в концентрації 160мг гентаміцина на 1000мл розчину Хенкса). Приготування розчину Хенкса (Hanks, Wallace, 1949): Розчин Хенкса (Hanks, Wallace, 1949) використовувався в якості середи для приготування клітинних суспензій. Цей розчин є загальноприйнятим для приготування поживних середовищ. NaCl 8.0г Kcl 0.4г СаСl2 0.14г MgCl2 0.1г MgSO47H2O* 0.1г Na2HPO4 0.06г KH2PO4 0.06г NaHCO3 0.07г Глюкоза 1.00г Фенол (водорозчинна форма) 0.02г (води бідистильованої перегнаної в склі до 1л) Хлорістий кальцій (СаСl2) заздалегідь розчиняють в 30-50мл води і поволі додають до розчину інших солей. За наявності цієї солі з більшим змістом кристалізаційної води (Na2HPO412H2O*) її додають в кількості 2г. Отриманий розчин фільтрують через паперовий або ватно-марлевий фільтр. Після цього розчин розливають в скляний посуд, закривають ватно-марлевими пробками і стерилізують текучим паром при температурі 100 градусів Цельсія без тиску по 20 хвилин 3 дня підряд. Розчин при доданні індикатора фенолового червоного має червоно-рожевий колір. Для настанови рН в розчин Хенкса додають стерильний 1.4% розчин двовуглекислого натрію (NaHCO3). Розчин Хенкса при роботі з культурою тканин повинен мати рН 7.2-7.4. При доданні в клітинну суспензію після гомогенізації використовується розчин Хенкса, що не містить фенолового червоного. Зберігають розчин при 4-60 градусів Цельсію, але можна також і при кімнатній температурі. Термін придатності один місяць. Подальша робота проводиться в стерильних умовах боксу. Ембріони переносять в стерильні чашки Петрі, заповнені середою Хенкса з антибіотиками, де, обережно розчинивши черепну порожнину, витягають мозок, з якого окремо готують клітинну суспензію. Орган поміщують в гомогенізатори, розрізають на невеликі фрагменти і подрібнюють до отримання однорідної маси. Клітини змивають зі стінок і пестика гомогенізатора середою Хенкса в мірні пробірки, пропускаючи через фільтр для переливання препаратів крові, а після цього через голки діаметру, що зменшується. Порція приготованої таким чином суспензії переноситься в поліетиленовий циліндр і герметично закривається. Ця порція може бути використана для трансплантації нативної суспензії. Інші порції будуть піддані кріоконсервуванню. Ембріональні клітинні суспензії розливаються в поліетиленові контейнери ємністю від 0.5 до 2.0мл (в залежності від подальшого призначення) Приготування і використання нативних клітинних суспензій. Нативні клітинні суспензії одержують після пропущення гомогената ембріональних тканин через фільтр для переливу препаратів крові і голки діаметру, що зменшується. Нативні клітинні суспензії застосовують по тим же показанням і з допомогою тих же засобів введення, що і кріоконсервовані клітинні суспензії. Нативні клітинні суспензії використовуються в течію 6-8 годин від моменту взяття матеріалу. Від моменту отримання і до моменту вступ у нативни х клітинних суспензій реципієнту вони храняться при температурі +5-7 градусів Цельсія. Стислі терміни від моменту приготування до моменту введення нативних клітинних суспензій зумовлюють особливості їх тестування, а саме редукційну програму тестування у порівнянні з кріоконсервованими клітинними суспензіями. В нативних клітинних суспензіях виробляється підрахунок ядровмістних клітин в 1мл суспензії. Однак тестування нативних клітинних суспензій на КОЕ-ГМ ('colony-'forming units of the granulocyte/macrophage (CFU GM) "), КОЕ-Г ММ ('colony-'forming units of the granulocyte, erythrocyte, monocyte/macrophage, megakaryocyte (CFU GEMM) ") і СД34 ("progenitor cells (CD34) ") перед трансплантацією не проводиться. Програма вірусологічного і бактеріологічного контролю нативних клітинних суспензій також обмежена. Дослідження на бактеріальну стерильність проводиться, однак його результати стають відомі після трансплантації. Тому ембріональний мозок в цьому випадку береться тільки з цілого ембріону зі розтинанням черепної порожнини в стерильних умовах. Такий матеріал вважається умовно бактеріологічно стерильним. Фетальная діагностика на наявність віл-інфекції, вірусного гепатиту В, і С, токсоплазмозу, цитомегаловірусної інфекції, вірусу краснухи і герпеса проводиться також ретроспективно. Тому нативні клітинні суспензії готуються тільки при повній пренатальній діагностиці донора, включаючої в себе дослідження крові донора на наявність сифілісу, віл-інфекції, вірусного гепатиту В, і С, токсоплазмозу, цитомегаловірусної інфекції. При застосуванні нативних клітинних суспензій проводиться також дослідження крові реципієнта на наявність вірусних інфекцій: вірусного гепатиту В, і С, токсоплазмозу, цитомегаловірусної інфекції, герпеса. Незважаючи на те, що з застосуванням нативних клітинних суспензій зв'язувалася надія отримання більш вираженого клінічного ефекту трансплантації, наш досвід використання нативних і кріоконсервованих клітинних суспензій дозволив прийти до укладення, що ефект застосування нативних клітинних суспензій не перевищує ефект кріоконсервованих клітинних суспензій. В нинішній час ми не схильні рекомендувати нативні клітинні суспензії для трансплантації і віддаємо перевагу кріоконсервованим клітинним суспензіям. Кріоконсервування клітинних суспензій. Після приготування клітинній суспензії, включаючи додання кріопротектора, отримані клітинні суспензії розливаються в поліетиленові контейнери з пробками, які закручуються ємністю 2мл. В кожний контейнер міститься суспензія в кількості від 0.5 до 2мл. В якості кріопротектора використовується діметилсульфокис (ДМСО, хімічно чистий). ДМСО є добре відомим кріопротектором. Перед використанням ДМСО пропускається через мілішпоровий фільтр (діаметр шпор 0.22mm). При легкому змішуванні клітинній суспензії в неї перед кріоконсервуванням додається по краплинам рівний кількості КС обсяг свіжезробленого робітничого розчину ДМСО (1.4моль на літр). Підсумкова концентрація ДМСО в отриманої КС складає 3-10%. Відмиття препарату від ДМСО перед трансплантацією не вимагається. Його концентрація в контейнерах складає від 3 до 10%. При його розведенні в ізотонічному розчині хлористого натрію при вступі реципієнту вона відповідно падає в 50-100 раз і не є токсичною для організму. Більш того, ДМСО є провідником біологічних активних речовин через біологічні бар'єри і мембрани, сприяючи біологічному ефекту трансплантації. Для клітинній суспензії кожного ембріону обов'язково є б контрольних контейнерів наступного призначення: 1 контейнер, що містить 0.5мл клітинній суспензії, передвизначений для тестування функціональної спроможності КС після розморожування; З контейнера, що містять по 1.0-1.5мл клітинній суспензії, передвизначені для вірусологічного контролю даного ембріону. Клітинні суспензії для цих контейнерів готується з шкіряно-м'язового лоскута цього же ембріону так же як клітинні суспензії з мозку. Один контейнер досліджується на наявність вірусних інфекцій в лабораторії установи-виготівника клітинній суспензії, другий контейнер передається для паралельного дослідження державної контролюючої лабораторії. Третій контейнер залишається в кріосховищі для постійного зберігання з метою підтвердження в подальшому безпеки матеріалу, включаючи вірусологічну і бактеріальну. Матеріал, в якому хоча б в 1 контейнері виявляються віруси, знищується разом зі всім матеріалом від цього же ембріону шля хом зпалювання. 2 контейнера, що містять по 1.0-1.5мл змивної води з лабораторного посуду і інструментів, передвизначені для дослідження бактеріальної стерильності. 1-й контейнер досліджується в лабораторії установи-виготівника, 2-й в державній контрольній лабораторії. Всі контейнери, за винятком 2-х призначених для вірусологічного контролю і 2-х, призначених для бактеріологічного контролю, наражаються на програмному кріозаморожувачі до -196 градусів Цельсія. Контейнери містять до камери програмного заморожувача вертикально. Заморожування проводять в 3 етапу: 1 - від температури приміщення до -4 градусів Цельсія зі швидкістю 1 градус Цельсія в хвилину; 2 – від -4 до -10 градусів - зі швидкістю 0.1 градус в хвилину; 3 – від -10 до -190 градусів - зі швидкістю 7 градусів в хвилину. Після цього контейнери переносять в біосейфи, де зберігають в рідкому азоті необмежений час до використання. Операції кріоконсервування і розморожування безумовно відбиваються на характеристиках матеріалу. Тому в засобі ,що заявляється дослідження характеристик клітинних суспензій виробляється після виконання обох цих процедур, то є вже після розморожування раніше кріоконсервованого матеріалу. Таким чином забезпечується контроль результатів роботи відносно якості кріоконсервування і розморожування. Крім того, ми визнали доцільним використати один з відомих засобів кріоконсервування, що, певно, є одним з кращих по відношенню з нашому об'єкту, складається з трьох стадій заморожування (Федотенков А.Г., Шишкін І.Д., Данілова Л.А. і ін. Кріоконсервування кісткового мозку при низьких температурах для клінічної мети. Проблеми гематології 1966, т.10, 12, стор.45-50). Разом з тим, спеціальні роботи, проведені для оцінки впливу кріоконсервування, свідчать "cryopreservation did not adversely change the population, viability or immunological capacity of human Fetal liver transplantation" (Ek S., Ringden 0., Markling L., Westgren M. Cryopreservation of fetal stem Cells. Bone Marrow transplantation, 11 Suppl, 1: 123, 1993). Розморожування клітинних суспензій. Розморожування клітинних суспензій виробляється безпосередньо перед їхнім застосуванням. Програма розморожування включає дві фази - швидку і повільну. Швидку фазу розморозки матеріал минає шляхом приміщення контейнера в водяну лазню з температурою 40гр. Цельсія до появи рухомої центральної льодинки в контейнері. Далі слідує повільна фаза при звичайній кімнатній температурі, доки в контейнері втягнутом з води не зникне льодинка. При кімнатній температурі розморожена клітинна суспензія зберігається до трансплантації не більш 2 годин. Тестування функціонального стану кріоконсервованих клітинних суспензій. Після приготування клітинній суспензії і її кріоконсервування контрольний контейнер, що містить 0.5мл клітинній суспензії, використовується для тестування функціонального стану матеріалу. Для цього він розморожується по програмі, по якій перед трансплантацією виробляється розморожування всіх інших контейнерів. В розмороженої порції клітинній суспензії узвичаєними засобами визначається: Загальна кількість ядровмістних клітин в 1мл (клітинним аналізатором або візуально під мікроскопом в рахувальній камері), 'Colony-'forming units of the granulocyte/macrophage (CFU GM) " used in international scientific publications; this term means "an hematopoietic cell which is capable of producing a colony composed of granulocyte and macrophage progeny in semi-solid medium". КОЕ ГМ в 1мл (засобами клонування КОЕ в метилцеллюлозе Наші V., Bodger M., Hoffbrand a. Development of pluripotent hematopoietic progenitor cells in the human fetus//Blood. 1983. - Vol.62. - N.4 - P.118-123.) 'Colony-'forming units of the granulocyte, erythrocyte, monocyte/macrophage, megakaryocyte (CFU GEMM)", meaning "a multipotential hematopoietic cell which is capable of producing a colony composed of granulocyte, erythrocyte, monocyte/macrophage, and megakaryocyte progeny in semi-solid medium". КОС ГЕММ в 1мл (теж саме) (ibid). "contents of early precursors of hemopoiesis", the authors proposeto replace it with a commonly used English term "progenitor cells (CD34)". СД34 в 1мл (indirect immunofluorescenct test with the panel of monoclonal antibodies). Саме на ці характеристики КС, отримані після розморожування, ми орієнтуємося при оцінці функціональної спроможності КС при виборі матеріалу для трансплантації. Ми не проводимо прижиттєву забарвлення мазков КС для визначення відсотка пошкодження клітин т. до. При відпрацьованої технології приготування клітинних суспензій ці характеристики мало корелюють з кліничним ефектом і не відповідають на питання про функціональну повноцінність КС. Тестування вірусної і бактеріальної стерильності. З контейнера, що містять по 1.0-1.5мл клітинній суспензії, передвизначені для вірусологічного контролю даного ембріону. Клітинні суспензії для цих контейнерів готується з шкіряно-м'язового лоскута цього же ембріону також як клітинні суспензії з мозку. Один контейнер досліджується на наявність вірусних інфекцій в лабораторії установи-виготівника клітинній суспензії, другий контейнер передається для паралельного дослідження державної контролюючої лабораторії. Третій контейнер залишається в кріосховищі для постійного зберігання з метою підтвердження в подальшому безпеки матеріалу, включаючи вірусологічну і бактеріальну. Матеріал, в якому хоча б в 1 контейнері виявляються віруси, знищується разом зі всім матеріалом від цього же ембріону шля хом зпалювання. 2 контейнера, що містять по 1.0-1.5мл змивної води з лабораторного посуду і інструментів, передвизначені для дослідження бактеріальної стерильності. 1-й контейнер досліджується в лабораторії установи-виготівника, 2-й в державній контрольній лабораторії. Пренатальна діагностика донора ембріонального матеріалу включає дослідження на сифіліс, вілінфекцію, вірусні гепатити В, і С, токсоплазмоз, цитомегаловірус. Фетальна діагностика матеріалу включає віл-інфекцію, вірусні гепатити В, і С, токсоплазмоз, цитомегаловірус, вір уси рубелли, герпеса. Повторна діагностика донора на наявність віл-інфекції проводиться через 90-100 днів після аборту. Властивості лікарського препарату. 1. Поліпшення нервової трофіки органів. 2. Підсилення процесів регенерації, до швидкого ззагоювання виразкових дефектів, що приводяться і закриття їх епітеліальним пластом. 3. Поліпшення психоемоційного стану пацієнта, поява волі до видужання, нормалізація формули сну, поява апетиту, зростання обсягу р ухів. 4. Нормалізація функціональної активності кишки: при діареї, зменшення частоти стільця, при запорах поява регулярного стільця. 5. Обезболюючий ефект. Терапевтичне використання препарату. Показання до застосування лікарського препарату. 1. Імунні і аутоімунні, алергічні поразки кишечника. 2. Атонія, гипокинезія, спастичні стани кишок. 3. Виразковий і ерозивний процеси. 4. Астено-невротичний синдром, депресивні стани. Шляхи введення в організм. Клітинні суспензії, приготовані з ембріонального мозку, найбільш часто вводяться підшкірно, інтракраниально, інтраспинально, підкапсульно, всередину порожнини, а також в тканині органів в вигляді імплантацій для формування нервових утворень. Можливо спільне використання клітинних суспензій, що рекомендувалися для лікування захворювань кишечника. Вибір для введення обсягу, що пропонується клітинній суспензії. 5.0мл це максимальний обсяг клітинній суспензії, що може бути отриманий з вхідного матеріалу при означених кількісних характеристиках; 0.5мл - це мінімальний обсяг, придатний для технічного обслуговування маніпуляцій трансплантації, оскільки частина клітин завжди залишається в флаконі, в трубках, в голках і т. ін. Тому контейнер завжди повинен містити препарат в означених межах обсягу. Як вказувалось вище, звичайно в течію одного лікувального сеансу вводять 0.5-2.0мл клітинній суспензії. Повторне введення препарату. При повторному введенні препарату на наступних етапах лікування пацієнта більш прийнятним є використання клітинній суспензії з того ж ембріону, що був використаний в перший раз. Саме для реалізації цієї особливості засобу приготована з ембріонального органу суспензія розливається в декілька контейнерів. Ембріональна суспензія закріплюється за конкретним пацієнтом і зберігається в кріобанці для наступного використання у цього же пацієнта. Автори відносять до позитивних якостей засобу, що пропонується можливість досягнути повноцінного лікувального ефекту при застосуванні малих доз фетального матеріалу. Протипоказання до застосування. 1. Васкуліт в гострій фазі. Капіляріт, флебіт, артрит. Трансплантація можлива після активного лікування і досягнення ремісії через 2-3 місяця. 2. Гострий тромбоз. Лікування можливо через 3-6 місяці. 3. Гемофтальмопатія. Лікування можливо тільки через 2-3 місяця після розвитку гемофтальмопатії. 4. Різко виражена гіпертензія малого кола, зв'язана з васкулітом, тромбозом, долевою пневмонією з розвитком гострого або підгострого cor pulmonale. 5. Міеєокарциноз. 6. Термінальні стадії захворювання (висловлена інтоксикація, глибокі розлади обміну речовин, важка загальна декомпенсація). 7. Наявність очагів хронічної інфекції. Необхідна їхня санація. Комбіноване застосування препаратів. Для лікування захворювань тонкої і товстої кишок препарати, що заявляються лікарські на основі ембріональних клітинних суспензій можуть застосовуватися порізно, а також в поєднанні один з іншим.