Композиції для імунізації проти mycobacterium

1. Імуногенна композиція, що містить не здатний до реплікації або здатний до реплікації ослаблений вектор поксвірусу, що експресує продукт трансляції мікобактеріального гена Ag85A для застосування у лікуванні або попередженні мікобактеріальної інфекції або хвороби шляхом індукції імунної відповіді Т-клітинної центральної пам„яті у пацієнта, де вірусний вектор експресує Ag85A з Pk С-кінцевим tag, з лідерною послідовністю tPA та вкороченим С-кінцем. 2. Композиція за п. 1, де імуногенна композиція – векторна вакцина. 3. Композиція за будь-яким попереднім пунктом, де T-клітинною імунною реакцією є реакція CCR7+. 4. Композиція за будь-яким попереднім пунктом, де не здатним до реплікації або здатним до реплікації ослабленим вектором поксвірусу є MVA. 5. Композиція за будь-яким попереднім пунктом, де не здатний до реплікації або здатний до реплікації ослаблений вектор поксвірусу експресує продукт трансляції SEQ ID NO:5. UA (21) a200707950 (22) 05.01.2006 (24) 10.03.2011 (86) PCT/GB2006/000023, 05.01.2006 (31) 0500102.9 (32) 05.01.2005 (33) GB (31) 60/649,804 (32) 03.02.2005 (33) US (46) 10.03.2011, Бюл.№ 5, 2011 р. (72) МАКШЕЙН ГЕЛЕН, GB, ПЕТАН АНСАР А., GB, ГІЛЛ АДРІАН, GB, ҐІЛБЕРТ САРА К., GB (73) АЙСІС ІННОВЕЙШН ЛІМІТЕД, GB (56) MCSHANE HELEN ET AL: "Recombinant modified vaccinia virus Ankara expressing antigen 85A boosts BCG-primed and naturally acquired antimycobacterial immunity in humans" NATURE MEDICINE, vol. 10, no. 11, November 2004 (200411), pages 1240-1244, XP002375252 ISSN: 10788956. WANG JUN ET AL: "Single mucosal, but not parenteral, immunization with recombinant adenoviral-based vaccine provides potent protection from pulmonary tuberculosis" JOURNAL OF IMMUNOLOGY, THE WILLIAMS AND WILKINS CO. BALTIMORE, US, vol. 173, no. 10, 15 November 2004 (2004-11-15), pages 6357-6365, XP002329297 ISSN: 0022-1767. MALIN ADAM S ET AL: "Vaccinia expression of Mycobacterium tuberculosis-secreted proteins: Tissue plasminogen activator signal sequence enhances expression and immunogenicity of M. tuberculosis Ag85" MICROBES AND INFECTION, vol. 2, no. 14, November 2000 (2000-11), pages 1677-1685, XP002375253 ISSN: 1286-4579. DUNN C ET AL: "Fine mapping of the binding sites of monoclonal antibodies raised against the Pk tag" JOURNAL OF IMMUNOLOGICAL METHODS, ELSEVIER SCIENCE PUBLISHERS B.V.,AMSTERDAM, NL, vol. 224, no. 1-2, 22 April 1999 (1999-04-22), pages 141-150, XP004165517 ISSN: 0022-1759. BALDWIN S L ET AL: "Immunogenicity and protective efficacy of DNA vaccines encoding secreted and nonsecreted forms of Mycobacterium tuberculosis Ag85A" TUBERCLE AND LUNG DISEASE, vol. 79, 2 (19) 1 3 6. Композиція за будь-яким попереднім пунктом, де не здатний до реплікації або здатний до реплікації ослаблений вектор поксвірусу експресує крім того продукт трансляції принаймні одного додаткового гена антигену мікобактеріального біотипу. 7. Композиція за будь-яким попереднім пунктом, де імуногенна композиція призначена для застосування принаймні з одним додатковим антигеном та/або антибактеріальним засобом. 8. Композиція за п. 6, де принаймні один додатковий антиген та/або антибактеріальний засіб призначено для застосування одночасно, окремо або послідовно. 9. Композиція за будь-яким попереднім пунктом, де реакція є антиген-специфічною імунною реакцією. 10. Застосування імуногенної композиції за п. 1 у виробництві медикаменту для лікування або попередження мікобактеріальної інфекції або хвороби у пацієнта шляхом індукції імунної відповіді Т-клітинної центральної пам„яті у пацієнта, де не здатний до реплікації або здатний до реплікації ослаблений вектор поксвірусу експресує Ag85A з Pk C-кінцевим tag, з tPA лідерною послідовністю та вкороченим C-кінцем. 11. Застосування за п. 10, де імуногенна композиція – векторна вакцина. 12. Застосування за будь-яким попередніх пунктів 10-11, де T-клітинною імунною реакцією є реакція CCR7+. 13. Застосування за будь-яким з попередніх пунктів 10-12, де не здатним до реплікації або здатним до реплікації ослабленим вектором поксвірусу є MVA. 14. Застосування за будь-яким з попередніх пунктів 10-13, де не здатний до реплікації або здатний до реплікації ослаблений вектор поксвірусу експресує продукт трансляції SEQ ID NO:5. 15. Застосування за будь-яким з попередніх пунктів 10-14, де не здатний до реплікації або здатний до реплікації ослаблений вектор поксвірусу експресує, крім того, продукт трансляції принаймні одного додаткового гена антигену мікобактеріального біотипу. 16. Застосування за будь-яким з попередніх пунктів 10-15, де імуногенна композиція призначена для застосування принаймні з одним додатковим антигеном та/або антибактеріальним засобом. 17. Застосування за п. 15, де принаймні один додатковий антиген та/або антибактеріальний засіб призначено для застосування одночасно, окремо або послідовно. 18. Застосування за будь-яким з попередніх пунктів 10-17, де імунною реакцією є антигенспецифічна імунна реакція. 19. Застосування за п. 10, де не здатний до реплікації або здатний до реплікації ослаблений вектор поксвірусу експресує зверх того продукт трансляції принаймні одного додаткового гена антигену, та де медикамент призначено для лікування або попередження мікобактеріальної хвороби та принаймні одної додаткової хвороби у пацієнта. 93665 4 20. Застосування за п. 10, де імуногенна композиція крім того індукує T-клітинну імунну реакцію проти вірусу, з якого є похідним не здатний до реплікації або здатний до реплікації ослаблений вектор поксвірусу. 21. Застосування за будь-яким з попередніх пунктів 10-20, де T-клітинна реакція є захисною проти хвороби, вибраної з групи, що складається з туберкульозу, прокази, інфекції Mycobacterium avium, нетуберкульозної мікобактеріальної інфекції, виразки Бурулі, інфекції або хвороби Mycobacterium bovis, віспи, мавпячої віспи, інфекції Mycobacterium paratuberculosis, запальної хвороби кишечнику, хвороби Крона, аутоімунної хвороби, раку та раку сечового міхура. 22. Застосування за будь-яким з попередніх пунктів 10-21, де пацієнта вибрано з групи, що складається з дітей, пацієнтів, які мають ВІЛінфекцію або СНІД, імунну недостатність або перенесли трансплантацію органу. 23. Застосування за будь-яким з попередніх пунктів 10-22, де пацієнт раніше був підданим дії Mycobacteria. 24. Застосування за п. 23, де пацієнт раніше був підданим дії M. tuberculosis. 25. Застосування за п. 23 або 24, де пацієнт є латентно інфікованим Mycobacteria. 26. Застосування за будь-яким з попередніх пунктів 10-25, де пацієнт був підданим попередньому лікуванню БЦЖ. 27. Застосування імуногенної композиції за п. 1 у виробництві медикаменту для лікування або попередження принаймні однієї хвороби індукуванням імунної реакції T-клітинної центральної пам‟яті у пацієнта, де медикамент застосовують з принаймні одним додатковим антигеном. 28. Застосування за п. 27, де T-клітинною імунною реакцією є реакція CCR7+. 29. Застосування за будь-яким з попередніх пунктів 27-28, де T-клітинна реакція є захисною проти хвороби, вибраної з групи, що складається з туберкульозу, прокази, інфекції Mycobacterium avium, нетуберкульозної мікобактеріальної інфекції, виразки Бурулі, інфекції або хвороби Mycobacterium bovis, віспи, мавпячої віспи, інфекції Mycobacterium paratuberculosis, запальної хвороби кишечнику, хвороби Крона, аутоімунної хвороби, раку та раку сечового міхура. 30. Застосування за будь-яким з попередніх пунктів 27-29, де пацієнта вибрано з групи, що складається з дітей, пацієнтів, які мають ВІЛінфекцію або СНІД, імунну недостатність або перенесли трансплантацію органу. 31. Застосування за будь-яким з попередніх пунктів 27-30, де пацієнт раніше був підданим дії Mycobacteria. 32. Застосування за п. 31, де пацієнт раніше був підданим дії M. tuberculosis. 33. Застосування за п. 31 або 32, де пацієнт є латентно інфікованим Mycobacteria. 34. Застосування за будь-яким з попередніх пунктів 27-33, де пацієнт був підданим попередньому лікуванню БЦЖ. 35. Векторна вакцина, що містить нереплікативний або реплікативний ослаблений вектор покс 5 93665 6 вірусу, що експресує трансляційний продукт нуклеотидної послідовності SEQ ID NO:4, що додатково містить PK C-кінцевий tag та TPA лідерну послідовність. 36. Векторна вакцина за п. 35, де не здатний до реплікації або здатний до реплікації ослаблений вектор поксвірусу експресує продукт трансляції нуклеотидної послідовності SEQ ID NO:5. 37. Векторна вакцина за п. 35 або п. 36, де не здатним до реплікації або здатним до реплікації ослабленим вектором поксвірусу є MVA. 38. Векторна вакцина за будь-яким з пп. 35-37, де не здатний до реплікації або здатний до реплікації ослаблений вектор поксвірусу експресує, крім того, трансляційний продукт принаймні одного додаткового гена антигену мікобактеріального біотипу. Даний винахід стосується способу генерування Т-клітинної імунної відповіді в організмі хазяїна. Спосіб включає стадію введення модифікованої вектором вакцини, що включає репликативний або нерепликативний ослаблений вірусний вектор, який експресує продукт трансляції мікобактеріального антигену 85А гену (також згадуваний тут як „Аg85А" ген). Всі публікації, патенти й заявки на патент, процитовані тут включені, як посилання. Передумови створення винаходу Туберкульоз викликається респіраторним патогеном Mycobacterium tuberculosis та є причиною смерті 2 мільйонів чоловік щороку, домінує у країнах, що розвиваються (http://www.who.int/gtb/publications/qlobrep01/index.h tml). Єдиною ліцензованою вакциною проти Mycobacterium tuberculosis - бацили CalmetteGuerin (БЦЖ) (Calmette, Б., С. Guerin. (1924) Ann. Inst. Pasteur. 38:371), є атенуйований штам Mycobacterium bovis, який є типовим для країн, що розвиваються, застосовується внутрішньошкірно як однократна доза новонародженим. Огляд багатьох досліджень вказує, що БЦЖ вакцинація є захисною проти менінгеального туберкульозу у дітей і системних форм захворювання. Однак, захисна ефективність є перемінною (у межах від 0-80 %) (Colditz, G. A. et al. (1994). JAMA 271:698) проти легеневого захворювання у дорослих, головної загальної причини летальності від туберкульозу і згодом убуває (Sterne, J. А. et al (1998) Int. J. Tuberc. Lung Dis. 2:200). Причина варіабельності нез'ясована. Навіть у цьому випадку, 80 % дітей в усім світі одержують БЦЖ щороку (http://www.who.in1/inf-fs/en/factl04.html). Mycobacterium tuberculosis - внутрішньоклітинний патоген, захисна ефективність проти якого пов'язана з підтримуванням сильної, опосередкованої клітинами відповіді на інфекцію, що залучає CD4 + й CD8 + Т-лімфоцити й здатність реагувати цитокінами Thl-типу, особливо IFN-г (Flynn, J. L, J. Chan. (2001) Annu. Rev. Immunol. 19:93). БЦЖ вакцинація індукує IFN-г-секретувальні Т-лімфоцити, переважно CD4 + фенотип Т-лімфоцитів, які перехресно реагують протеїнами М.tuberculosis (Launois P et al, (1994) Infection and Immunity 62(9):3679-87. Недавнє дослідження пропонує, що БЦЖ, доставлена парентерально може бути неспроможна індукувати імунні Т-клітинні імунні відповіді в слизуватій оболонці легенів, що може бути критичним для захисту від легеневого захворювання. Тому є потреба розвивати подальші вакцини проти мікобактеріальних захворюваннь. Стислий опис винаходу Несподівано було знайдено, що вірусні вектори, що експресують мікобактеріальний антиген 85А (Аg85А), можуть індукувати Т-клітинну імунну відповідь в організмі людини, коли застосовується у вигляді імуногенної композиції. Тому, винахід забезпечує спосіб індукування Т-клітинної імунної відповіді проти мікобактеріального антигену в організмі людини, що включає стадію застосування імуногенної композиції, яка включає репликативний або нерепликативний ослаблений вірусний вектор, який експресує продукт трансляції мікобактеріального Аg85А гену у організмі пацієнта. Переважно, імуногенна композиція - модифікована вектором вакцина. Цей новий підхід щодо вакцини значно поліпшує величину й тривалість Т-клітинної імунної відповіді. Переважно, Т-клітинна імунна відповідь - імунна відповідь Т-лімфоцитів пам'яті. 85А антиген (Ag85A) (N: Вступу. САА17868 й ВХ842584) - член групи Аg 85. Це - сімейство протеїнів, що включають Аg 85А, 85В, і 85С, що продукуються М.tuberculosis, БЦЖ, і багатьма іншими різновидами мікобактерій (Harth, G. et ah, (1996) Infect. Immun. 64:3038-3047). Антиген 85А (Ag85A) - високо консервативна антигенна детермінанта(епітоп) серед усіх інших видів мікобактерій у дослідженні на тваринах і людях. Аg 85А (Аg85А) кодується fbpA геном. 85А антиген (Аg85А) від M.tuberculosis наведений в SEQ ID NO: 1 і 2 тут). Недавні стратегії індукування поліпшених Тклітинних імунних відповідей в дослідженні туберкульозної вакцини використали технологію рекомбінантної ДНК, застосовуючи плазмідні, бактеріальні або вірусні вектори і 3 рекомбінантні протеїни для експресії антигенів M.tuberculosis. Вакцинація мишей Аg85А ДНК, підсиленою MVA-вектором експресії Аg85А, здається, надає ступінь захисту, еквівалентний БЦЖ після сенсибілізування M.tuberculosis (McShane, H. etah, (2002). Infect. Immun. 70:1623-1626). Однак, імунні відповіді, генеровані одиничною або повторною імунізацією тільки з рекомбінантним MVA вектором були слабкі. Для довготривалого захисту проти мікобактеріального захворювання, такого як туберкульоз, вважається важливим підтримати „Т-лімфоцити пам'яті", що може продовжити стимулювати захисний імунітет протягом багатьох десятиліть. Запам'ятовувальні імунні відповіді класично припускають реактивацію довгоживущих, антигенспецифічних Т-лімфоцитів, які походять безпосе 7 редньо від диференційованих ефекторних Т-клітин й існують в однорідно спокійних станах. Ефекторні і Т-лімфоцити пам'яті, як вважають, розподілені по всім тканинам організму, особливо на епітеліальних поверхнях (таких як sldn і кишечник), де патогени, імовірно, контактують. Т-лімфоцити пам'яті показують гетерогенність і включають принаймні дві субпопуляції, забезпечені різною мігруючою здатністю й ефекторною функцією (Reinhardt, R.L. et ah, (2001) Nature. 410, 101-105). Клітини першої субпопуляції подібні ефекторним клітинам, генерованим при первинній відповіді, в якій дефіцит рецепторів L-селектину й CCR7 лімфатичих вузлів і експресують рецептори для міграції в запалені тканини. Після повторного зіткнення з антигеном, ці „ефектори пам'яті Тклітин" (ТЕМ) можуть швидко продукувати IFN-г або IL-4, або здійснювати вивільнення попередньо депонованих. Клітини другої субпопуляції експресують L-селектин й CCR7 і мають дефіцит безпосередньої ефекторної функції. Ці „центральні Тлімфоцити пам'яті„ (ТСМ) мають низький поріг активації на повторне стимулювання вторинних лімфоїдних органів, проліферацію й диференціацію до ефекторів (lezzi, G. et at., (2001). J. Exp. Med. 193, 987-994). Дані винахідники знайшли, що реплікація ослабленого вірусного вектора, який експресує Ag 85A (Аg85А) (у цьому випадку, ілюстрованого з „MVA85A") може індукувати високірівні антигенспецифічного гама-інтерферону, що виділяється Т-лімфоцитами пам'яті - ефекторами пам'яті і центральними Т-лімфоцитами пам'яті - коли використовуються самостійно в БЦЖ на здорових волонтерах. Нові імунологічні дослідження щодо вимірювання й кількісного визначення Т-клітинної імунної відповіді були встановлені за останні 10 років. Дані винахідники використали гама- інтерферон (IFN- г) у ELISPOT дослідженні, як основному імунологічному зчитуванні для клінічних досліджень із MVA85A, оскільки секреція IFN- г від антигенспецифічних Т-лімфоцитів більш доступна, корелює із захистом від М.tuberculosis. Крім того, дослідження ELISPOT - дуже відновлюваний і чутливий спосіб кількісного визначення IFN-г що продукується антиген-специфічними Тлімфоцитами. Дані винахідники використали два дослідження ELISPOT: ex vivo (свіже) дослідження ELISPOT, у якому мононуклеари периферичної крові (РВМС) інкубували протягом 18 годин з антигеном, щоб визначити рівні CCR7-циркулюючих ефекторних Тлімфоцитів, і культуральне дослідження ELISPOT, у якому РВМС іккубували з антигеном протягом 10-14 днів, щоб виміряти рівні CCR7 + центральних 5 Т-лімфоцитів пам'яті (Godlcin й ін, JL 2002). Дані винахідники виявили, що вакцинація з MVA85A викликає сильну відповідь центральних Тлімфоцитів пам'яті на специфічний антиген 85А (Аg85А), що усе ще піддається виявленню через 3 тижні після вакцинації, коли відповідь циркулюючих ефекторних Т-лімфоцитів майже не виявляється. 93665 8 Це - перша демонстрація того, що довгострокова популяція центральних Т-лімфоцитів пам'яті у пацієнтів може бути значно збільшена призначенням імуногенної композиції, яка експресує мікобактеріальний антиген. Як використовується тут термін „Т-лімфоцит пам'яті" призначений, щоб включити обидва ССР7-(ефектор пам'яті Т-лімфоцитів) і CCR7 + (центральні Т-лімфоцити пам'яті) субпопуляції Тлімфоцитівв. Це визначення також включає обидва класи II-обмежений клас CD4 Т-лімфоцити пам'яті та клас І, обмежений CD 8 Т-лімфоцитами пам'яті. Переважно, Т-лімфоцити пам'яті, індуковані модифікованими вектором вакцинами винаходу характеризуються експресією на поверхні клітини CCR7 +. Вони згадані тут як центральні Тлімфоцити пам'яті. Переважно, відповідь Т-лімфоцитів пам'яті, індукована імуногенними композиціями винаходу захисна Т-клітинна імунна відповідь. Захисна імунна відповідь може бути виміряна імунологічним дослідженням секреції IFN-г, переважно від антиген-специфічних Т-лімфоцитів. Переважно, відповідь Т-лімфоцитів пам'яті - довготривала й зберігається протягом принаймні 1, 2, 5, 10, 15, 20, 25 або більше років. Найбільше переважно, захисна імунна відповідь довічна. Переважно, Аg85А ген експресований у вірусному векторі. Переважно, ген Аg85А експресований у нерепликативному або репликативному ослабленому вірусному векторі. Термін „модифіковані вектором вакцини" є відомим у даній галузі. Вектор, використовуваний у способі відповідно до винаходу - нерепликативний або репликативний ослаблений вірусний вектор. Термін „нерепликативний" або „репликативний ослаблений" як використовується тут означає нездатність до реплікації до будь-якого значного поширення в більшості нормальних людських клітин. Віруси, які є нерепликативними або репликативними ослабленими, можуть бути як природні (тобто вони можуть бути виділені як природні) або штучні, наприклад, розмножуючись in vitro або генетичними маніпуляціями), наприклад, делеції гена, що є критичним для реплікації. Взагалі буде один або кілька типів клітин, в яких віруси можуть рости, таких як CEF клітини для модифікованого вірусу Анкара (MVA). Загалом, вірусний вектор повинен бути здатний до стимулювання Тклітинної імунної відповіді. Приклади вірусних векторів, які є корисними в цьому контексті - вектори вірусу коров'ячої віспи, такі як MVA або NYVAC. Переважний вірусний вектор - штам вірусу коров'ячої віспи MVA або штам, отриманий від MVA. Альтернативи векторів коров'ячої віспи включають інші поксвірусні вектори, включаючи авіпокс вектори, такі як fowlpox або саnаryрох вектори. Особливо прийнятний, як avipox вектор - штам саnаrурох, відомий як ALVAC (комерційно доступний як Каnарох), і штами, отримані від ALVAC, і також штам fowlpox, відомий як FP9. Подальші альтернативи - альфавірусні вектори, аденовірусні вектори, герпевірусні вектори, флавівірусні вектори, ретровірусні вектори та вектори вірусу грипу. 9 Наприклад, вектором може бути нелюдський аденовірусний вектор. Несподівано було знайдено, що використання аденовірусного вектора викликає дуже сильну відповідь CD 8 Т-лімфоцита пам'яті на додаток до дуже сильної відповіді CD4 Т-лімфоцита пам'яті. Індукція відповіді CD8 і CD4 Т-лімфоцитів пам'яті тією же самою вакциною, імовірно, буде мати користь у профілактиці й лікуванні мікобактеріального захворювання. Спосіб індукування відповіді CD8 й CD4 Т-лімфоцита пам'яті проти антигену, використовуючи вектор аденовірусу, який експресує антиген або його імуногенний фрагмент - також включені у межі цієї заявки. Антиген, експресований вектором аденовірусу - переважно мікобактеріальний антиген, як описано вище, найбільше переважно Аg85А , але може альтернативно бути будь-яким іншим прийнятним антигеном. Також включено у межі винаходу використання аденовірусного вектора, який експресує антиген або його імуногенний фрагмент у виробництві медикаменту для індукування відповіді CD8 й CD4 Тлімфоцитів пам'яті проти антигену. Переважно, винахід забезпечує використання аденовірусного вектора, який експресує мікобактеріальний антиген або його імуногенний фрагмент у виробництві медикаменту для лікування або профілактики мікобактеріального захворювання. Антиген - переважно мікобактеріальний антиген, як описано вище, найбільш переважно - Аg85А, але може, альтернативно, може бути будь-яким іншим прийнятним антигеном. Є переважним, що вірусний вектор нездатний викликати серйозну інфекцію в організмі людини. Реплікація вірусу взагалі вимірюється двома способами: 1) синтезом ДНК та 2) вірусним титром. Більш точно, термін „нерепликативний або репликативний ослаблений", як використовується тут та як відноситься до поксвірусів, означає віруси, які задовольняють одному або обом наступним критеріям: 1) демонстрування 1 log(10 кратне) редукування синтезу ДНК у порівнянні з Копенгагським штамом вірусу коров'ячої віспи в MRC-5 клітинах (людська лінія клітин); 2) демонстрування 2 log редукування вірусного титру в HELA клітинах (людська лінія клітин) у порівнянні з Копенгагським штамом вірусу коров'ячої віспи. Приклади поксвірусів, які у межах цього визначення - MVA, NYVAC й avipox віруси, у той час як вірус, що є поза визначенням - атенуйований штам вірусу коров'ячої віспи М7. Винахід також забезпечує використання імуногенної композиції, що включає репликативний або нерепликативний ослаблений вірусний вектор, який експресує продукт трансляції мікобактеріальний Аg85А ген у виробництві медикамента для лікування або профілактики мікобактеріального захворювання в організмі людини. Переважно, імуногенна композиція - модифікована вектором вакцина. Імуногенна композиція й модифікована вектором вакцина діють шляхом індукування Т-клітинної імунної відповіді в організмі пацієнта. 93665 10 Вакцини відповідно до винаходу можуть або бути профілактичним засобом (тобто запобігати інфекції), постекспозиційним (тобто лікування після інфікування, але перед захворюванням) або терапевтичним (тобто лікувати захворювання), але типово будуть профілактичним засобом або постекспозиційним. Мікобактеріальні захворювання, які можуть лікуватися або підлягати профілактиці модифікованою вектором вакциною даного винаходу, включають; туберкульоз, лепра, інфекція Mycobacterium avium, нетуберкульозна мікобактеріальна інфекція, Buruli виразка, інфекція Mycobacterium bovis або захворювання, інфекція Mycobacterium paratuberculosis або пов'язане захворювання. Інші захворювання (тобто, немікобактеріальні захворювання) включають запальну хворобу кишечника, хворобу Крона, аутоімунне захворювання, рак, рак міхура, віспа й мавпяча віспа. Спеціалізований констракт вірусного вектора, може використовуватися, щоб сприяти одержанню й застосуванню модифікованої вектором вакцини. Усі модифіковані вектором констракти, описані тут, утворюють аспекти винаходу. Модифіковані вектором вакцини, що включають ці вірусні констракти, також включені як аспекти винаходу. Наприклад, один або більше генів антигену можуть бути укорочені у С-кінці або N-кінці гена. Це може мати ефект полегшення клонування й конструювання модифікованої вектором вакцини, і альтернативно, або додатково, може вести до збільшеної ефективності. Способи для укорочення будуть відомі фахівцям в даній галузі. Найпростіший спосіб робити укорочення цього типу - використання різних відомих способів генної інженерії, щоб видалити селективно кодовану послідовність нуклеїнової кислоти з обох кінців гена антигену, і потім вставити бажану кодовану послідовність у вірусний вектор. Наприклад, укорочення кандидата протеїну здійснюється, використовуючи 3' та/або 5‟ екзонуклеазні стратегії селективно, щоб зруйнувати 3' та/або 5' кінці кодованої нуклеинової кислоти, відповідно. Переважно, дикий ген типу 5 послідовності укорочений таким чином, що експресований антиген укорочений на 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 або більше амінокислот щодо первинного антигену. Найбільш переважно, ген антигену - Аg85А, що укорочений 15 амінокислотами на С-кінці щодо дикого типу Аg85А антигену (SEQ ID N0:3, продукт експресії SEQIDNO.-4). Антигени, прийнятні для використання у винаході, також включають фрагменти первинного антигену, за умови, що ті фрагменти мають антигенну детермінанту або епітоп сумісно з або є здатними імунологічно ідентифікуватися із первинним антигеном. Кодовані полінуклеотиди цих фрагментів є також прийнятними для використання в імуногенних композиціях й модифікованих вектором вакцинах винаходу. Як використовується тут, термін „фрагмент" відноситься до поліпептиду, що має амінокислотну послідовність, що є тією ж самою, як частина, але не вся, амінокислотної послідовності первинного 11 антигену, від якого це отримано або одним з їхніх функціональних еквівалентів. Фрагменти повинні включити принаймні n послідовні амінокислоти від послідовності й, залежно від специфічної послідовності, n - переважно -7 або більше (наприклад, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20 або більше). Маленькі фрагменти можуть утворювати антигенну детермінанту. Гени антигену винаходу можуть також кодувати варіанти або функціональні еквіваленти первинного антигену. Така молекула нуклеїнової кислоти може бути нативним варіантом, як, наприклад, нативний алельний варіант, або молекулою може бути варіант, що, не відомий, як нативний. Такі штучні варіанти молекули нуклеїнової кислоти можуть бути одержані способами мутагенезу, застосовуваними до молекул нуклеїнової кислоти, клітин або організмів. Серед варіантів щодо цього - варіанти, які відрізняються від вищезгаданих послідовностей гена антигену замінами нуклеотиду, делеціями або інсерціями. Заміни, делеції або інсерції можуть залучати один або більше нуклеотидів. Варіанти можуть змінюватися в кодованому або некодованому регіонах або обох. Варіації в регіонах кодування можуть приводити до консервативних або неконсервативних замін амінокислоти, делецій або інсерцій. Альтернативно або на додаток до використання укороченого гена, кодування гена антигену може включати кодування нуклеїновою кислотою міченого поліпептиду так, що це є ковалентно зв'язаним з антигеном при трансляції. Переважно мічений поліпептид вибраний із групи, що складається з мітки РК, мітки FLAG, мітки MYC, мітки полігістидину або будь-якої мітки, що може бути виявлена моноклональним антитілом. Інші приклади будуть ясні фахівцю в даній галузі. Якщо використовується, мітка РК, переважна послідовність - Pro-Asn-Pro-Leu-Gly-Leu-Asp. Мітка цього типу може полегшити виявлення експресії антигену, і клонів, що експресують антиген, і альтернативно або додатково, може вести до збільшень в ефективності. Кодваний нуклеїновою кислотою мічений поліпептид може бути розміщений так, що після трансляції, мітка розташована у С-кінці або N-кінці експресованого антигену або може бути внутрішньою щодо експресованого антигену. Переважно, мітка розташована у С-кінці експресованого антигену. В кодовані нуклеотиди лінкер послідовності може бути вставлений між нуклеїновою кислотою, що кодує мічений поліпептид й нуклеїновою кислотою, що кодує експресований антиген. Переважно, лінкер послідовності, коли експресований, включає амінокислоти Gly-Ser-lle. Більш переважно, амінокислоти Gly-Ser-lle вставлені між послідовністю Nкінця антигену й міткою експресованого антигену. Найбільш переважно, експресований антиген Аg85а (Аg85А), і мітка РК розташована у С-кінці Аg85а (Аg85А) гену. Кодований ген антигену може також включати лідерну послідовність. Лідерна послідовність може впливати на обробку первинного транскрипта до мРНК, стабільності мРНК або ефективності транс 93665 12 ляції. Переважно, лідерна послідовність покращує експресію та/або імуногенність антигену. Покращена імуногенність може бути визначена, наприклад, культуральним і ex vivo ELISPOT дослідженням. Збільшений рівень експресії може бути визначений, наприклад, використанням моноклонального антитіла для виявлення кількості продукованого протеїну. Переважно, експресія та/або імуногенність збільшуються 2-кратно, 3-кратно або більше, порівняно з антигеном, експресованим без лідерної послідовності. Приклад прийнятної лідерної послідовності -t-PA (тканинний активатор плазміногену) (Malm A.S. et al. (2000) Microbes Infect. 2000 Нпн;2(Й4): 1677-85). Переважно, констракт вірусного вектора включає С-кінцеву укорочену послідовність Аg85А, з'єднану з лідерною послідовністю ТРА. В подальшому переважному втіленні, вірусний вектор винаходу експресує С-кінцеву укорочену послідовність Аg85А, з'єднану з лідерною послідовністю ТРА й РК міченою послідовністю. Переважно, лідерна послідовність з'єднана з N-кінцем антигену, і мічена послідовність з'єднана або внутрішньо або з С-кінцем протеїну. В особливо переважному втіленні, констракт вірусного вектора включає кодований полінуклеотид Аg85а (Аg85А) С-кінці, укороченої 15 амінокислотами, з'єднаними з ТРА послідовністю й з міченим РК С-кінцем послідовності Pro-Asn-Pro-Leu-Leu-Gly-Leu-Asp, де залишки амінокислоти Gly-Ser-lle присутні між Ag85A послідовністю й міткою РК (SEQ ID N0:5). Переважно, продукт експресії вірусного вектора має амінокислотну послідовність SEQ ID N0:6. Захисний ефект Т-лімфоциту, відзначений винахідниками був винайдений, щоб бути особливо потужним, у людей, які були попередньо піддані експозиції мікобактеріального антигену. Стратегія гетерологічного головного підвищення імунізації індукує більш високі рівні відповідей Т-ефекторних клітин у тваринах і людях, ніж гомологічна ревакцинація тією ж самою вакциною (Schneider, J. et al. (1998) Nat. Med. 4, 397-402, McShane, H. et al (2001) Infect. Immun. 69, 681-686). Механізм, що лежить в основі поступової втрати ефективності БЦЖ, коли (новорожденовакцинований) індивідуум досягає 10-15 річного віку погано зрозумілі. Одне можливе припущення той імунітет, генерований БЦЖ, зникає, і індивідуум стає еквівалентим нативному організму, який може бути вакцинований новою вакциною, призначеною, для індукування первинного імунітету. Хоча повторна вакцинація БЦЖ, здається, далі не збільшує захист проти ТВ (ref Rodrigues L et al, Lancet 2005), введення БЦЖ у режимі гетерологічного базисного підсилення зберігало б захисні ефекти БЦЖ. Імуногенність і захисна ефективність ревакцинації БЦЖ з вірусними векторами, що експресують антиген 85А (Аg85А) у декількох моделях тварини були попередньо зареєстровані (Goonetilleke, N.P. et al. (2003) J. Immunol. 171, 1602-1609; Williams A et al, Infection and Immunity (73(6):3814-6), але індукція захисної відповіді Тлімфоцитів пам'яті не була зареєстрована. Тому, винахід також забезпечує спосіб підвищення Т-клітинної імунної відповіді в організмі лю 13 дини, що складається із стадії введення принаймні одного мікобактеріального антигену пацієнту в комбінації з модифікованою вектором вакциною, що включає репликативний або нерепликативний ослаблений вірусний вектор, який експресує продукт трансляції мікобактеріального 85а (Аg85А) гену. Переважно, Т-клітинна імунна відповідь імунна відповідь Т-лімфоцитів пам'яті. Винахід також забезпечує використання: (а) принаймні одного мікобактеріального антигену; і (b) модифікованої вектором вакцини, що включає нерепликативний або репликативний ослаблений вірусний вектор, який експресує продукт трансляції мікобактеріальний 85а (Аg85А) ген, у виробництві медикамента для призначення пацієнтові, для індукування Т-клітинної імунної відповіді. Модифікована вектором вакцина, що включає нерепликативний або репликативний ослаблений вірусний вектор, який експресує продукт трансляції мікобактеріального 85а (Аg85А) гену й мікобактеріальні антиген(и), може застосовуватися одночасно, послідовно або окремо. Наприклад, мікобактеріальний антиген(и) може застосовуватися, щоб активізувати організм пацієнта перед або після призначення модифікованої вектором вакцини, щоб підвищити імунну відповідь пацієнта щодо модифікованої вектором вакцини. Крім того, винахід також забезпечує спосіб індукування Т-клітинної імунної відповіді в організмі людини, що включає стадію застосування імуногенної композиції, що містить репликативний або нерепликативний ослаблений вірусний вектор, який експресує продукт трансляції мікобактеріального Аg85А гену, людині, причому пацієнт був підданий пре-експозиції принаймні одному мікобактеріальному антигену. Переважно, Т-клітинна імунна відповідь - імунна відповідь Т-лімфоциту пам'яті. Винахід також забезпечує використання імуногенної композиції, що включає модифіковану вектором вакцину, яка містить нерепликативний або репликативний ослаблений вірусний вектор, який експресує продукт трансляції мікобактеріального 85а (Аg85А ) гену у виробництві медикамента для лікування або профілактики мікобактеріального захворювання в організмі людини, що був підданий пре-експозиції мікобактеріального антигену. Мікобактеріальний антиген може бути від Mycobacterium tuberculosis та/або може бути від однієї або більше інших мікобактерій, таких як М. avium-intracellulare, M. kansasii, M. marinum та/або M.ulcerans. У випадку, коли пацієнт був підданий пре-експозиції тільки одному антигену, антиген може бути таким, що надає захисну імунну відповідь проти мікобактеріальної інфекції. В одному втіленні винаходу, антиген, якому пацієнт був підданий пре-експозиції - не є Аg85А . Альтернативно, або додатково, пацієнт, може бути підданий пре-експозиції однією або більше мікобактерій безпосередньо. Наприклад, преекспозиція пацієнта принаймні одним мікобактеріальним антигеном може включати попередню експозицію щодо Mycobacterium tuberculosis. Альтернативно, або додатково, пре-експозиція пацієнта принаймні одним мікобактеріальним антигеном 93665 14 може включати попередню експозицію мікобактеріями навколишнього середовища, наприклад, М. avium-intracellulare, M. kansasii, M. marinum та/або М. ulcerans. Переважно, пацієнт - латентно інфікований мікобактеріями. Наприклад, пацієнт, може бути підданий пре-експозиції Mycobacterium tuberculosis і бути латентно інфікований туберкульозом. Коли медикамент призначений для лікування латентно інфікованого мікобактерією пацієнта, лікування переважно спрямоване на ерадикацію мікобактеріальної інфекції. Альтернативно, або додатково, пре-експозиція може включати неонатальну або превакцинацію БЦЖ. Дані винахідники знайшли, що у волонтерів, які були попередньо вакциновані БЦЖ, і які потім одержували підсилювальну дозу модифікованої вектором вакцини представленого винаходу, були індуковані істотно більш високі рівні антигенспецифічних Т-лімфоцитів, що секретують інтерферон-гама і, через 24 тижні після вакцинації ці рівні були в 5-30 разів більше, чим при вакцинації тільки однією БЦЖ Відповідно, цей аспект винаходу забезпечує спосіб індукування Т-клітинної імунної відповіді в організмі людини, що включає стадію експозиції пацієнта принаймні одним мікобактеріальним антигеном, і додаткову імунну відповідь, застосовуючи композицію для ревакцинації, що містить імуногенну композицію, що включає нерепликативний або репликативний ослаблений вірусний вектор, який експресує продукт трансляції мікобактеріального 85а (Аg85А ) гену. Цей аспект винаходу також стосується способу генерації Т-клітинної імунної відповіді в організмі людини, що включає стадії: і) експозиції пацієнта принаймні одним мікобактеріальним антигеном; іі) введення згадуваному пацієнту принаймні однієї дози композиції для ревакцинації, що включає модифіковану вектором вакцину, яка містить нерепликативний або репликативний ослаблений вірусний вектор, який експресує продукт трансляції мікобактеріального 85а (Аg85А ) гену. В одному втіленні винаходу, де пацієнт підданий експозиції тільки одному мікобактеріальному антигену в стадії і), антиген є антигеном, що надає захисну імунну відповідь, але - не Аg85А . Стадія і) може здійснена на пацієнті в будьякому віці, наприклад, в неонатальному, протягом ранньої стадії розвитку, протягом пубертатного періоду або протягом дорослого стану. Переважно, пацієнт - новонароджений, підданий експозиції принаймні одного мікобактеріального антигену. Призначення імуногенної композиції може здійснюватися принаймні через 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 або 10 або більше тижнів або через 0.25, 0.5, 0.75, 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35 або 40, або більше років після пре-експозиції принаймні одному мікобактеріальному антигену. Переважно, стадія і) здійснювана, коли пацієнт перебуває в ранній стадії розвитку, стадія іі) здійснюється протягом ранньої стадії розвитку або пубертатного періоду. Коли стадія іі) включає застосування, більше, чим однієї дози композиції для ревакцинації пацієнтові, більше, чим одна доза може застосовувати 15 ся протягом короткого періоду часу за тривалий період часу. Наприклад, дози композиції для ревакцинації можуть застосовуватися за періоди: години, дні, тижні, місяці або роки. Наприклад, друга доза ревакцинації може застосовуватися між 0.5 й 24 годинами після першої дози ревакцинації, між 1-7 днів після першої дози ревакцинації, між 1 тижнем і через 1 місяць після першої дози ревакцинації, між 1 місяцем і через 6 місяців після першої дози ревакцинації, між 6 місяцями й 1-роком після першої дози ревакцинації, або між 1 - 2, 2 до 5, 6 - 10, або через більше, чим 10 років після першої дози ревакцинації. Ці часові інтервали переважно також накладають mutatis mutandis до періоду між будь-якими наступними дозами. У другому аспекті винаходу, на додаток до імунної відповіді, індукованої проти 85а (Аg85А ) антигену, вірусний вектор стимулює векторспецифічну Т-лімфоцитарну відповідь. Відповідно до цього аспекту винаходу, призначення модифікованої вектором вакцини винаходу сприяє Тклітинній імунній відповіді проти вірусу, з якого вірусний вектор отриманий. Наприклад, використання MVA вектора в модифікованій вектором вакцині винаходу сприяє Т-лімфоцитарній імунній відповіді проти вірусу коров'ячої віспи. Переважно, ця Т-клітинна імунна відповідь - захисна Т-клітинна імунна відповідь. Про цього типу результат не повідомлено попередньо і є чіткі переваги в тому, що модифікована вектором вакцина грає подвійну роль; по-перше, в захисті проти мікобактеріальних захворювань, і, по-друге, в захисті проти захворювання, опосередкованого вірусами стосовно вектора. У випадку MVA вектора, таке захворювання віспа. Вірусні захворювання, які можуть піддаватися лікуванню або профілактиці модифікованою вектором вакциною представленого винаходу, будуть відомі фахівцям в даній галузі; приклади включають віспу, мавпячу віспу і диссеміновану інфекцію коров'ячої віспи. Відповідно, цей аспект винаходу забезпечує спосіб індукування Т-клітинної імунної відповіді проти мікобактеріального антигену й вірусу в організмі людини, що включає стадію застосування імуногенної композиції, що містить репликативний або нерепликативний ослаблений вірусний вектор, який експресує продукт трансляції мікобактеріального Аg85А гену у організмі людини. Переважно, Т-клітинна імунна відповідь - відповідь Тлімфоцитів пам'яті. Цей аспект винаходу також забезпечує використання імуногенної композиції, що включає нерепликативний або репликативний ослаблений вірусний вектор, який експресує продукт трансляції мікобактеріального Аg85А гену, у виробництві медикамента для індукування Т-клітинної імунної відповіді проти мікобактеріального антигену й вірусу в організмі людини. Вакцини винаходу поставляють імунологічно ефективну кількість принаймні одного антигена пацієнтові. Під „імунологічно ефективна кількість", розуміють, що призначення тієї кількості індивідуумові, або в однократній дозі або як частина серій, 93665 16 є ефективними для лікування або профілактики. Ця кількість змінюється залежно від здоров'я й фізичного стану індивідуума, що підлягає лікуванню, віку, здатності імунної системи індивідуума, ступені бажаного захисту, утворення вакцини, оцінювання лікування медичного стану, і інших, пов'язаних з лікуванням факторів. Очікується, що кількість буде спадати у відносно широкому діапазоні, що може бути визначено звичайними дослідженнями. У третьому аспекті винаходу, вірусний вектор може додатково експресувати продукт трансляції одного або більше додаткових генів антигену, які можуть використовуватися для індукування антиген-специфічної імунної відповіді проти таких додаткових антигенів. Імунна відповідь може бути CD8 +, CD4 + та/або гуморальною імунною відповіддю. Переважно, один або більше додаткових генів антигену отримані від Mycobacterium tuberculosis, Plasmodium sp., вірусу грипу, ВІЛ, вірусу гепатиту С, цитомегаловірусу, людського папіломавірусу, малярії, лейшманій або, переважно, будь-яких видів мікобактерій. Переважно, один або більше додаткових генів антигену кодують антиген, вибраний із групи, що складається з; антигену 85 сімейств антигенів від будь-якої Mycobacterium або будь-якого антигену, експресованого Мусоbасtеrium spp.; більш переважно, одного або більше латентних антигенів, таких як 16kDa антиген або зв'язаний з гепарином гемаглютинін (НВНА) або ESAT6 або вбудовувальний протеїн, відомий як 72F. Це також передбачено, що додатковий антиген може бути ендогенно виділеним, таким, що індукує імунну відповідь безпосередньо проти пухлини. Ендогенно виділені антигени, які є прийнятними для використання в представленому винаході - людський протеїн теплового шоку й туморасоційовані антигени, такі як СЕА, PSA, Muc-1, Неr2nеu. Вірусний вектор може бути призначений, щоб експресувати Аg85А ген і один або більше додаткових генів антигену як низка антигенних детермінант(епітопів). Переважно, епітопи(епітопи) в низці множини епітопів зв'язані разом без проміжних послідовностей так, щоб непотрібні нуклеїнові кислоти та/або амінокислотний матеріал анульвані. Створення низки антигенних детермінант може переважно досягатися, використовуючи констракт рекомбінантної ДНК, що кодує амінокислотну послідовність низки антигенних детермінант, з ДНК, що кодує Аg85А у тій же самій рамці зчитування, що і ДНК, яка кодує додатковий антиген (и). Альтернативно, Аg85А і додатковий антиген (и) можуть бути експресовані, як окремі поліпептиди. Цей аспект винаходу також забезпечує використання модифікованої вектором вакцини, що включає репликативний або нерепликативний ослаблений вірусний вектор, який експресує продукт трансляції мікобактеріального Аg85А гену і продукт трансляції принаймні одного додаткового антигену або І ген епітопа у виробництві медикамента для лікування або профілактики і мікобактеріального захворювання, і принаймні одного дода 17 ткового захворювання в організмі людини шляхом індукування Т-клітинної відповіді. Відповідно до цього аспекту винаходу, модифікована вектором вакцина може використовуватися для захисту проти мікобактеріального захворювання, і проти одного або більше захворювань, вибраних із групи, що складається з ВІЛ, малярії і віспи шляхом індукції Т-клітинної імунної відповіді в організмі людини, переважно імунної відповіді Тлімфоцита пам'яті. Хоча модифікована вектором вакцина представленого винаходу може використовуватися ізольвано, може також бути об'єднана з іншими вакцинаціям або терапевтичними режимами для лікування або профілактики додаткового захворювання. Тому, так само як забезпечення модифікованих вектором вакцин, як описано вище, винахід забезпечує композицію, що включає модифіковану вектором вакцину винаходу й один або більше додаткових антигенів або епітопів, отриманих від патогена. Антигени й епітопи, прийнятні для використання в композиціях винаходу можуть мати бактеріальне або вірусне походження. Прийнятні антигени можуть бути класифіковані як протеїнові антигени, вуглеводні антигени або глікокон'юговані антигени. Композиції винаходу можуть включати один або більше додаткових антигенів або епітопів. Прикладами є: • різний мікобактеріальний антиген або епітоп. • ВІЛ антиген або епітоп. • антиген плазмодія або антигенна детермінанта(епітоп). • антиген малярії або антигенна детермінанта(епітоп). • сахаридний антиген від Streptococcus pneumoniae. • протеїновий антиген від S.pneumoniae (наприклад, від PhtA, PhtB, PhtE, PhtD, SpsA, LytB, LytC, LytA, Spl25, SplOI, Spl28, Spl30 й Spl33). • антиген або антигенна детермінанта(епітоп) від вірусів гепатиту, наприклад, інактивований вірус. • антиген або антигенна детермінанта(епітоп) від вірусу гепатиту В, наприклад поверхневі та/або основні антигени. • антиген або антигенна детермінанта(епітоп) від вірусу гепатиту С • сахаридний антиген від Haemophilus influenzae тип b. • антиген (и) поліомієліту або епітопи, такі як IPV. • вакцина дифтерії або її складові епітопи, або антигени, або анатоксин. • вакцина правця або її складові епітопи або антигени або анатоксин. • антигени або епітопи кіру, свинки та/або краснухи. • антиген(и) грипу або епітопи, такі як гемаглютинін та/або поверхневі протеїни нейрамінідази. Антиген грипу може бути вибраний з пандемичного штаму, наприклад, із пташиного грипу, наприклад, штам H5N1. • антиген або антигенна детермінанта(епітоп) від Staphylococcus aureus. 93665 18 • антиген раку або антигенна детермінанта(епітоп). У випадку використання сахаридного антигену, останній переважно кон'югований з носієм, щоб поліпшити імуногенність. Токсичні протеїнові антигени можуть нейтралізуватися, де необхідно, наприклад хімічними та/або генетичними засобами. Сахаридні антигени перебувають переважно у формі кон'югатів. Переважні протеїни-носії для кон'югатів - бактеріальні токсини або анатоксини, такі як анатоксин дифтерії або правцевий анатоксин. CRM197 мутант дифтерийного токсину - особливо переважний носій, як анатоксин дифтерії. Інші прийнятні протеїни - носії включають зовнішню мембрану протеїну N.meningitidis, синтетичні пептиди, протеїни теплового шоку, протеїни коклюшу, цитокіни, лімфокіни, гормони, фактори росту, штучні протеїни, що включають різнорідні людські CD4+ епітопи Т-лімфоцита від різних, отриманих від патогенів, антигенів, таких як N19 протеїн, протеїн D від Н. influenzae, пневмококовий поверхневий протеїн PspA, пневмолізин, протеїни поглинання заліза, токсин А або В від С difficile, і т.д. Додаткові антигени в композиції будуть звичайно присутні в концентрації принаймні мГ/мл кожний. Загалом, концентрація будь-якого даного антигену буде достатня, щоб виявити імунну відповідь проти того антигену. Як альтернатива до використання додаткових протеїнових антигенів у суміші, кодований нуклеїновою кислотою антиген може використовуватися. Протеїнові компоненти суміші можуть таким способом бути замінені нуклеїнової кислотою (переважно ДНК наприклад у формі плазмиди), що кодує протеїн. Точно так само композиції винаходу можуть включати протеїни, які імітують сахаридні антигени, наприклад мімотопи або анти-ідіотипічні антитіла. Крім того, винахід також забезпечує композицію, що включає модифіковану вектором вакцину винаходу й одну або більше антимікробних сполук. Приклади антимікробних сполук, прийнятних для використання у композиціях винаходу - протитуберкульозні хіміопрепарати, такі як рифампіцин, ізоніазид, етамбутол, піразинамід і т.д. Відповідно, винахід забезпечує спосіб підвищення Т-клітинної імунної відповіді проти принаймні одного антигену в організмі людини, що включає стадію застосування модифікованої вектором вакцини, що містить нерепликативний або репликативний ослаблений вірусний вектор, який експресує продукт трансляції мікобактеріального Ад 85А (Аg85А ) гена, у комбінації з принаймні одним додатковим антигеном та/або антимікробним засобом пацієнтові. Винахід також забезпечує використання: (а) модифікованої вектором вакцини, що включає нерепликативний або репликативний ослаблений вірусний вектор, який експресує продукт трансляції мікобактеріального Аg85А (Аg85А ) гену; і (b) принаймні одного додаткового антигена та/або антимікробного засобу, у виробництві медикамента для призначення людині, для індукування Тклітинної імунної відповіді. 19 Модифікована вектором вакцина, що включає нерепликативний або репликативний ослаблений вірусний вектор, який експресує продукт трансляції мікобактеріального Ag 85A (Аg85А ) гену і додатковий антиген(и) та/або антиантимікробні засоби, може призначатися одночасно, послідовно або окремо. Наприклад, модифікована вектором вакцина може застосовуватися, щоб активізувати пацієнта перед призначенням антигену(ів)/антиантимікробного засобу (ів) або після призначення антигену (ів), щоб підвищити імунну відповідь пацієнта до того антигену. Модифікована вектором вакцина й антиген(и)/антиантимікробний засіб переважно застосовуються у суміші. Винахід також забезпечує використання принаймні одного антигену та/або антиантимікробного засобу у виробництві медикамента для індукуваня Т-клітинної імунної відповіді у пацієнта, де медикамент застосовується з модифікованою вектором вакциною, що включає репликативний або нерепликативний ослаблений вірусний вектор, який експресує продукт трансляції мікобактеріального Аg85А (Аg85А ) гену. Точно так само, винахід забезпечує використання модифікованої вектором вакцини, що включає репликативний або нерепликативний ослаблений вірусний вектор, який експресує продукт трансляції мікобактеріального Ag 85A (Аg85А ) гену у виробництві медикамента для індукування Т-клітинної імунної відповіді у пацієнта, де медикамент застосовується принаймні з одним додатковим антигеном та/або антиантимікробним засобом. Винахід також забезпечує використання принаймні одного антигену та/або антиантимікробного засобу у виробництві медикамента для індукування Т-клітинної імунної відповіді в організмі пацієнта, причому пацієнт був попередньо вакцинований модифікованою вектором вакциною, що включає не здатний до реплікації або здатний до реплікації ослаблений вірусний вектор, який експресує продукт трансляції мікобактеріального Аg85А гену. Винахід також забезпечує використання модифікованої вектором вакцини, що включає нерепликативний або репликативний ослаблений вірусний вектор, який експресує продукт трансляції мікобактеріального Ад85 гену у виробництві медикамента для індукування Т-клітинної імунної відповіді в організмі пацієнта, причому пацієнт був попередньо вакцинований принаймні одним антигеном та/або антиантимікробним засобом. Даний винахід може використовуватися для індукування або поліпшення різних імунних відповідей, як описано вище. Зокрема, ціль цього винаходу - ідентифікувати ефективні засоби імунізації проти захворювань, у які залучені мікобактерії. Такі захворювання включають хворобу Хансена, туберкульоз, остеомієліт, хворобу Крона, лепру, лімфаденіт, хворобу Джона. Вище описані аспекти винаходу застосовні до безлічі різних пацієнтів, включаючи наприклад, дітей, пацієнти, які мають ВІЛ, СНІД, є імунокомпроментованими/імуносупресованими, або які перенесли трансплантацію органа, трансплантацію кісткового мозку або, які страждають від генетичних імунодефіцитів. У випадку використання вак 93665 20 цини для профілактики, пацієнт може бути дитиною (наприклад, новонароджений або дитина 1-5 річного віку), старша дитина або підліток; де вакцина для терапевтичного використання, пацієнт переважно дорослий. Вакцина, призначена для дітей, може також застосовуватися дорослим, наприклад, щоб оцінити безпечність, дозування, імуногенність, і т.д. Винахід також забезпечує фармацевтичну композицію, що включає (1) імуногенну композицію винаходу й (2) фармацевтично прийнятний носій. Винахід забезпечує спосіб одержання фармацевтичного продукту, що включає стадії: (і) одержання модифікованої вектором вакцини винаходу; і (іі) змішування імуногенної композиції з одним або більше фармацевтично прийнятними носіями. Носій (2) може бути будь-якою субстанцією, що самостійно не викликає продукування антитіл, шкідливих для пацієнта, який одержує композицію, і що може застосовуватися без неспецифічної токсичності. Прийнятні носії можуть бути макромолекулами, що повільно метаболізуються, такі як протеїни, полісахариди, полімолочні кислоти, полігліколеві кислоти, полімерні амінокислоти, амінокислотні співполімери, і інактивовані вірусні частки. Такі носії відомі фахівцям в даній галузі. Фармацевтично прийнятні носії можуть включати рідини, такі як вода, сольовий розчин, гліцерин й етанол. Допоміжні субстанції, такі як зволоджувачі або емульгатори, рН буфери і т.п., можуть також бути присутні таких носіях. Стабілізатори, такі як трегалоза або субстанції, які сприяють гідросолюбільності цукру при склоутворенні при температурі навколишнього середовища можуть також бути присутні. Останні включають використання змішаної технології стабілізації розчинного скла у форматі мікросфер, суспендованих в перфторкабонових рідинах. Ліпосоми - також прийнятні носії. Повне обговорення фармацевтичних носіїв доступне у Gennaro (2000) Remington: The Science and Practice of Pharmacy. 20th ed., ISBN: 0683306472 Фармацевтичні композиції винаходу можуть також засовуватися профілактично, наприклад, в ситуації, коли очікується контакт із мікроорганізмами й де розвиток інфекції повинен бути попереджений. Наприклад, композиція може застосовуватися перед хірургічним втручанням. Фармацевтична композиція є переважно стерильною. Вона є переважно апірогенною. Вона є переважно зебуферованою, рН між 6 і 8, взагалі приблизно рН 7. Переважно, композиція для людей є ізотонічною. Композиції винаходу можуть застосовуватися багатьма різними шляхами введення. Певні шляхи введення можуть бути переважними для конкретних композицій, щоб генерувати більш ефективну відповідь, або, для зменшення імовірних побічних ефектів або для більш легкого введення. Наприклад, композиції, використовувані в цьому винаході можуть застосовуватися будьякими шляхами введення, включаючи, але не обмежуючись наступними: оральний, внутрішньовенний, внутрішньом'язовий, внутріартеріальний, інтрамедулярний, інтратекальний, інтравентрику 21 лярний, трансдермальний або черезшкірні повторні аплікації, підшкірний, інтраперитонеальний, інтраназальний, ентеральний, місцевий, під'язичний, інтравагінальний або ректальний. Композиції можуть бути одержані для інтраназального введення, як назальний спрей, носові краплі, гель або порошок, ін'єкції, як розчини або суспензії; тверді форми, прийнятні для розчину або суспензії в рідких носіях перед ін'єкцією можуть також бути одержані. Безпосередня доставка композиций буде взагалі досягнута ін'єкцією, як, наприклад, підшкірно, інтраперитонеально, внутрішньовенно або внутрішньом'язово, інтраназально, або доставлена до інтестиціальної поверхні тканини. Дозування може бути у вигляді однократної багатократних доз. Різні аспекти й втілення представленого винаходу будуть тепер описані більш докладно за допомогою приклада, з посиланням на наступні фігури: Короткий Опис Фігур Фігура 1: Медіана IFN-Y ELISPOT відповіді після вакцинації в кожній групі вакцинації: БЦЖ самостійно; MVA85A самостійно; БЦЖ основна, підсилена MVA85A, (а) шкала часу для вакцинацій (тижні) у кожній групі; (b) відповідь очищеного протеїну похідного туберкуліну (PPD); відповідь очищеного антигену 85 (Ag85A); (d) сумарні об'єднані відповіді пептиду; (e) для кожного із цих трьох вимірюваних антигенів, відповіді між кожною вакцинною групою в кожному періоді часу були порівняні, використовуючи Mann-Whitney статистичний аналіз. Статистично значні порівняння позначені; (f) показ антигенної детермінанти(епітопа) Тлімфоцита після підсиленої MVA в БЦЖ вакцинованих індивідуумів. Всі індивідуальні відповіді пептиду були повністю анульовані деплецією Тлімфоцита CD4 +; Фігура 2: ELISPOT скринінг відповіді культури крові щодо M.tb очищеного протеїну похідного туберкуліну (PPD); M.avium (PPD) й рекомбінантні антигени 85А (Аg85А ); 4 волонтери в дослідженні MVA85A самостійно, до вакцинації; кожен волонтер ідентифікований кодом ТХХХХХХ, де перші три X відповідають номеру дослідження, і останні три X відповідають N волонтера, наприклад, Т002022 означає, що Т002 - Номер дослідження, і 022 - Номер волонтера; Фігура 3: Культуральна (маркіровка „культура") і ex vivo ELISPOT відповіді щодо пулу Аg85А пептидів (маркіровані верхніми регістрами букв) у п'ятьох волонтерів (кожен ідентифікований кодом ТХХХХ, де ХХХХ - чотирьохзначне число, одна цифра відповідає номеру дослідження й цифри два, три й чотири відповідають номеру волонтера, наприклад, Т2003 означає, що Т2 -номер дослідження й 003 - номер волонтера (Т2, той же самий як Т002 у Фіг. 2 вище)) через три тижні після призначення MVA85A, як окремої імунізації. Поствакцинальні відповіді дуже високі й більш вищі, ніж превакцинальні відповіді. Волонтери не були попередньо вакциновані БЦЖ; Фігура 4: Розвиток відповідей Т-лімфоцита на MVA-Lac-z, використовуваний, як антиген у ex vivo ELISPOT дослідженні в MVA-85A імунізованих 93665 22 здорових волонтерів, імунізованих один раз у тиждень. Волонтери були попередньо вакциновані БЦЖ; Фігура 5 (а) Медіана Elispot відповіді на PPD, рекомбінантний антиген 85А (Аg85А ) і сумарний пептидний пул антигену 85А (Аg85А ) після однократної вакцинації MVA85A у латентно інфікованих M.tb суб'єктів; Фігура 5 (b). Порівняння індукованих MVA85A відповідей сумарного пептидного пулу антигену 85А (Аg85А ) у суб'єктів, вакцинованих базисною БЦЖ (Т005, тобто, дослідження 5; див. приклад 1) і M.tb латентно інфікованих суб'єктів (Т007, тобто, дослідження 7); Фігура 5 (с). Порівняння індукованих MVA85A відповідей рекомбінантного антигену 85А (Аg85А ) у суб'єктів, вакцинованих базисною БЦЖ (Т005) і M.tb латентно інфікованих суб'єктів (Т007); Фігура 6а: Персистенція індукованих MVA85A імунних відповідей протягом принаймні 1-року після вакцинації в групі з тривалим (більше, ніж 10 років) інтервалом між базисною (БЦЖ) і підсиленою (MVA85A); Фігура 6 (b): Персистенція індукованих MVA85A імунних відповідей протягом принаймні 1року після вакцинації в групі з коротким (1 міс.) інтервалом між базисною (БЦЖ) і підсиленою (MVA85A); Фігура 7 (а) Дефіцит кореляції між інтервалом між БЦЖ й MVA85A вакцинаціями й 1 тижнем після MVA85A Т-клітинних імунних відповідей на антиген 85А (Аg85А ) сумарного пептидного пулу; Фігура 7 (b) Дефіцит кореляції між інтервалом між БЦЖ й MVA85A вакцинаціям й 24 тижнями після MVA85A Т-клітинних імунних відповідей на антиген 85А (Аg85А ) сумарного пептидного пулу; Фігура 8а показує середні рівні поствакцинального IFN-Y; Фігура 8b показує середні постсенсибілізаційні рівні IFN-г; Фігура 9 (а) показує ex vivo IFN-Y Elispot відповіді на MVA85A в БЦЖ нативних британських волонтерах; і Фігура 9 (b) показує ex vivo IFN-Y Elispot відповіді на MVA85A в БЦЖ нативних гамбійских волонтерах. Приклади Приклад 1 MVA85A вакцина Конструкція MVA85A було попередньо описана (McShane, З. et al. (2002) Infect. Immun. 70, 1623-1626). Клінічний клас MVA85A виготовляли відповідно до гарного виробничого практичного стандарту Impfstoffwerke Dessau-Tornau. Медичний і стоматологічний сертифікати були видані регуляторним органом медицини і медичних продуктів, Лондон, для використання MVA85A в клінічних дослідженнях. Клінічні дослідження Волонтери були завербовані на дослідження імунізації відповідно до протоколів, схвалених Оксфордширским Комітетом Етики Дослідження й зареєстровувалися тільки після одержання письмової згоди на основі повної інформації. Віковий діапазон для включення був 18-55, і всі волонтери піддавалися скринінгу на серонегативність щодо 23 ВІЛ, HBV й HCV. Звичайні лабораторні гематологічні і біохімічні дослідження були зроблені до вакцинації, і всі показники були в нормальних межах. Всі волонтери були спостерігалися протягом 6 місяців, із дослідженнями зразків крові, взятими у регулярні періоди часу. Хто одержав MVA85A імунізацію, заповнювали щоденник - місцеві і системні побічні ефекти і температури тіла протягом 7 днів після вакцинації. Вакцинація Перші два дослідження проводилися на БЦЖ нативних здорових волонтерах, як визначено, використовуючи Heaf тест. Heaf тест включає розміщення очищеного протеїну похідного туберкуліну (PPD) на шкірі й потім, використовуючи перфоратор для одержання множинних пункцій. Позитивна відповідь - більше, ніж 4 папули на місці пункції протягом 72 годин. Позитивний шкірний тестпоказник активної інфекції туберкульозу або попередньої БЦЖ вакцинації. Волонтери з негативним (Ступінь 0) Heaf тестом (еквівалент шкірній пробі туберкуліну 0 мм) були вакциновані будь-якою БЦЖ (однократна імунізація БЦЖ, Glaxo штам, 100 мл, внутрішньошкірно, n = 11) або MVA85A (5 x 107 pfu, внутрішньошкірно, 2 імунізації, з інтервалом 3 тижні, n =14). У третьому дослідженні, попередньо вакциновані БЦЖ, були згруповані (n = 17). Медіана часу між БЦЖ вакцинаціями й імунізацією MVA85A склала 18 років (діапазон 0.5-38 років). Волонтери з Heaf тестом не більше, ніж ступінь 2 (еквівалент шкірній пробі туберкуліну 90 % для CD8 + Тлімфоцитів і > 97 % для CD4 + Т-лімфоцитів (дані не показані). Аналіз імуногенності ELISPOT дані були проаналізовані, віднімаючи середнє число плям у живильному середовищі й клітинах самостійно у контрольних лунках від середньої кількості плям у лунках з антигенами або пулом пептидів і клітинами. Кількість менше, ніж 5 плям/лунка ігнорувалась. Лунку враховували позитивною, якщо кількість була принаймні подвоєна, ніж у негативних контрольних лунках і принаймні 5 плям більше, ніж у негативних контрольних лунках. Для лунок пептидного пулу, результати були сумарними через усі пептидні пула для кожного волонтера в кожний період часу. Наприклад, де є 7 пептидних пул, кожний містить 9-10 пептидів, кожен пул тестували у подвійному екземплярі. Розраховували середнє цього дубліката для кожного пулу, і віднімали середнє негативної контрольної лунки, одержуючи результат для цього пулу. Результати для 7 індивідуальних пул потім додавали разом. Це буде потенційна подвійна кількість Тлімфоцитів, що відповідає кожному з 10-мерних регіонів накладення, які зустрічаються у двох пулах із суміжними пептидами. Статистичний аналіз Дисперсійний аналіз для повторюваних вимірів, використовуючи базисний результат при скриніну як коваріація здійснювали на логарифмічно трансформованих даних, щоб порівняти між групами. Потім використовували дослідження MannWhitney для усіх порівнянь між групами й використовували Wilcoxon тест для парного порівняння скринінгу, і зразки 24 тижнів в БЦЖ базовій підсиленій MVA85 А групі. Культуральний спосіб ELISPOT Для культурального ELISPOT, 1 x 106 кріоконсервованого РВМС стимулювали з 20 u.g/ml M.tb PPD („PPD-T"), M.avium PPD („PPD-A") або з 10 ug/ml рекомбінантного антигену 85А (Ag85A) у 24лунковій пластині. Після 3-денного інкубаційного періоду при +37 °С в 5 % атмосфері СО2, 500 ul супернатанту клітинної культури вилучали й додавали 5 IU/мол Lymphocult-T (Біологічний тест, Dreieich, Німеччина) у R10. Це було повторено на 7-й день. На 9 день клітини промивали три рази і ліві залишали на ніч при +37 °С в 5 % атмосфері 25 93665 СО2 в R10. На 10-й день, клітини промивали й ресуспендували в 2мл R10, 50 ul клітинних культур (2.5 х, 104 із первинних клітин) переміщали до дублікатів лунок ELISPOT і стимулювалися протягом 18 годин з PPD-T 20 ug/ml, PPD-A 20 og/ml й Ag85A 10 ug/ml. ELISPOT пластину потім обробляли, як вищеописано. Результати Імунізація з MVA85A була безпечною і добре толерантною (Таблиця 1). Порівнювали кінетику й величину антиген-специфічної Т-клітинної імунної відповіді, індукованої вакцинацією тільки БЦЖ (самостійно), MVA85A самостійно й БЦЖбазисною М\/А85А-підсиленою. Всі три режими вакцинації викликають значні імунні відповіді, використовуючи або PPD-T, протеїн антигену 85 (Аg85А ) або накладні пептиди від антигену 85А (Аg85А ) як антиген у дослідженнях (Таблиця 2, Фігура 1). Був значний основний результат вакцини в PPD-T (F = 3.624; С = 0.037), антигену 85 Локальні Системніа а Побічні ефекти Гіперемія Прурит Біль Індурація Гіпертерміяb Грипоподібні симптоми Артралгія Головний біль Міалгія Нудота Вазо-вагальне синкопе Зміни в гематології/біохімії 26 (Ag85A) (F = 16.605; С