Кон’югати інсуліноподібного фактора росту-1 (іфр-1) і поліетиленгліколю

1. Кон'югат, що включає варіант інсуліноподібного фактора росту І (ІФР-І) і поліетиленгліколь (ПЕГ), який відрізняється тим, що зазначений варіант ІФР-І містить заміни (заміну) амінокислот у положеннях 27, 37, 65, 68 у послідовності вихідного ІФР-I таким чином, що одна або декілька амінокислот у положеннях 37, 65, 68 є лізином (К), а 2 (19) 1 3 93666 4 12. Фармацевтична композиція, що включає лізинПЕГильований варіант ІФР-І, що містить заміну (заміни) амінокислоти у положеннях 27, 37, 65, 68 в амінокислотній послідовності вихідного ІФР-І, з яких одна або декілька амінокислот у положеннях 37, 65, 68 є лізином (К), амінокислота в положенні 27 є полярною амінокислотою, але не лізином, причому зазначений ПЕГ є кон'югованим із зазначеним варіантом ІФР-І по первинній аміногрупі (аміногрупам), а варіант ІФР-І є ПЕГильованим по N-кінцю, і фармацевтично прийнятний носій. Даний винахід відноситься до кон'югатів інсуліноподібного фактора росту І (ІФР-I) з поліетиленгліколем (ПЕГ), фармацевтичних композицій, що містять ці кон'югати, способів одержання та способів застосування цих кон'югатів. Передумови створення винаходу Хвороба Альцгеймера (ХА) стає усе більш переважаючою формою нейродегенерації, що становить приблизно 50%-60% всіх випадків слабоумства в людей старших 65 років. За сучасними оцінками це захворювання зустрічається в 15 мільйонів людей у світі, і, у зв'язку з тим, що відбувається відносне збільшення частки людей похилого віку у суспільстві, імовірно в наступні 20-30 років кількість хворих зросте. ХА є прогресуючим захворюванням, середня тривалість якого становить 8,5 років від початку появи клінічних симптомів до смерті. Загибель пірамідальних нейронів і нейрональних синапсів в областях мозку, пов'язаних з вищими психічними функціями, приводить до появи типових симптомів, що проявляються у великому й прогресуючому погіршенні когнітивної функції (Francis Р.Т. і ін., J. Neurol. Neurosurg. Psychiatry 66, 1999, стор. 137-147). ΦΑ - найпоширеніша форма старечого й передстаречого слабоумства у світі, що розпізнається клінічно як безупинно прогресуюче слабоумство, яке характеризується зростаючою втратою пам'яті, інтелекту, а також розладом мови (Merritt у кн.: «A Textbook of Neurology», Lea&Febiger, 1979, 6-е вид., Філадельфія, стор. 484-489). За даними нейропатології основною відмітною ознакою ХА є наявність двох характерних ушкоджень: амілоїдних сенильних бляшок і нейрофібрілярних сплетінь (НФС). Хоча бляшка розташована екстранейронально, сплетіння спостерігається в мозку інтранейронально, що випливає з результатів посмертного розтину. Одним з основних компонентів оболонки амілоїдних бляшок є патологічні відкладення низькомолекулярних амілоїдних бета-пептидів (A), які утворюються в результаті розщеплення секретазами амілоїдного білка-попередника (АБП) (Selkoe D.J., Physiol. Rev. 81, 2001, стор. 741-766, Hardy J. і Selkoe D.J., Science 297, 2002, стор. 353-356, Bush A.I. і Tanzi R.E., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99, 2002, стор. 7317-7319). A є здатний до самоагрегації пептидом, який складається з 39-43 залишків амінокислот (мол. м. ~ 4 кДа) і синтезується як частина більшого АБП (110-120 кДа). АБП є інтегрованим у мембрану глікопротеїном І типу з великим N-кінцевим позаклітинним доменом, одним трансмембранним доменом і коротким цитоплазматичним хвостом. Область A перекриває частини позаклітинного й трансмембранного доменів АБП. Найбільш визнаною гіпотезою участі АБП у загибелі нейрональних клітин при ХА є амілоїдна гіпотеза. Ця гіпотеза постулює, що відкладення амілоїдних бляшок або частково агрегований розчинний A запускають нейротоксичний каскад, тим самим, викликаючи нейродегенеративні зміни, що нагадують патологічні зміни при ХА (Selkoe, D.J., Physiol. Rev. 81, 2001, стор. 741-766; Hardy, J. і Selkoe, DJ., Science 297, 2002, стор. 353-356). Інсуліноподібний фактор росту І (ІФР-І) є циркулюючим гормоном, близьким за структурою до інсуліну. ІФР-І завжди розглядався як основний медіатор дії гормону росту на периферичні тканини. ІФР-І, що також називається соматомедином С та SwissProt No. P01343, складається з 70 амінокислот. Його застосування, дія та утворення описані, наприклад, у роботах le Bouc Υ. і ін., FEBS Lett. 196, 1986, стор. 108-112. de Pagter-Holthuizen P., і ін., FEBS Lett. 195, 1986, стор. 179-184, Sandberg Nordqvist A.C. і ін., Brain Res. Mol. Brain Res. 12, 1992, стор. 275-277, Steenbergh P.H. і ін., Biochem. Biophys. Res. Commun. 175, 1991, стор. 507-514, Tanner J.M. і ін., Acta Endocrinol. (Copenh.) 84, 1977, стор. 681-696, Uthne K. і ін., J. Clin. Endocrinol. Metab. 39, 1974, стор. 548-554, EP 0123228, EP 0128733, US 5861373, US 5714460, EP 0597033, WO 02/32449, WO 93/02695. Регуляція дії ІФР-І є досить складною. При циркуляції тільки 0,2 % ІФР-І існує у вільній формі, а більша частина пов'язана з білками, що зв'язують ІФР (ІФРСБ), які мають надзвичайно високу спорідненість до інсуліноподібних факторів росту й модулюють функцію ІФР-l. Цей фактор може вивільнятися локально за допомогою механізмів вивільнення ІФР-І, наприклад, протеолізу ІФРСБ протеазами. ІФР-І виконує паракринну роль у розвитку та дозріванні мозку (Werther G.A. і ін., Mol. Endocrinol. 4, 1990, стор. 773-778). Дослідження in vitro показали, що ІФР-І є потужним неселективним трофічним агентом для декількох типів нейронів у ЦНС (Knusel В. і ін., J. Neurosci. 10, 1990, стор. 558-570, Svrzic D. і Schubert, D., Biochem. Biophys. Res. Commun. 172, 1990, стор. 54-60), включаючи дофамінергічні нейрони (Knusel В. і ін., J. Neurosci. 10, 1990, стор. 558-570) та олігодендроцити (McMorris, F.A. і Dubois-Dalcq, Μ., J. Neurosci. Res. 21, 1988, стор. 199-209, McMorris F.A. і ін., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83, 1986, стор. 822-826, Mozell, R.L. і McMorris F.A., J. Neurosci. Res. 30, 1991, стор. 382-390). У патенті US 5093317 зазначено, що виживання холінергічних нейрональних клітин підвищується в результаті введення ІФР-І. Також було встановлено, що ІФР-І стимулює регенерацію 5 периферичних нервів (Kanje Μ. і ін., Brain Res. 486, 1989, стор. 396-398) і підвищує активність орнітиндекарбоксилази (US 5093317). В US 5861373 і WO 93/02695 описаний спосіб лікування ушкоджень і захворювань центральної нервової системи, які переважно впливають на невралгію та/або нехолінергічні нейрональні клітини шляхом підвищення діючих концентрацій ІФР-І і/або його аналогів у центральній нервовій системі пацієнта. В WO0232449 описані способи зниження або попередження ішемічних ушкоджень у центральній нервовій системі ссавця шляхом введення в носову порожнину ссавця фармацевтичної композиції, що включає терапевтично ефективну кількість ІФР-І або його біологічно активних варіантів. ІФР-І або його варіанти адсорбуються по всій носовій порожнині й транспортуються в центральну нервову систему ссавця в кількості, ефективній для зменшення або попередження ішемічного пошкодження, пов'язаного з розвитком ішемії. В ЕР 0874641 заявлене застосування ІФР-І або ІФР-ІІ для одержання лікарського засобу для лікування або попередження нейронального пошкодження в центральній нервовій системі через пов'язане зі СНІД-ом слабоумство, ХА, хворобу Паркінсона, хворобу Піка, хворобу Хантінгтона, печінкову енцефалопатію, кортикально-базальні гангліозні синдроми, прогресуюче слабоумство, сімейне слабоумство зі спастичним парапарезом, прогресуючий над'ядерний параліч, розсіяний склероз, церебральний склероз Шильдера або гострий некротизируючий геморагічний енцефаломієліт, де лікарський засіб передбачений у формі для парентерального введення ефективної кількості зазначеного ІФР за межами гематоенцефалічного бар'єра або бар'єра кров-спинний мозок. Зниження рівнів вмісту незв'язаного ІФР-І у сироватці та у мозку пов'язане з патогенезом спорадичних і сімейних форм ХА. Крім того, ІФР-І захищає нейрони від індукованої A нейротоксичності (Niikura Т., і ін., J. Neurosci. 21, 2001, стор. 19021910, Dore S. і ін., Рrос. Natl. Acad. Sci. USA 94, 1997, стор. 4772-4777, Dore S. і ін., Ann. NY Acad. Sci. 890, 1999, стор. 356-364). Раніше було встановлено, що периферичне введення ІФР-І здатне знизити рівні вмісту A у мозку в пацюків і мишей (Carro Ε. і ін., Nat. Med. 8, 2002, стор. 1390-1397). Крім того, встановлено, що у трансгенних модельних мишей з ХА пролонговане лікування за допомогою ІФР-І приводить до значного зниження навантаження амілоїдних бляшок у мозку. Ці результати переконливо підтверджують припущення про те, що ІФР-І може знизити рівні вмісту A і прояв пов'язаного з відкладенням бляшок слабоумства шляхом очищення мозку від A. Було доведено, що ковалентні модифікації білків з поліетиленгліколем (ПЕГ) придатні для продовження напівперіоду циркуляції білків в організмі (Hershfield M.S. і ін., N. Engl. J. Med. 316, 1987, стор. 589-596, Meyers F.J. і ін., Clin. Pharmacol. Ther. 49, 1991, стор. 307-313, Delgado С. і ін., Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst. 9, 1992, стор. 249-304, Katre, Advanced Drug Delivery Systems 10, 1993, с. 91, ЕР- А 0400472, Monfardini C. і ін., Bioconjugate 93666 6 Chem. 6, 1995, стор. 62-69, Satake-Ishikawa R. і ін., Cell Struct. Funct. 17, 1992, стор. 157-160, Katre N.V. і ін., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 1987, с. 1487-1491, Tsutsumi Υ., і ін., Jpn. J. Cancer Res. 85, 1994, стор. 9-12, Inoue H. і ін., J. Lab. Clin. Med. 124, 1994, стор. 529-536, Chamow S.M. і ін., Bioconjugate Chem. 5, 1994, стор. 133-140). Інші переваги ПЕГилювання полягають у збільшенні розчинності й у зниженні імуногенності білків (Katre N.V., J. Immunol. 144, 1990, стор. 209213). Звичайний спосіб ПЕГилювання білків полягає в застосуванні поліетиленгліколю, активованого аміно-реактивними реагентами, наприклад, Nгідроксисукцинімідом (MX). За допомогою таких реагентів поліетиленгліколь приєднується до білків по вільних первинних аміногрупах, наприклад, N-кінцевій -аміногрупі й -аміногрупах залишків лізину. Проте серйозний недолік такого підходу полягає в тому, що білки звичайно містять велику кількість залишків лізину, тому групи поліетиленгліколю приєднуються до білка неспецифічно по всіх вільних -аміногрупах, утворюючи суміш гетерогенних продуктів, а саме випадковим чином ПЕГильованих білків. Отже, багато NFCПЕГильованих білків є непридатними для комерційного застосування через низьку специфічну активність. Інактивація відбувається через ковалентну модифікацію одного або декількох залишків лізину або N-кінцеві аміногрупи, необхідні для біологічної активності, або через ковалентне приєднання залишків поліетиленгліколю по активному сайту білка або біля нього. Наприклад, було виявлено, що модифікація гормону росту людини при використанні NГC-ПЕГилюючих реагентів знижує біологічну активність білка більше, ніж в 10 разів (Clark R. і ін., J. Biol. Chem. 271, 1996, стор. 2196921977). У складі гормону росту людини міститься 9 лізинів крім N-кінцевої амінокислоти. Деякі із цих лізинів розташовані в областях білка, про які відомо, що вони є принципово важливими для зв'язування рецептора (Cunningham B.C. і ін., Science 254, 1991, стор. 821-825). Крім того, модифікація еритропоетину в результаті застосування амінореактивних поліетиленгліколевих реагентів також приводить до майже повної втрати біологічної активності (Wojchowski D.M. і ін., Biochim. Biophys. Acta 910, 1987, стор. 224-232). Ковалентна модифікація 2-інтерферону аміно-реактивними реагентами для ПЕГилювання приводить до втрати 4075% біологічної активності (US 5382657). Подібна модифікація приводить до втрати біологічної активності гранулоцитарного колонієстимулювального фактора (Г-КСФ) більше ніж на 60% (Tanaka Η. і ін., Cancer Res. 51, 1991, стор. 3710-3714), а інтерлейкіну-2 - більше ніж на 90% (Goodson R. J., Katre Ν. V., BioTechnology 8, 1990, стор. 343-346). В WO 94/12219 і WO 95/32003 описані кон'югати поліетиленгліколю, що включають ПЕГ та ІФР або ІФР із мутацією по цистеїну, в яких ПЕГ приєднаний до зазначеного мутеїну по вільному цистеїну в N-кінцевій області мутеїну. В WO 2004/60300 описаний N-кінцевий ПЕГильований ІФР-І. Короткий опис винаходу У даному винаході описаний варіант ІФР-І, в якого амінокислотна послідовність відрізняється 7 від амінокислотної послідовності ІФР-І природного типу замінами амінокислот у положеннях 27, 37, 65 та/або 68 таким чином, що одна або кілька амінокислот у положеннях 37, 65, 68 є лізином (К), а амінокислота в положенні 27 є полярною амінокислотою, але не лізином. Бажаною амінокислотою в положенні 27 є аргінін. Такі варіанти ІФР-І застосовуються як проміжні сполуки (ІФР-І-проміжних сполук) для одержання лізин-ПЕГильованого ІФР-І. Несподівано було виявлено, що лізинПЕГильований ІФР-І-варіант (аміно-активований ПЕГильований ІФР-І варіант), переважно ПЕГильований ІФР-І варіант масою 20-100 кДа, і особливо переважно моноПЕГильований ІФР-І варіант, має описані вище властивості, що стосуються терапевтичного застосування. Іншим варіантом здійснення даного винаходу є композиція лізин-ПЕГильованого ІФР-І варіанта за даним винаходом та варіанта ІФР-І, ПЕГильованого з N-кінця. Переважно молекулярне співвідношення перебуває в діапазоні від 9:1 до 1:9. Іншим кращим варіантом здійснення даного винаходу є композиція, в якій молярне співвідношення становить принаймні 1:1 (принаймні одна частина лізинПЕГильованого ІФР-І варіанта на одну частину варіанта ІФР-І, ПЕГильованого з N-кінця), переважно, принаймні, 6:4 (принаймні, шість частин лізинПЕГильованого варіанта ІФР-І на чотири частини варіанта ІФР-І, ПЕГильованого з N-кінця). Переважно обидва варіанти, і лізин-ПЕГильований варіант ІФР-І, і варіант ІФР-І, ПЕГильований з N-кінця, є моноПЕГильованими. Переважно в такій композиції варіант є ідентичним одночасно і лізинПЕГильованому варіанту ІФР-І, і ПЕГильованому з N-кінця варіанту ІФР-І. Варіант є переважно вибраним із групи, що включає RRKK, RRKR, RRRK, RKRR. ПЕГ переважно має молекулярну масу 3045 кДа, особливо 30 кДа або 40 кДа. ЛізинПЕГильований варіант ІФР-І і ПЕГильований з Nкінця варіант ІФР-І мають порівняну спорідненість до білків, що зв'язують ІФР (наприклад, СБ4 і СБ5), але різну активність у відношенні фосфорилювання ΙΦΡ-IR. Даний винахід передбачає кон'югат, що складається з варіанта ІФР-І (ІФР-І кон'югата або кон'югата) і поліетиленглікольної групи (груп), який відрізняється тим, що зазначений варіант ІФР-І має таку амінокислотну заміну (заміни) у положеннях 27, 37, 65 і/або 68 амінокислотної послідовності природного ІФР-І, що одна або кілька амінокислот у положеннях 37, 65, 68 є лізином (К), амінокислота в положенні 27 є полярною амінокислотою, але не лізином, а зазначений ПЕГ є кон'югованим із зазначеним варіантом ІФР-І через первинну аміногрупу (групи), переважно через первинну аміногрупу (групи) лізину (лізинів). Переважно середня молекулярна маса поліетиленгліколевих груп (групи) становить, принаймні, 20 кДа, більш переважно 20-100 кДа й особливо переважно 20-80 кДа. Групи (група) поліетиленгліколю є спряженими з варіантом ІФР-І по первинних аміногрупах (аміногрупі) лізину однієї або декількох амінокислот у 93666 8 положеннях 37, 65, 68 (аміно-реактивне ПЕГилювання) і необов'язково є ПЕГильованими по Nкінцевій амінокислоті. Кон'югат переважно є моноабо диПЕГильованим по залишку (залишках) лізину по одній або декільком амінокислотах у положенні (положеннях) 37, 65, 68 і необов'язково є ПЕГильованим по N-кінцевій амінокислоті. В іншому кращому варіанті здійснення даного винаходу кон'югат є моноПЕГильованим по К65, К68 або К37 або диПЕГильованим по К65 і К68, і необов'язково ПЕГильованим по N-кінцевій амінокислоті. Переважно не більше 20% ПЕГильованого варіанта ІФР-І є додатково ПЕГильованим з N-кінця. Варіанти ІФР-І позначені в такий спосіб: К65 означає, що амінокислотою в положенні 65 є лізин, R27 означає, що амінокислотою в положенні 27 є аргінін і т.д. Варіант ІФР-І, що несе амінокислоти R27, К37, К65, К68, позначається абревіатурою RKKK. Вихідний варіант ІФР-І позначається абревіатурою KRKK. Особливо кращими варіантами ІФР-І і варіантами в складі кон'югатів є: RRKK, RRKR, RRRK, RKRR. Також кращим є ПЕГильований варіант ІФР-І, в якого згідно з даним винаходом процесовано до трьох амінокислот (переважно всі три) з N-кінця. Відповідний мутант природного типу, що називається Des(1-3)-ІФP-I, позбавлений залишків амінокислот gly, pro і glu з N-кінця (Kummer А. і ін., Int. J. Exp. Diabesity Res. 4, 2003, стор. 45-57). Поліетиленгліколеві групи (група) є лінійними або розгалуженими. Даний винахід також передбачає способи приготування кон'югата за даним винаходом з використанням як проміжної сполуки ІФР-І. Спосіб полягає в приготуванні кон'югата, що містить варіант ІФР-І і одну або дві поліетиленгліколеві групи, причому зазначені ПЕГ групи (група), що мають переважно молекулярну масу, принаймні, рівну 20 кДа, більш переважно приблизно 20-100 кДа, і особливо переважно 20-80 кДа, шляхом хімічної реакції проміжної сполуки ІФР-І з активованим поліетиленгліколем в умовах, при яких зазначений поліетиленгліколь стає хімічно пов'язаним із зазначеною проміжною сполукою ІФР-І по первинній аміногрупі (аміногрупах) варіанта ІФР-І. Даний винахід також передбачає фармацевтичні композиції, що містять кон'югат згідно з даним винаходом, переважно разом з фармацевтично прийнятним носієм. Даний винахід також передбачає способи одержання фармацевтичних композицій, що містять кон'югат згідно з даним винаходом. Даний винахід також передбачає застосування кон'югата згідно з даним винаходом для одержання лікарського засобу для лікування ХА. Даний винахід також передбачає способи лікування ХА, що відрізняються тим, що фармацевтично ефективну кількість аміно-реактивного ПЕГильованого варіанта ІФР-І вводять в організм пацієнта, що потребує такого лікування, переважно один або два рази в тиждень. Докладний опис винаходу Поняття «ПЕГильований варіант ІФР-І» або «аміно-реактивне ПЕГилювання» у контексті дано 9 го винаходу означають, що варіант ІФР-І є ковалентно зв'язаним з однієї або двома поліетиленгліколевими групами шляхом аміно-реактивного сполучення з одним або двома лізинами в молекулі варіанта ІФР-І. Групи (група) ПЕГ приєднані по сайтах молекули варіанта ІФР-І, що є первинними -аміногрупами бічних ланцюгів лізину. Можлива також додаткова наявність ПЕГилювання по Nкінцевій -аміногрупі. Через застосовуваний спосіб синтезу й використовуваного варіанта ПЕГильований варіант ІФР-І може складатися із суміші варіантів ІФР-І, ПЕГильованих по амінокислотах К65, К68 і/або К37, ПЕГильованих або не ПЕГильованих по N-кінцю, відповідно до чого сайти ПЕГилювання можуть бути різними в різних молекул або можуть бути в основному однорідними залежно від кількості поліетиленгліколевих бічних ланцюгів, що приходяться на одну молекулу, і/або сайт ПЕГилювання в молекулі. Переважно варіанти ІФР-І є моно- і/або диПЕГильованими та спеціально очищеними від ПЕГильованих по N-кінцях варіантів ІФР-І. Аміно-реактивне ПЕГилювання в контексті даного винаходу означає спосіб випадкового приєднання ланцюгів поліетиленгліколю до первинних аміногруп (аміногруп) лізину у варіанті ІФР-І шляхом використання реактивного (активованого) поліетиленгліколю, переважно шляхом використання N-гідроксисукцинімідильного складного ефіру, переважно, метоксиполіетиленгліколю. В результаті реакції сполучення відбувається приєднання поліетиленгліколю до реактивних первинних аміногруп залишків лізину й необов'язково до аміногрупи N-кінцевої амінокислоти ІФР-І. Таке спряження ПЕГ з білками є добре відомим в даній області. Наприклад, огляд таких методів наведений у роботі Veronese F.M., Biomaterials 22, 2001, стор. 405-417. Згідно Veronese, спряження ПЕГ з первинними аміногрупами білків може бути виконане шляхом використання активованих молекул ПЕГ, які здійснюють алкілування зазначених первинних аміногруп. Для такої реакції можуть застосовуватися активовані алкілувальні поліетиленгліколі, наприклад, ПЕГальдегід, ПЕГ-тресилхлорид або ПЕГепоксид. Придатними реагентами також є ациловані поліетиленгліколі, наприклад, гідроксисукцинімідильні складні ефіри карбоксильованих поліетиленгліколів або поліетиленгліколі, в яких кінцева гідроксильна група активована хлорформіатами або карбонілімідазолом. Придатними поліетиленгліколевими реагентами також є поліетиленгліколі з амінокислотними ланцюгами. До таких реагентів можуть відноситися так звані розгалужені поліетиленгліколі, відповідно до чого, принаймні, дві ідентичні або різні молекули ПЕГ зв'язуються одна з одною пептидним спейсером (переважно лізином) і, наприклад, зв'язуються з варіантом ІФР-І як активований карбоксилат лізинового спейсера. Moно-N-кінцеве спряження також описане Kinstler О. і ін. в Adv. Drug Deliv. Rev. 54, 2002, стор. 477-485. У контексті даного винаходу поняття «ПЕГ або поліетиленгліколь» означає водорозчинний полімер, що комерційно є доступним або може бути приготовлений згідно зі способом полімеризації 93666 10 етиленгліколю з розкриттям циклу, добре відомим у даній області (Kodera Υ. і ін., Progress in Polymer Science 23, 1998, стор. 1233-1271, Francis G.E. і ін., Int. J. Hematol. 68, 1998, стор. 1-18). Термін «ПЕГ» широко використовується й поширюється на будьяку молекулу поліетиленгліколю, в якій число ланок етиленгліколю становить, принаймні, 460, переважно 460-2300, особливо переважно 460-1840 (молекулярна маса 230 ланок ПЕГ приблизно дорівнює 10 кДа). Максимальне число ланок ПЕГ обмежене тільки розчинністю кон'югата. Звичайно не використовуються поліетиленгліколі, що містять більше 2300 ланок. Переважно ПЕГ, застосовуваний у даному винаході, закінчується по одному кінцю гідрокси- або метоксигрупою (метоксиПЕГ, мПЕГ), а з іншого кінця ковалентно приєднаний до лінкерної частини молекули оксіефірним зв'язком. Полімер є нерозгалуженим або розгалуженим. Розгалужені поліетиленгліколі, наприклад, описані Veronese F.M. і ін. в Journal of Bioactive and Compatible Polymers 12, 1997, стор. 196-207. Придатними як регенти, наприклад, є поліетиленгліколі фірми Nektar Therapeutics (www.nektar.com). Можуть застосовуватися ПЕГ різної молекулярної маси, наприклад, приблизно 20-100 кДа (n=460-2300). Число повторюваних ланок «n» у ПЕГ наближено до молекулярної маси, вираженої в дальтонах. Наприклад, якщо дві молекули ПЕГ приєднані до лінкера, причому обидві молекули ПЕГ мають однакову молекулярну масу 10 кДа (у кожної молекули n приблизно дорівнює 230), сумарна молекулярна маса на одному лінкері приблизно дорівнює 20 кДа. Молекулярна маса молекул ПЕГ, приєднаних до лінкера, може бути різною, наприклад, із двох молекул на одному лінкері одна молекула може мати молекулярну масу 5 кДа, а інша молекула ПЕГ може мати молекулярну масу 15 кДа. Молекулярна маса завжди відображає середню молекулярну масу. У наведених нижче прикладах описані деякі кращі реагенти для одержання аміно-реактивних ПЕГильованих варіантів ІФР-І. Очевидно, що модифікації, які базуються на методах, описаних Veronese F.M. в Biomaterials 22, 2001, стор. 405417, можуть проводитися у тому ступені, в якому вони дозволяють одержувати кон'югати згідно з даним винаходом. Наявність до трьох потенційно реактивних первинних аміногруп у цільовому білку (до двох лізинів і однієї кінцевої амінокислоти) приводить до серій ізомерів ПЕГильованих варіантів ІФР-l, які відрізняються у точці приєднання ланцюга поліетиленгліколю. Даний винахід передбачає ПЕГильовані форми варіанта ІФР-І з поліпшеними властивостями. Такі кон'югати ПЕГильованого варіанта ІФР-І містять одну або дві випадковим чином приєднані лінійні або розгалужені групи ПЕГ, тому середня молекулярна маса всіх груп ПЕГ у кон'югаті переважно становить приблизно 20-80 кДа. Фахівцям у даній області очевидно, що можливі незначні відхилення від цього діапазону молекулярної маси доти, поки ПЕГильований варіант ІФР-І проявляє активність щодо зниження рівнів амілоїдних пептидів (A) у мозку. Крім того, ПЕГилювання 11 варіанта ІФР-І з ПЕГ, молекулярна маса якого перевищує 80 кДа, приводить до підвищення біодоступності. Проте передбачається, що така активність знижується в міру збільшення молекулярної маси через знижену активацію рецептора ІФР-І і погіршеного транспорту через гематоенцефалічний бар'єр. Таким чином, діапазон 20-100 кДа для молекулярної маси ПЕГ вважається оптимальним для кон'югата ПЕГ і варіанта ІФР-І, придатних для ефективного лікування пацієнтів з ХА. У контексті даного винаходу поняття «молекулярна маса» означає середню молекулярну масу ПЕГ. Приведені нижче ПЕГильовані форми варіантів ІФР-І є прикладами, що відповідають кон'югатам даного винаходу: - моноПЕГильований варіант ІФР-І, в якому молекулярна маса групи ПЕГ становить 20-80 кДа (460-1840 ланок ПЕГ), - диПЕГильований варіант ІФР-І, в якому молекулярна маса кожної групи ПЕГ становить приблизно 10-50 кДа (230-1150 ланок ПЕГ) і їх суміші. Особливо кращим є моноПЕГильований ІФР-І, вибраний із групи, що включає RRKK, RRKR, RRRK і RKRR, в якому розгалужена група ПЕГ має молекулярну масу 30-45, переважно 40-45 кДа (приблизно 920 ланок). Наприклад, при середній молекулярній масі ПЕГ 44 кДа та молекулярній масі ІФР-І 7,6 кДа сумарна середня молекулярна маса такого моноПЕГильованого ІФР-І становить приблизно 51,6 кДа. Кращим також є моноПЕГильований ІФР-І, вибраний із групи, що включає RRKK, RRKR, RRRK і RKRR, в якому середня молекулярна маса ПЕГ становить 30 або 40 кДа. Поняття «ПЕГ або група ПЕГ» згідно з даним винаходом означає залишок, значною частиною якого є поліетиленгліколь. Такий ПЕГ може містити додаткові хімічні групи, які необхідні для реакцій зв'язування, та утворюються в результаті хімічного синтезу молекули або є спейсером для оптимальної відстані між різними частинами молекули. Крім того, ПЕГ може містити один або кілька бічних ланцюгів ПЕГ, зв'язаних разом. Групи ПЕГ, що містять більше одного ланцюга ПЕГ, вважаються розгалуженими поліетиленгліколями. Розгалужені ПЕГ можуть бути отримані, наприклад, доданням поліетиленоксиду до різних поліолів, включаючи гліцерин, пентаеритрит і сорбіт. Наприклад, ПЕГ із чотирма розгалуженнями може бути отриманий з пентаеритриту та етиленоксиду. Розгалужені поліетиленгліколі звичайно мають 2-8 ланцюгів, вони описані, наприклад, в ЕР- А 0473084 і в патенті US 5932462. Особливо кращими є поліетиленгліколі із двома бічними ПЕГ-ланцюгами (ПЕГ2), зв'язаними по первинних аміногрупах лізину (Monfardini С. і ін., Bioconjugate Chem. 6, 1995, стор. 62-69). Поняття «у значній мірі гомогенні» у контексті даного винаходу означає, що отримано молекули тільки одного ПЕГильованого варіанта ІФР-І, що містять тільки одну або дві приєднані групи ПЕГ. Препарат може містити невелику кількість нереакційноздатного (тобто такого, що втратив ПЕГ) білка. За допомогою пептидного картування й Nкінцевого секвенування в одному із прикладів, що приведені нижче, передбачений спосіб одержання 93666 12 препарату, що складається, принаймні, на 90% з кон'югата варіанта ПЕГ-ІФР-І і, не більш ніж з 5% білка, що не прореагував. Виділення й очистка таких гомогенних препаратів ПЕГильованого варіанта ІФР-І може бути проведена за допомогою звичайних способів очищення, переважно ексклюзійної хроматографії. Поняття «моноПЕГильований» у контексті даного винаходу означає, що варіант ІФР-І ПЕГильований тільки по одному лізину в молекулі варіанта ІФР-І, тобто тільки одна група ПЕГ ковалентно приєднана до цього сайту. Такий моноПЕГильований ІФР-І може бути додатково ПЕГильованим по N-кінцю до певної довжини. Чистий варіант моноПЕГильованого ІФР-І (без N-кінцевого ПЕГилювання) становить, принаймні, 80% препарату, переважно 90%, і найбільш переважно моноПЕГильований варіант ІФР-І становить 92% у препараті або більше, інший склад препарату представлений нереакційноздатним (неПЕГильованим) ІФР-І і/або N-кінцевим ПЕГильованим варіантом ІФР-І. Таким чином, препарати моноПЕГильованого варіанта ІФР-І згідно з даним винаходом є досить гомогенними і як гомогенні препарати мають перевагу, наприклад, для фармацевтичного застосування. Такою ж якістю володіють диПЕГильовані препарати. «Активовані поліетиленгліколі або активовані поліетиленгліколеві реагенти» добре відомі в даній області. Переважно використовуються електрофільно активовані поліетиленгліколі, наприклад, алкоксимасляної кислоти сукцинімідні ефіри поліетиленгліколю («нижчі алкокси-ПЕГ-СМК») або алкоксипропіонової кислоти сукцинімідні ефіри поліетиленгліколю («нижчі алкокси-ПЕГ-СПК») або Nгідроксисукцинімід-активовані поліетиленгліколі. Може бути застосований будь-який спосіб здійснення взаємодії активованого складного ефіру з аміном для утворення аміду. У реакції активованого ПЕГ з ІФР-І зазначений сукцинімідильний складний ефір є відщеплюваною групою, що викликаєутворення аміду. Застосування сукцинімідних складних ефірів для одержання кон'югатів з білками описано в патенті US 5672662. Умови проведення реакції впливають на співвідношення різних ПЕГильованих варіантів ІФР-І. Змінюючи умови проведення реакції (наприклад, співвідношення реагентів, pH, температуру, тривалість реакції і т.д.) можна варіювати співвідношення різних ПЕГильованих варіантів ІФР-І. Переважно реакцію проводять у буферному водному розчині із pH 810, що містить 5-15 об. % етанолу та 0,5-4 об. % етиленгліколю. Співвідношення білок: ПЕГ переважно становить від 1:0,5 до 1:2 якщо одержують моноПЕГильовані варіанти, і від 1:2 до 1:5 якщо одержують диПЕГильовані варіанти. Температуру й час реакції можна варіювати за рішенням фахівця, причому висока температура та збільшена тривалість реакції приводять до посилення ПЕГилювання. Якщо одержують моноПЕГильовані варіанти, переважніше проводити реакцію при 4°С протягом до 30 хв. Якщо ПЕГильований реагент поєднують із варіантом ІФР-І у реакційному буфері, що переважно містить 50 ммолей борату натрію, 10% етанолу та 1% діетиленгліколю (ДЕГ), 13 при величині pH приблизно 9,0, співвідношення білок: ПЕГ становить приблизно 1:1,5, температура при проведенні реакції 4°С, одержують суміш моно-, ди- і слідові кількості три-ПЕГильованих молекул. Якщо співвідношення білок: ПЕГ становить приблизно 1:3, то одержують переважно ди- і олігоПЕГильовані молекули. Кон'югати варіанта ІФР-І згідно з даним винаходом можуть бути отримані шляхом ковалентної взаємодії первинної аміногрупи лізину варіанта ІФР-І з біфункціональним реагентом для одержання проміжної сполуки з амідним зв'язком, а також ковалентною взаємодією проміжної сполуки, що містить амідний зв'язок, з активованим похідним поліетиленгліколю для одержання кон'югата варіанта ІФР-І. У наступному процесі біфункціональним реагентом переважно є N-сукцинімідил-Sацетилтіопропіонат або N-сукцинімідил-Sацетилтіоацетат, а активоване похідне поліетиленгліколю переважно є вибраним із групи, що включає йодацетилметоксиПЕГ, метоксиПЕГвінілсульфон і метоксиПЕГімід малеїнової кислоти. Особливо кращим є застосування Nгідроксисукцинімідил-активованого розгалуженого складного ефіру ПЕГ (mПЕГ2-NГС) з молекулярною масою 40 кДа (Monfardini С. і ін., Bioconjugate Chem. 6, 1995, стор. 62-69, Veronese F.M. і ін., J. Bioactive Compatible Polymers 12, 1997, стор. 197207, патент US 5932462). Кон'югати варіанта ІФР-І можуть бути отримані аміно-реактивним ковалентним зв'язуванням тіолових груп з варіантом ІФР-І («активація») і взаємодією одержуваного активованого варіанта ІФР-І з похідним поліетиленгліколю (ПЕГ). Перша стадія полягає в ковалентному зв'язуванні тіолових груп з N2-групами лізину варіанта ІФР-І. Активація варіанта ІФР-І проводиться за допомогою біфункціональних реагентів, що несуть захищену тіолову групу й додаткову реактивну групу, наприклад, активними складними ефірами (наприклад, складний ефір сукцинімідилу), ангідридами, складними ефірами сульфонових кислот, галогенідами карбонових кислот і сульфонових кислот відповідно. Тіолова група захищена групами, відомими в даній області, наприклад, ацетильними групами. Біфункціональні реагенти здатні реагувати з -аміногрупами амінокислот з утворенням амідного зв'язку. Одержання біфункціональних реагентів відомо в даній області. Попередники біфункціональних Νгідроксисукцинільних складних ефірів описані в DE 39 24 705, а одержання ацетилтіо-похідного сполуки описане March J. в Advanced Organic Chemistry 1977, стор. 375-376. Біфункціональний реагент SΑΤΑ є комерційно доступним (фірма Molecular Probes, Eugene, Орегон, США, і фірма Pierce, Рокфорд, Іллінойс) і описаний в Duncan R.J., Anal. Biochem. 132, 1983, стор. 68-73. Реакцію проводять, наприклад, у водному буферному розчині, pH 6,5-8,0, наприклад, в 10 мМ фосфату калію, 300 мМ NaCl, pH 7,3. Біфункціональний реагент може додаватися в ДМСО. Після завершення реакції, переважно через 30 хв, реакцію припиняють доданням лізину. Надлишок біфункціонального реагенту може бути відокремлений способами, відомими в даній області, наприклад, 93666 14 діалізом або колонковою фільтрацією. Середнє число тіолових груп, доданих до варіанта ІФР-І, може бути визначене фотометричними методами, описаними, наприклад, Grasetti D.R. і Murray J.F. в Arch. Biochem. Biophys. 119, 1967, стор. 41- 49. Зазначена вище реакція супроводжується ковалентним зв'язуванням активованого похідного поліетиленгліколю (ПЕГ). Активовані похідні ПЕГ відомі в даній області й описані, наприклад, Morpurgo M. і ін. в J. Bioconjugate Chem. 7, 1996, стор. 363-368, для ПЕГ-вінілсульфону. Поліетиленгліколі з лінійним і розгалуженим ланцюгом придатні для одержання сполук формули І. Прикладами реагентів реактивних ПЕГ є йод-ацетил-метокси-ПЕГ і метокси-ПЕГвінілсульфон. Використання цих йод-активованих речовин відоме в даній області й описане, наприклад, Hermanson G.T. в Bioconjugate Techniques, Academic Press, San Diego, 1996, стор. 147-148. Подальша очистка сполук згідно з даним винаходом включає відокремлення моно- і/або диПЕГильованих варіантів ІФР-І, переважно від Nкінцевих ПЕГильованих форм, і може бути здійснена способами, відомими в даній області, наприклад колонковою хроматографією, переважно іонообмінною хроматографією, особливо катіонообмінною хроматографією. Процентний вміст моноПЕГильованих кон'югатів, а також співвідношення моно-і диПЕГильованих варіантів, може контролюватися більш широким об'єднанням фракцій навколо піка елюювання для зниження процентного вмісту моноПЕГильованих кон'югатів, або більш вузьким збором фракцій для підвищення процентного вмісту моноПЕГильованих кон'югатів у композиції. Приблизно 90% моноПЕГильованих кон'югатів складає гарний баланс виходу й активності. Можуть бути бажаними деякі композиції, в яких, наприклад, принаймні, 95% або, принаймні, 98% кон'югатів є моноПЕГильованими формами. У варіанті здійснення даного винаходу процентний вміст моноПЕГильованих кон'югатів становить 90-98%. У даному винаході поняття «полярна амінокислота» відноситься до амінокислоти, вибраної із групи, що включає цистеїн (С), аспарагінову кислоту (D), глутамінову кислоту (Е), гістидин (Н), аспарагін (N), глутамін (Q), аргінін (R), серин (S) і треонін (Т). Лізин також є полярною амінокислотою, проте він не входить у зазначену групу, оскільки заміщується згідно з даним винаходом. Переважно як полярна амінокислота використовується аргінін. Фармацевтичні склади ПЕГильований ІФР-І згідно з даним винаходом передбачає поліпшену стабільність при циркуляції в організмі, що забезпечує стійкий доступ до рецепторів ІФР-І по всьому організму при низьких інтервалах застосування. Варіанти ПЕГильованого ІФР-І можуть вводитися в організм у вигляді суміші або як різні окремі ПЕГильовані зразки, розділені шляхом іонообмінної хроматографії або ексклюзійної хроматографії. Сполуки даного винаходу можуть бути перетворені методами одержання фармацевтичних композицій, відомими фахівцям у даній області. Для одер 15 жання таких композицій варіанти ПЕГильованого ІФР-І за даним винаходом поєднують у суміші із фармацевтично прийнятним носієм, переважно шляхом діалізу проти водного розчину, що містить бажані інгредієнти фармацевтичних композицій. Такі прийнятні носії, наприклад, описані в кн.: «Remington's Pharmaceutical Sciences», 18-е вид., ред. Mack Publishing Company, під ред. Oslo і ін., стор. 1435- 1712. Типові композиції містять ефективну кількість речовини згідно з даним винаходом, наприклад, приблизно 0,1-100 мг/мл, разом із прийнятною кількістю носія. Композиції можуть бути введені парентерально. ПЕГильовані ІФР-І згідно з даним винаходом вводять переважно внутрішньочеревинно, підшкірно, внутрішньовенно або інтраназально. Фармацевтичні склади згідно з даним винаходом можуть бути отримані відомими в даній області способами. Звичайно розчини ПЕГильованого варіанта ІФР-І діалізують проти буфера, що застосовується у фармацевтичних композиціях, і величину необхідної кінцевої концентрації білка доводять шляхом концентрування або розведення. Такі фармацевтичні композиції можуть застосовуватися для введення ін'єкцією або інфузією, переважно внутрішньочеревинно, підшкірно, внутрішньовенно або інтраназально, і містити ефективну кількість ПЕГильованого варіанта ІФР-І разом з фармацевтично прийнятними розчинниками, консервантами, солюбілізаторами, емульгаторами, ад'ювантами та/або носіями. Такі композиції включають розчинники з різними буферними компонентами (наприклад, аргініном, ацетатом, фосфатом), величиною pH та іонною силою, добавками, наприклад, розпушувачами й солюбілізуючими агентами (наприклад, продуктом Tween™ 80/полісорбатом, продуктом Pluronic™ F68), антиоксидантами (наприклад, аскорбіновою кислотою, метабісульфітом натрію), консервантами (продуктом Timersol™, бензиловим спиртом), наповнювачами (наприклад, сахарозою, манітом), а також полімерними сполуками, наприклад, полімерами молочної кислоти, полігліколевої кислоти та ін., для включення матеріалів у частинки або ліпосоми. Такі композиції можуть впливати на стан фізичної стабільності при вивільненні та кліренсі моноПЕГильованого ІФР-І згідно з даним винаходом. Дозування та концентрації лікарських засобів Звичайно, при стандартному режимі лікування пацієнтів лікують дозами в діапазоні 0,001-3 мг, переважно 0,01-3 мг ПЕГильованого варіанта ІФР-І /кг/доба протягом певного періоду, що становить 1-30 діб або навіть більше. Лікарський засіб застосовують один раз на добу у вигляді підшкірної, внутрішньовенної або внутрішньочеревинної болюсної ін'єкції або інфузії фармацевтичного складу, що містить 0,1-100 мг ПЕГильованого ІФР-І у мл. Таке лікування може поєднуватися з якимнебудь стандартним (наприклад, хіміотерапевтичним) лікуванням, при цьому застосовують ПЕГильований ІФР-І до, під час або після стандартного лікування. Це приводить до поліпшеного результату в порівнянні із застосуванням тільки одного стандартного лікування. 93666 16 Встановлено, що для успішного лікування ПЕГильований ІФР-І за даним винаходом може вводитися тільки один або два рази на тиждень. В іншому варіанті здійснення даного винаходу описаний спосіб лікування хвороби Альцгеймера, що полягає у введенні пацієнтові, що цього потребує, терапевтично ефективної кількості ПЕГильованого ІФР-І згідно з даним винаходом у вигляді однієї дози, що перебуває в діапазоні 0,001-3 мг, переважно 0,01-3 мг варіанта ПЕГильованого ІФР-І на кг протягом 3-8 діб, переважно 7 діб. Як ПЕГильований ІФР-І переважно використовують моноПЕГильований ІФР-І, переважно у вигляді композиції варіанта лізин-ПЕГильованого ІФР-І згідно з даним винаходом й варіанта ІФР-І, ПЕГильованого з Nкінця в молярному співвідношенні, принаймні, 1:1. В іншому варіанті здійснення даного винаходу використовують ПЕГильований ІФР-І згідно з даним винаходом для одержання лікарського засобу для лікування хвороби Альцгеймера, що вводять пацієнтові, який цього потребує, у терапевтично ефективній кількості у вигляді однієї або двох доз, що перебувають у діапазоні 0,001-3 мг, переважно 0,01-3 мг варіанта ПЕГильованого ІФР-І на кг протягом 6-8 діб, переважно 7 діб. Як ПЕГильований ІФР-І переважно використовують моноПЕГильований ІФР-І, переважно у вигляді композиції варіанта лізин-ПЕГильованого ІФР-І за даним винаходом й варіанта ІФР-І, ПЕГильованого з N-кінця в молярному співвідношенні, принаймні, 1:1. Приклади, що наведені нижче, посилання й фігури пояснюють даний винахід, але не обмежують його об'єму, описаного у формулі винаходу. Очевидно, що в методиках, що наведені нижче, можуть бути зроблені зміни, які також відповідають суті даного винаходу. Перелік послідовностей SEQ ID NO: 1 амінокислотна послідовність ІФР-1 людини (амінокислоти 1-70 ІФР-І, амінокислоти 71-105 пропептиду згідно зі SwissProt P01343). Короткий опис фігур Фіг.1. Іонообмінна хроматографія-ВЕРХ ПЕГильованого ІФР. Чисті ізомери положення відокремлюють від ПЕГильованої суміші, використовуючи препаративну жорстку катіон-обмінну колонку (фірма TOSOH-BIOSEP, колонка SP-5PW). Фракції п'яти різних піків (позначених 0-4) виділені й процесовані для подальшого аналізу. Фіг.2. Аналіз методом електрофорезу в натрій додецилсульфат-поліакриламідному гелі піків моноПЕГильованих ІФР-І. Фракції п'яти очищених піків (позначених 0-4) піддають електрофорезу в 412 % трис-гліцин натрій додецилсульфат-поліакриламідному гелі в умовах без відновлення (А) і при відновленні (Б) і гелі забарвлюють барвником для білків кумасі блакитним. Ммм - маркер молекулярної маси. Фіг.3. Пептидний аналіз піків 1, 2 і 3 моноПЕГильованого ІФР-І. Піки 1, 2 і 3 очищеного моноПЕГильованого ІФР-І руйнують за допомогою AspN і отримані пептидні фрагменти розділяють за допомогою ВЕРХ. 17 Пептидні послідовності ПЕГильованих фрагментів одержують методом N-кінцевого руйнування пептидів за Едманом. A. Методом ВЕРХ отримано 6 різних пептидних фрагментів рлІФР-І з часом затримки від 30 до 45 хв. і сьомий великий фрагмент (і мінорний фрагмент 7') ПЕГильованих піків зі зразковим часом затримки 70 хв. Стрілки показують відповідні великі зміни в пептидних фрагментах різних піків у порівнянні із рлІФР-І. Б. Пептидна послідовність 6 фрагментів, отриманих у результаті розщеплення рлІФР-І за допомогою Asp-N. Лізини (К) виділені жирним шрифтом у фрагментах 3 і 4. Фрагмент 5 позначає N-кінцевий пептид. B. Пептидна послідовність ПЕГильованих пептидних фрагментів 7 після руйнування методом Едмана. Залишки цистеїну та ПЕГильованого лізину викликають розриви пептидної послідовності. Фіг.4. Ієрархічне кластерування ХА різних профілів глобальної експресії від ІФР-І і моноПЕГильованих ізомерів. Час інкубації ІРФ-І і ПЕГильованих варіантів становив 24 год; використовували мишей лінії NIH-3T3. Умови й результати аналізу описані в тексті. А. Кластери генів, регуляція яких послаблюється. Б. Кластери генів, регуляція яких підсилюється. Фіг.5. Фосфорилювання ΙΦΡ-IR за допомогою рлІФР-І і моноПЕГильованого ІФР-І. Клітини лінії NIH-3T3, стабільно трансфіковані ΙΦΡ-IR людини, протягом ночі витримують у середовищі без сироватки, а потім інкубують зі зростаючими дозами (0,01-10 мкг/мл) рлІФР-І або моноПЕГильованими ІФР-І ізомерами (піки 1, 2, 3, суміш піків, Des(1-3) пік 3) протягом 30 хв. Потім клітини оброблюють для Вестерн-блотінгу або внутрішньоклітинного аналізу, описаних у методах. Криві доза-відповідь із рлІФР-I (А), піком 1 (Б), піком 2 (В), піком 3 (Г), сумішшю піків (Д) і Des(1-3) піка 3 (Е), відповідно. Сигнал фосфорилювання нормалізували для рівнів ΙΦΡ-IR в окремих лунках. Представлені точки показують середні значення ± SEM для 6 вимірювань для 3 незалежних культур. Фіг.6. Кількісний аналіз фосфорилювання ΙΦΡIR у клітинах лінії NIH-3T3. Криві доза-відповідь, отримані в ході експериментів приклада 7, були покладені в основу кінетики зв'язування по одній точці для одержання показників специфічного зв'язування (ВМах), 50% від концентрацій зв'язування (ЕС50) і коефіцієнтів Хілла (nН). Представлені дані показують середні значення ± SEM для 6 вимірювань для 3 незалежних культур. Фіг.7. Зниження вмісту A in vivo у мишей лінії PS2APP за рахунок застосування рлІФР-І. Двічі трансгенних мишей лінії PS2AAP у віці 2-3 місяців (n = 10) лікують протягом 2 год. рлІФР-І (50 мкг/кг, внутрішньочеревинне введення). Одержують екстракти кори головного мозку й оцінюють рівні вмісту АБП, С99, A і контрольного білка (альбуміну) відповідно до описаного в методах способу. Виходячи з нормалізованих по альбуміну значень, підраховують співвідношення С99/АБП, A/АБП і C99/A, виражають у вигляді % від контролю без 93666 18 лікування й представляють середні значення ± SEM. А, представлені результати Вестерн-блотінгу екстрактів кори головного мозку двомісячних мишей. Виражене чітке зниження рівнів вмісту А, проте у результаті лікування рлІФР-І рівні інших сполук залишаються незмінними. Б, кількісний аналіз екстрактів кори головного мозку мишей лінії PS2APP (**, р