Антитіло, яке нейтралізує людський цитомегаловірус (hcmv), та його застосування

Реферат: Винахід належить до виділеного антитіла, яке нейтралізує людський цитомегаловірус (hCMV), зв'язуючись з білками UL130 та UL131A, виділеної молекули нуклеїнової кислоти, що його кодує, клітини-хазяїна, композиції, що містить дане антитіло, та застосування антитіла для виробництва лікарського засобу для лікування hCMV інфекції. UA 100682 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Всі документи, процитовані в даній заявці, повністю включені в неї шляхом посилань. Область техніки, до якої відноситься винахід Даний винахід відноситься до антитіл, що мають специфічність стосовно людського цитомегаловірусу, прийнятних моноклональних антитіл, що мають таку специфічність, та іморталізованих В-клітин, які продукують такі моноклональні антитіла. Даний винахід також відноситься до епітопів, з якими зв'язуються такі антитіла, до застосування антитіл та епітопів у способах скринінгу, а також у діагностиці, профілактиці та лікуванні захворювання. Рівень техніки Людський цитомегаловірус (hCMV) є широко розповсюдженим патогеном, який може викликати важку патологію у дорослих зі зниженим імунітетом та після інфікування ембріона, і безпосередньо пов'язаний із хронічними захворюваннями, такими як атеросклероз. hCMV інфікує безліч типів клітин, включаючи фібробласти, ендотеліальні, епітеліальні та гемопоетичні клітини [1]. Розповсюджені атенуіровані іn vitro штами hCMV, які були розроблені як кандидатні вакцини, втратили тропізм стосовно ендотеліальних клітин, зберігаючи при цьому здатність до інфікування фібробластів [2]. Недавно було показано, що два вірусних глікопротеїнових комплекси контролюють клітинний тропізм hCMV. Для інфікування фібробластів необхідний комплекс gH, gL та gO, у той час як комплекс gH, gL та протеїнів, кодованих UL131-UL128 генами, відповідає за інфікування ендотеліальних клітин, епітеліальних клітин та дендроподібних клітин [2-8]. Гіперімунні глобуліни вже введені в комерційний обіг для застосування для профілактики захворювання hCMV, пов'язаного із трансплантацією, а недавно одержані дані вказують на те, що вони мають терапевтичну дію стосовно вагітних [9]. Такий терапевтичний підхід обмежений малою кількістю нейтралізуючого антитіла, яка може бути перенесена, і з цієї причини надзвичайно бажаною була б наявність людських антитіл (таких як людські моноклональні антитіла) з високою нейтралізуючою здатністю. Однак, усе ще необхідно визначити мішень для нейтралізуючих hCMV антитіл. У попередніх роботах gB та gH були ідентифіковані як потенційні мішені. Однак, гуманізоване антитіло до gH (MSL 109) не показало якого-небудь значного ефекту в клінічних випробуваннях [10, 11]. Всі нейтралізуючі антитіла, описані дотепер, мали низьку нейтралізуючу здатність, оскільки вони нейтралізують інфекцію hCMV тільки при високих концентраціях. Наприклад, антитіло MSL-109 проявляє тільки 50 % нейтралізуючої активності при концентрації 10 мкг/мл, що може пояснювати відсутність ефекту in vivo [11]. Нейтралізуючу активність анти-hCMV антитіл, типово, вимірюють із використанням фібробластів як клітинмішеней. Однак, відомо, що hCMV викликає патологію шляхом інфікування інших типів клітин, таких як ендотеліальні, епітеліальні клітини та лейкоцити. Тому, не очевидно, що не існує якихнебудь моноклональних антитіл, які могли б бути здатні до високоефективної нейтралізації інфікування нефібробластних клітин-мішеней. Недавно описані нейтралізуючі антитіла до UL128 та UL130 також показали дуже низьку активність при нейтралізації інфікування ендотеліальних клітин [7]. Тому існує необхідність в одержанні нейтралізуючих антитіл до hCMV, а також у визначенні мішені, з якою зв'язуються такі антитіла. Опис винаходу Даний винахід заснований на продукуванні антитіл і фрагментів антитіл, які нейтралізують hCMV інфекцію та мають особливо високу активність при нейтралізації інфекції hCMV. Такі антитіла є бажаними, оскільки для нейтралізації даної кількості вірусу необхідні тільки низькі концентрації. Це сприяє утворенню більш високих ступенів захисту при введенні менших кількостей антитіл. Людські моноклональні антитіла та клони иморталізованих В-клітин, які секретують такі антитіла, також входять в обсяг даного винаходу. Винахідники відкрили, що антитіла, спрямовані на комбінацію UL130 та UL131A, особливо ефективні при нейтралізації hCMV. Така комбінація може являти собою комплекс UL130 та UL131A, що формує епітоп, який розпізнається антитілом, або антитіло може бути спрямоване на один із UL130 та UL131A, наявність інших протеїнів необхідна для специфічності. Даний винахід також відноситься до характеристики епітопу, з яким зв'язуються антитіла, та до застосування такого епітопу при підвищенні імунної відповіді. Даний винахід також відноситься до різних способів та застосувань, в яких задіяні антитіла за даним винаходом та епітопи, з якими вони зв'язуються. Антитіла за даним винаходом Даний винахід забезпечує моноклональні або рекомбінатні антитіла, що мають особливо високу активність при нейтралізації hCMV. Даний винахід також забезпечує фрагменти таких рекомбінантних або моноклональних антитіл, особливо фрагменти, що зберігають антигензв'язуючу активність антитіл, наприклад, що зберігають, щонайменше, одну 1 UA 100682 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 гіперваріабельну ділянку (CDR), яка має специфічність стосовно hCMV протеїнів UL130 та UL131A. У даній заявці, під терміном „висока активність при нейтралізації hCMV" мають на увазі, що молекула антитіла за даним винаходом нейтралізує hCMV в стандартному аналізі при концентрації, значно більш нижчій, ніж концентрація антитіл, відомих з рівня техніки, наприклад, у порівнянні з MSL-109. Переважно, молекула антитіла за даним винаходом може нейтралізувати при концентрації 0,16 мкг/мл або нижче (тобто, 0,15, 0,125, 0,1, 0,075, 0,05, 0,025, 0,02, 0,016, 0,015, 0,0125, 0,01, -8 0,0075, 0,005, 0,004 або нижче), переважно 0,016 мкг/мл або нижче (концентрація антитіла 10 -9 -10 -11 -12 або нижче, переважно 10 M або нижче, переважно 10 M або нижче, тобто, 10 M, 10 M, 10 13 M або нижче). Це означає, що тільки дуже низькі концентрації антитіла необхідні для 50 % нейтралізації клінічного ізоляту hCMV in vitro у порівнянні з концентрацією MSL-109, необхідною для нейтралізації того ж самого титру hCMV. Переважно, концентрація антитіла за даним винаходом, необхідна для 50 % нейтралізації інфікування ендотеліальних клітин, епітеліальних клітин та дендроподібних клітин клінічним ізолятом hCMV в 50 разів або більше (тобто, в 75, 100, 150, 200 або більше) нижче, ніж концентрація, необхідна для MSL-109. Ефективність може бути виміряна за допомогою стандартного аналізу нейтралізації, як описано в рівні техніки. Антитіла за даним винаходом можуть нейтралізувати hCMV. Переважно, антитіло за даним винаходом запобігає інфікуванню фібробластів або ендотеліальних клітин. Більш переважно, антитіло за даним винаходом запобігає інфікуванню ендотеліальних клітин. Переважно, антитіло за даним винаходом запобігає інфікуванню як фібробластів, так і ендотеліальних клітин. Антитіла за даним винаходом, переважно, також запобігають інфікуванню дендроподібних клітин та ендотеліальних клітин, таких як ретинальні клітини. Антитіла можуть бути застосовані як профілактичні або терапевтичні засоби після одержання відповідного лікарського засобу, або як діагностичний засіб. "Нейтралізуюче антитіло" являє собою антитіло, що може нейтралізувати здатність патогена ініціювати та/або зберігати інфекцію у хазяїна (носія). Винахід забезпечує нейтралізуюче моноклональне людське антитіло, де антитіло розпізнає антиген людського цитомегаловіруса (hCMV). Переважно, антитіло за даним винаходом має специфічність стосовно комбінації UL130 та UL131A. Переважно, антитіло за даним винаходом є моноклональним антитілом, яке в даній заявці має назву 1F11 або 2F4. Такі антитіла були спочатку виділені з hCMV інфікованого донора, вони продукуються клонами іморталізованих В-клітин, що мають назву 1F11 або 2F4. Було показано, що такі антитіла нейтралізують інфікування hCMV ендотеліальних клітин, епітеліальних клітин, ретинальних клітин та дендроподібних клітин. Додатково, антитіла 5A2 та 9A11, виділені з hCMV інфікованого донора, проявляють аналогічну специфічність стосовно комбінації UL130 та UL131A та здатність до нейтралізації інфікування hCMV ендотеліальних, епітеліальних, ретинальних та дендроподібних клітин. Такі антитіла продукуються клонами іморталізованих Вклітин, що мають назву 5A2 та 9A11, відповідно. 1F11 складається з важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність, зазначену в SEQ ID NO: 7, та легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність, зазначену в SEQ ID NO: 8. 2F4 складається з важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність, зазначену в SEQ ID NO: 17, та легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність, зазначену в SEQ ID NO: 18. CDRs важких ланцюгів антитіла мають назву CDRH1, CDRH2 та CDRH3, відповідно. Аналогічно, CDRs легких ланцюгів антитіла мають назву CDRL1, CDRL2 та CDRL3, відповідно. Положення CDR амінокислот визначене відповідно до системи нумерації IMGT [12, 13, 14] у такий спосіб: CDR1-IMGT положення 27 - 38, CDR2-IMGT положення 56 - 65 та CDR3-IMGT положення 105 117. 5A2 складається з важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність, зазначену в SEQ ID NO: 39, та легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність, зазначену в SEQ ID NO: 40. Амінокислотні послідовності CDRs даних антитіл показані в Таблиці 1. 2 UA 100682 C2 Таблиця 1 1F11 CDRH1 GFTFSSYA (SEQ ID NO:1) CDRH2 ISFDGDNK (SEQ ID NО:2) AREELVGLMPPYYNYGLDV CDRH3 (SEQ ID NО:3) 2F4 GFSFNTYG (SEQ ID NO:11) IWDDGSKM (SEQ ID NО:12) ARDEGAIMLHAMTDYGLDV (SEQ ID NО:13) 5A2 GGTFSSYV (SEQ ID NO:33) IIPIFNTA (SEQ ID NO:34) ARDFLSGPMEMPGGYYGLDV (SEQ ID NО:35) QSVLYSSNNKNY (SEQ ID NО:36) WAS(SEQ ID NO:37) CDRL1 SSNTGNNF (SEQ ID NО:4) NLGDEF(SEQ ID NО:14) CDRL2 DND(SEQ ID NО:5) QDS (SEQ ID NО:15) ETWDGSLNPAVV (SEQ ID QAWDSSTAHYV (SEQ CDRL3 NО:6) NО:16) 5 10 15 20 25 30 35 40 45 ID QQYYSTPIT (SEQ ID NО:38) Даний винахід також включає антитіло, що містить важкий ланцюг, який містить один або більше (тобто, один, два або всі три) CDRs важкого ланцюга з 1F11 або 2F4 (SEQ ID NO: 1 - 3 або 11 - 13). Також включено антитіло, що містить важкий ланцюг, який містить один або більше (тобто, один, два або всі три) CDRs важкого ланцюга з 5A2 (SEQ ID NO:33 - 35). Переважно, антитіло за даним винаходом містить важкий ланцюг, що містить (i) SEQ ID NO: 1 для CDRH1, SEQ ID NO: 2 для CDRH2 та SEQ ID NO: 3 для CDRH3, або (ii) SEQ ID NO: 11 для CDRH1, SEQ ID NO: 12 для CDRH2 та SEQ ID NO: 13 для CDRH3. Додаткове переважне антитіло за даним винаходом містить важкий ланцюг, що містить SEQ ID NO: 33 для CDRH1, SEQ ID NO: 34 для CDRH2 і SEQ ID NO: 35 для CDRH3. Даний винахід також включає антитіло, що містить легкий ланцюг, який містить один або більше (тобто, один, два або всі три) CDRs легкого ланцюга з 1F11 або 2F4 (SEQ ID NO: 4 - 6 або 14 - 16). Також включено антитіло, що містить легкий ланцюг, який містить один або більше (тобто, один, два або всі три) CDRs легкого ланцюга з 5A2 (SEQ ID NO:36 - 38). Переважно, антитіло за даним винаходом містить легкий ланцюг, що містить (i) SEQ ID NO: 4 для CDRL1, SEQ ID NO: 5 для CDRL2 та SEQ ID NO: 6 для CDRL3, або (ii) SEQ ID NO: 14 для CDRL1, SEQ ID NO: 15 для CDRL2 та SEQ ID NO: 16 для CDRL3. Додаткове переважне антитіло за даним винаходом містить легкий ланцюг, що містить SEQ ID NO: 36 для CDRL1, SEQ ID NO: 37 для CDRL2 та SEQ ID NO: 38 для CDRL3. Переважно, антитіло за даним винаходом містить важкий ланцюг, що має послідовність, зазначену в SEQ ID NO: 7, 17 або 39. Переважно, антитіло за даним винаходом містить легкий ланцюг, що має послідовність, зазначену в SEQ ID NO: 8, 18 або 40. Також можуть існувати молекули гібридного антитіла, які містять один або більше CDRs з 1F11 та один або більше CDRs з 2F4. Переважно, такі гібридні антитіла містять три CDRs з 1F11 та три CDRs з 2F4. Таким чином, переважні гібридні антитіла містять i) три CDRs легких ланцюгів з 1F11 та три CDRs важких ланцюгів з 2F4, або ii) три CDRs важких ланцюгів з 1F11 та три CDRs легких ланцюгів з 2F4. В альтернативному варіанті, такі гібриди можуть містити один або більше CDRs з 5A2. Даний винахід також включає послідовності нуклеїнових кислот, що кодують частину або всі легкі і важкі ланцюги та CDRs за даним винаходом. Переважні послідовності нуклеїнових кислот за даним винаходом включають SEQ ID NO: 9 (кодуючу 1F11 варіабельний регіон важкого ланцюга), SEQ ID NO: 10 (кодуючу 1F11 варіабельний регіон легкого ланцюга), SEQ ID NO: 19 (кодуючу 2F4 варіабельний регіон важкого ланцюга) та SEQ ID NO: 20 (кодуючу 2F4 варіабельний регіон легкого ланцюга). Переважні послідовності нуклеїнових кислот, що кодують різні CDRs, включають SEQ ID NO: 21 (кодуючу 1F11 CDRH1), SEQ ID NO: 22 (кодуючу 1F11 CDRH2), SEQ ID NO: 23 (кодуючу 1F11 CDRH3), SEQ ID NO: 24 (кодуючу 1F11 CDRL1), SEQ ID NO: 25 (кодуючу 1F11 CDRL2), SEQ ID NO: 26 (кодуючу 1F11 CDRL3), SEQ ID NO: 27 (кодуючу 2F4 CDRH1), SEQ ID NO: 28 (кодуючу 2F4 CDRH2), SEQ ID NО: 29 (кодуючу 2F4 CDRH3), SEQ ID NО: 30 (кодуючу 2F4 CDRL1), SEQ ID NО: 31 (кодуючу 2F4 CDRL2) і SEQ ID NО: 32 (кодуючу 2F4 CDRL3). Додаткові переважні послідовності нуклеїнових кислот за даним винаходом включають SEQ ID NO: 41 (кодуючу 5A2 варіабельний регіон важкого ланцюга), SEQ ID NO: 42 (кодуючу 5A2 варіабельний регіон легкого ланцюга), SEQ ID NO: 43 (кодуючу 5A2 CDRH1), SEQ ID NO: 44 (кодуючу 5A2 CDRH2), SEQ ID NO: 45 (кодуючу 5A2 CDRH3), SEQ ID NO: 46 (кодуючу 5A2 CDRL1), SEQ ID NO: 47 (кодуючу 5A2 CDRL2), SEQ ID NО:48 (кодуючу 5A2 CDRL3). Внаслідок надлишковості генетичного коду, будуть існувати варіанти таких послідовностей, які кодують ті ж самі амінокислотні послідовності. 3 UA 100682 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Варіантні антитіла також входять в обсяг даного винаходу. Таким чином, варіанти послідовностей, зазначені в даній заявці, також входять в обсяг даного винаходу. Такі варіанти можуть виникати через виродженість генетичного коду, як зазначено вище. Альтернативно, природні варіанти можуть продукуватися внаслідок помилок транскрипції або трансляції. Варіант 2F4 також описаний у даній заявці. Даний варіант містить, додатково, два серинових залишки в C-кінцевій області 2F4 амінокислотної послідовності важкого ланцюга (SEQ ID NO: 17). Таким чином, даний варіант 2F4 складається з важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність, зазначену в SEQ ID NO: 49, та легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність, зазначену в SEQ ID NO: 18. Послідовність нуклеїнової кислоти, що кодує варіантний важкий ланцюг, зазначена в SEQ ID NО: 50. Таким чином, антитіла, що містять 2F4 варіантний важкий ланцюг (SEQ ID NO: 49) входять в обсяг даного винаходу. Додаткові варіанти послідовностей антитіл, що мають підвищену афінність, можуть бути одержані за допомогою способів, відомих з рівня техніки, і входять в обсяг даного винаходу. Наприклад, амінокислотні заміщення можуть бути застосовані для одержання антитіл з додатково підвищеною афінністю. Альтернативно, оптимізація кодонів нуклеотидної послідовності може бути застосована для підвищення ефективності трансляції в системах експресії для продукування антитіла. Переважно, такі послідовності варіантних антитіл будуть мати 70 % або більше (тобто, 80, 85, 90, 95, 97, 98, 99 % або більше) ідентичність послідовностей з послідовностями, зазначеними в даній заявці. Переважно, таку ідентичність послідовностей розраховують відносно повного розміру контрольної послідовності (тобто, послідовності, зазначеної в даній заявці). Переважно, відсоток ідентичності, зазначений у даній заявці, є таким, як визначено за допомогою BLAST, версія 2.1.3, з використанням параметрів за замовчуванням, зазначених NCBI (Національний Центр Біотехнологічної Інформації (National Center for Biotechnology Information); http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) [Blosum 62 матриця; штраф за відкриття пропуску послідовності = 11, штраф за продовження пропуску послідовності = 1]. Додатково в обсяг даного винаходу входять вектори, наприклад, вектори експресії, що містять послідовність нуклеїнових кислот за даним винаходом. Клітини, трансформовані такими векторами, також входять в обсяг даного винаходу. Даний винахід також відноситься до моноклональних антитіл, які зв'язуються з епітопом, здатним зв'язувати моноклональне антитіло 1F11 або 2F4. Даний винахід також відноситься до моноклональних антитіл, які зв'язуються з епітопом, здатним зв'язувати моноклональне антитіло 5A2. Моноклональні та рекомбінантні антитіла є особливо корисними при ідентифікації й очищенні індивідуальних поліпептидів або інших антигенів, на які вони спрямовані. Антитіла за даним винаходом є додатково корисними, оскільки вони можуть бути застосовані як реагенти в імунному аналізі, радіоімунному аналізі (RIA) або твердофазному імуноферментному аналізі (ELISA). У таких застосуваннях, антитіла можуть бути позначені аналітично детектованим реагентом, таким як радіомічений ізотоп, флуоресцентна молекула або фермент. Антитіла можуть бути також застосовані для молекулярної ідентифікації та характеристики (епітоп картирування) антигенів. Антитіла за даним винаходом можуть бути включені до складу лікарського засобу для доставки до місця лікування, або зв'язані з детектованою міткою для полегшення одержання зображення місця, що містить клітини, які представляють інтерес, такі як клітини, інфіковані hCMV. Способи включення антитіл до складу лікарських засобів та зв'язування з детектованими мітками добре відомі з рівня техніки, також як і способи одержання зображення за допомогою детектованих міток. Мічені антитіла можуть бути застосовані для широкого діапазону аналізів, в яких використовують широкий діапазон міток. Детектування утворення комплексу антитілоантиген між антитілом за даним винаходом та епітопом (епітопом hCMV), що представляє інтерес, може бути полегшене шляхом приєднання детектованої субстанції до антитіла. Прийнятні засоби детектування включають використання таких міток, як радіонуклеотиди, ферменти, коферменти, флуоресцентні речовини, хемілюмінесцентні речовини, хромогени, ферментні субстрати або кофактори, ферментні інгібітори, комплекси простетичних груп, вільні радикали, частки, барвники і т.п. Приклади прийнятних ферментів включають пероксидазу хрону, лужну фосфатазу, β-галактозидазу або ацетилхолінестеразу; приклади прийнятних комплексів простетичних груп включають стрептавідин/біотин та авідин/біотин; приклади прийнятних флуоресцентних матеріалів включають умбеліферон, флуоресцеїн, флуоресцеїн ізотіоціанат, родамін, дихлортриазініламін флуоресцеїн, дансил хлорид або фікоеритрин; прикладом люмінесцентного матеріалу є люмінол; приклади біолюмінесцентних матеріалів включають люциферазу, люциферин та екворин; і приклади прийнятних радіоактивних 4 UA 100682 C2 125 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 131 35 3 матеріалів включають I, I, S або H. Такі мічені реагенти можуть бути використані в множині добре відомих аналізів, таких як радіоімунний аналіз, ферментні імуноаналізи, наприклад, ELISA, флуоресцентні імуноаналізи і т.п. Див., наприклад, посилання 15 - 18. Антитіло за даним винаходом може бути кон'юговане з лікарською групою, такою як цитотоксин, лікувальний засіб або іон радіоактивного металу або радіоізотоп. Приклади радіоізотопів включають, але не обмежуються наведеним, I-131, I-123, I-125, Y-90, Re-188, Re186, At-211, Cu-67, Bi-212, Bi-213, Pd-109, Tc-99, In-111 і т.п. Такі кон'югати антитіл можуть бути використані для модифікування даної біологічної відповіді; лікарська група не повинна бути тлумачена як група, обмежена класичними хімічними лікувальними засобами. Наприклад, лікарська група може бути протеїном або поліпептидом, що має бажану біологічну активністю. Такі протеїни можуть включати, наприклад, токсин, такий як арбін, рицин A, екотоксин синегнойної палички або дифтерійний токсин. Методи кон'югування такої лікувальної групи та антитіл добре відомі. Див., наприклад, Arnon et al. (1985) "Monoclonal Antibody for Immunotargeting of Drugs in Cancer Therapy, " в Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, ed. Reisfeld et al. (Alan R. Liss, Inc.), pp. 243-256; ed. Hellstrom et al. (1987) "Antibodies for Drug Delivery, " в Controlled Drug Delivery, ed. Robinson et al. (2d ed; Marcel Dekker, Inc.), pp. 623-653; Thorpe (1985) "Antibody Carriers of Cytotoxic Agents in Cancer Therapy: A Review, " в Monoclonal Antibodies "84: Biological and Clinical Applications, ed. Pinchera et al. pp. 475-506 (Editrice Kurtis, Milano, Italy, 1985); "Analysis, Results, and Future Prospective of the Therapeutic Use of Radiolabeled Antibody in Cancer Therapy, " в Monoclonal Antibodies for Cancer Detection and Therapy, ed. Baldwin et al. (Academic Press, New York, 1985), pp. 303-316; і Thorpe et al. (1982) Immunol. Rev. 62:119-158. Альтернативно, антитіло може бути кон'юговане з другим антитілом з утворенням гетерокон'югата антитіл, як описано в посиланні 19. Додатково, можуть бути використані лінкери між мітками та антитілами за даним винаходом [20]. Антитіла або їх антигензв'язуючі фрагменти можуть бути безпосередньо позначені радіоактивним йодом, індієм, ітрієм або іншою радіоактивною часткою, відомою з рівня техніки [21]. Лікування може складатися з комбінації лікування кон'югованими та некон'югованими антитілами, які вводять одночасно або послідовно [22, 23]. Антитіла за даним винаходом можуть бути приєднані до твердої підкладки. Додатково, антитіла можуть бути хімічно модифіковані шляхом ковалентної кон'югації з полімером для збільшення їх періоду напіввиведення з кровотоку, наприклад. Переважні полімери та способи їх приєднання до пептидів показані в посиланнях 24 - 27. Переважними полімерами є поліоксіетильовані поліоли та поліетиленгліколь (ПЕГ). ПЕГ розчинний у воді при кімнатній температурі та має загальну формулу: R(O-CH2-СН2)n-О-R, де R може бути воднем, або захисною групою, такою як алкільна або алканольна група. Переважно, захисна група містить від 1 до 8 атомів вуглецю, більш переважно, вона є метилом. Символ n є додатнім цілим числом, переважно від 1 до 1000, більш переважно, від 2 до 500. ПЕГ має переважну молекулярну масу від 1000 до 40000, більш переважно, від 2000 до 20000, найбільше переважно, від 3000 до 12000. Переважно, ПЕГ має, як мінімум, одну гідроксигрупу, більш переважно, вона є кінцевою гідроксигрупою. Така гідроксигрупа, переважно, активована для реакції з вільною аміногрупою в інгібіторі. Однак буде зрозуміло, що вид та кількість реакційноздатних груп можуть бути різними для одержання ковалентно кон'югованого ПЕГ/антитіло за даним винаходом. Розчинні у воді поліоксіетильовані поліоли також корисні в даному винаході. Вони включають поліоксіетильований сорбітол, поліоксіетильовану глюкозу, поліоксіетильований гліцерин (ПОГ) і т.п. ПОГ є переважним. Однією із причин цього є те, що структура гліцерину в поліоксіетильованому гліцерині аналогічна структурі, яка зустрічається в природі в, наприклад, моно-, ди- і тригліцеридах тварин та людей. Тому, таке розгалуження необов'язково буде розглядатися як чужорідний агент в організмі. ПОГ має переважну молекулярну масу в тому ж самому діапазоні, що й ПЕГ. Структура ПОГ показана в посиланні 28, а обговорення ПОГ/IL-2 кон'югатів наведене в посиланні 24. Інша система доставки ліків для збільшення періоду напіввиведення з кровотоку являє собою ліпосому. Способи одержання ліпосомних систем доставки обговорені в посиланнях 29, 30 і 31. Інші системи доставки ліків відомі з рівня техніки та описані, наприклад, у посиланнях 32 і 33. Антитіла за даним винаходом, переважно, забезпечені в очищеній формі. Типово, антитіло буде присутнє у композиції, яка, по суті, не містить інших поліпептидів, наприклад, менше 90 % (за масою), звичайно менше 60 % і більш звичайно, менше 50 % композиції приготовлено з інших поліпептидів. 5 UA 100682 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Антитіла за даним винаходом можуть бути імуногенними у нелюдських (або гетерологічних) хазяїв, наприклад, у мишей. Зокрема, антитіла можуть мати ідіотип, який є імуногенним у нелюдських хазяїв, але не у людського хазяїна. Антитіла за даним винаходом для застосування у людей включають антитіла, які не можуть бути одержані від таких хазяїв, як миші, кози, кролики, пацюки, неприматні ссавці і т.д., та не можуть бути одержані гуманізацією або від ксено-мишей. Антитіла за даним винаходом можуть бути антитілами будь-якого ізотипу (наприклад, IgA, IgG, IgM, тобто, α, γ або µ важким ланцюгом), але, загалом, будуть антитілами типу IgG. В ізотипі IgG антитіла можуть бути підкласами IgG1, IgG2, IgG3 або IgG4. Антитіла за даним винаходом можуть мати  або λ легкий ланцюг. Продукування антитіл Моноклональні антитіла за даним винаходом можуть бути одержані одним із способів, відомих з рівня техніки. Загальна методологія одержання моноклональних антитіл з використанням гібридомної технології добре відома [34, 35]. Переважно, використовують альтернативний спосіб іморталізації EBV, описаний у посиланні 36. Застосування способу описане в посиланні 36, B-клітини, що продукують антитіло за даним винаходом, можуть бути трансформовані EBV у присутності поліклонального активатора Bклітин. Трансформація EBV є стандартною технологією і може бути легко адаптована для включення активаторів поліклональних B-клітин. Додаткові стимулятори клітинного росту та диференціації можуть бути додані під час стадії трансформації для додаткового підвищення ефективності. Такими стимуляторами можуть бути цитокіни, такі як IL-2 та IL-15. В особливо переважному аспекті, IL-2 додають під час стадії іморталізації для додаткового підвищення ефективності іморталізації, але його використання не є істотним. Іморталізовані B-клітини, що продукуються за допомогою даних способів, можуть бути потім культивовані за допомогою способів, відомих з рівня техніки, і з них виділяють антитіла. Моноклональні антитіла можуть бути додатково очищені, при бажанні, за допомогою фільтрування, центрифугування та різних хроматографічних способів, таких як ВЕРХ або афінна хроматографія. Методи очищення моноклональних антитіл, включаючи методи продукування антитіл фармацевтичного ступеня чистоти, добре відомі з рівня техніки. Фрагменти моноклональних антитіл за даним винаходом можуть бути одержані з моноклональних антитіл способами, які включають дигестію ферментами, такими як пепсин або папаїн, та/або шляхом розщеплення дисульфідних зв'язків шляхом хімічного відновлення. Альтернативно, фрагменти моноклональних антитіл можуть бути одержані шляхом клонування та експресії частини послідовностей важких або легких ланцюгів. "Фрагменти" антитіл включають Fab, Fab", F(ab")2 та Fv фрагменти. Даний винахід також включає одноланцюгові Fv фрагменти (scFv), одержані з важких та легких ланцюгів моноклонального антитіла за даним винаходом. Наприклад, даний винахід включає scFv, що містить CDRs з антитіл за даним винаходом. Також включені мономери та димери важкого або легкого ланцюга, а також антитіла легкого ланцюга, наприклад, Fv легкого ланцюга, в якому варіабельні домени важкого та легкого ланцюгів з'єднані пептидним лінкером. Стандартні методи молекулярної біології можуть бути використані для одержання ДНК послідовностей, кодуючих антитіла або фрагменти антитіл за даним винаходом. Бажані ДНК послідовності можуть бути синтезовані повністю або частково, використовуючи методи олігонуклеотидного синтезу. За необхідності можуть бути використані методи сайтспрямованого мутагенезу та полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР). Для експресії ДНК послідовностей, кодуючих молекули антитіл за даним винаходом або їх фрагменти, можуть бути використані будь-які прийнятні системи клітини-хазяїна/векторні системи. Можуть бути використані бактеріальні, наприклад, E. coli, та інші мікробні системи, частково, для експресії фрагментів антитіл, таких як Fab та F(ab") 2 фрагменти, особливо, Fv фрагментів та фрагментів одноланцюгових антитіл, наприклад, одноланцюгових Fvs. Еукаріотні системи експресії клітин-хазяїв, наприклад, ссавців, можуть бути використані для продукування великих молекул антитіл, включаючи молекули повних антитіл. Прийнятні клітини-хазяїва ссавців включають CHO, HEK293T, PER.C6, мієломні або гібридомні клітини. Даний винахід також забезпечує спосіб продукування молекули антитіла за даним винаходом, що включає культивування клітини-хазяїна, яка містить вектор за даним винаходом, в умовах, прийнятних для експресії протеїну із ДНК, кодуючої молекулу антитіла за даним винаходом, та виділення молекули антитіла. Молекула антитіла може містити тільки поліпептид важкого або легкого ланцюга, у такому випадку тільки послідовність, кодуюча поліпептид важкого або легкого ланцюга, повинна бути 6 UA 100682 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60використана для трансфекції клітин-хазяїв. Для продукування продуктів, що містять як важкі, так і легкі ланцюги, клітинні лінії можуть бути трансфіковані двома векторами, першим вектором, що кодує поліпептид легкого ланцюга, і другим вектором, що кодує поліпептид важкого ланцюга. Альтернативно, може бути використаний один вектор, де вектор містить послідовності, що кодують поліпептиди важкого та легкого ланцюга. Альтернативно, антитіла за даним винаходом можуть бути продуковані шляхом i) експресії послідовності нуклеїнової кислоти за даним винаходом в клітині, та ii) виділення експресованого продукту антитіла. Додатково, спосіб може включати iii) очищення антитіла. Скринінг та виділення В-клітин Трансформовані В-клітини піддають скринінгу на предмет виявлення В-клітин, що продукують антитіла, які мають бажану специфічність антигенів, та індивідуальні клони В-клітин потім можуть бути продуковані з позитивних клітин. Стадія скринінгу може бути здійснена за допомогою методу ELISA, шляхом забарвлення тканин або клітин (включаючи трансфіковані клітини), аналізу нейтралізації або одного з ряду способів, відомих з рівня техніки для ідентифікації бажаної специфічності антигену. В аналізі відбір може бути зроблений на підставі простого розпізнавання антигенів, або відбір може бути зроблений на підставі додаткової бажаної функції, наприклад, для відбору нейтралізуючих антитіл, а не просто антигензв'язуючих антитіл, для відбору антитіл, які можуть змінювати характеристики клітин-мішеней, таких як їх сигнальні каскади, їх форма, швидкість їх росту, здатність впливати на інші клітини, відгук на вплив інших клітин або інших реагентів або зміну умов, статус їх диференціації, і т.д. Стадія клонування для розділення індивідуальних клонів та суміші позитивних клітин може бути проведена за допомогою серійного розведення, мікроманіпулювання, одноклітинного осадження шляхом клітинного сортингу або іншого способу, відомого з рівня техніки. Переважно, клонування проводять за допомогою серійного розведення. Клони іморталізованих В-клітин за даним винаходом можуть бути застосовані різними способами, наприклад, як джерело моноклональних антитіл, як джерело нуклеїнової кислоти (ДНК або іРНК), кодуючої моноклональне антитіло, що представляє інтерес, для досліджень, і т.д. Даний винахід забезпечує композицію, що містить іморталізовані В-лімфоцити пам'яті, де лімфоцити продукують антитіла, що мають високу нейтралізуючу активність, специфічну стосовно hCMV, і де антитіла продукують при ≥5 пг на одну клітину на день. Даний винахід також забезпечує композицію, що містить клони іморталізованих В-лімфоцитів пам'яті, де клони продукують моноклональне антитіло, що має високу афінність, специфічну стосовно hCMV, де N антитіло продукують при ≥10 нг на один клон на день. Переважно, зазначені клони продукують моноклональне антитіло, що має високу активність при нейтралізації hCMV інфекції. Переважними клонами іморталізованих В-клітин за даним винаходом є 1F11 та 2F4. Додатковими переважними клонами є 5A2 та 9A11. Епітопи Як зазначено вище, антитіла за даним винаходом можуть бути використані для картирування епітопів, з якими вони зв'язуються. Заявники відкрили, що антитіла 1F11, 2F4, 5A2 та 9A11, що нейтралізують інфікування hCMV ендотеліальних клітин, епітеліальних клітин, ретинальних клітин та дендроподібних клітин, спрямовані на епітоп, виявлений у комбінації UL130 та UL131A. Хоча заявник не прагне бути обмеженим даною теорією, вважають, що антитіла 1F11 та 2F4 зв'язуються з конформаційним епітопом, утвореним даними двома протеїнами. Також вважають, що 5A2 та 9A11 також зв'язуються з таким конформаційним епітопом, утвореним UL130 та UL131A. Внаслідок того факту, що 1F11, 2F4, 5A2 та 9A11 не нейтралізують інфікування фібробластів, теоретично допускають, що дані антитіла розпізнають різні епітопи до людських моноклональних антитіл 10C6, 5F1, 6B4 та 7H3. Додатково, вважають, що моноклональні антитіла 10C6, 5F1, 7H3 та 6B4 зв'язуються з функціональним епітопом gB. Епітопи, розпізнані такими антитілами, можуть мати ряд застосувань. Епітопи та мімеотопи в очищеній або синтезованій формі можуть бути застосовані для підвищення імунної відповіді (тобто, як вакцина, або для продукування антитіл для іншого застосування) або для скринінгу сироватки пацієнта для виявлення антитіл, які імуннореагують з епітопами або мімеотопами. Переважно, такий епітоп або мімеотоп, або антиген, що містить такий епітоп або мімеотоп, використовують як вакцину для підвищення імунної відповіді. Антитіла за даним винаходом також можуть використовуватись в способі для моніторингу якості вакцин, зокрема, для перевірки того, що антиген у складі вакцини містить правильний імуногенний епітоп у правильній конформації. 7 UA 100682 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Епітопи також можуть бути корисні при скринінгу на предмет виявлення лігандів, які зв'язуються із зазначеними епітопами. Такі ліганди, переважно, блокують епітопи і, таким чином, запобігають інфікуванню. Такі ліганди входять в обсяг даного винаходу. Рекомбінантна експресія Іморталізовані В-лімфоцити пам'яті за даним винаходом також можуть бути використані як джерело нуклеїнової кислоти для клонування генів антитіл для наступної рекомбінантної експресії. Експресія з рекомбінантних джерел є більш традиційною для застосування у фармацевтичних цілях, ніж експресія з В-клітин або гібридом, наприклад, через стабільність, репродуктивну здатність, легкість культивування і т.д. Таким чином, даний винахід забезпечує спосіб одержання рекомбінантної клітини, що містить стадії: (i) одержання однієї або більше нуклеїнових кислот (наприклад, генів важкого та/або легкого ланцюга) із клону В-клітин, кодуючого антитіло, що представляє інтерес; та (ii) вставку нуклеїнової кислоти в носій експресії для того, щоб дозволити експресію антитіла, що представляє інтерес, в даному носії. Аналогічно, даний винахід забезпечує спосіб одержання рекомбінантної клітини, що містить стадії: (i) секвенування нуклеїнової кислоти (нуклеїнових кислот) із клону В-клітин, який кодує антитіло, що представляє інтерес; та (ii) використання інформації про послідовності, одержаної на стадії (i) для одержання нуклеїнової кислоти (нуклеїнових кислот) для вставки в носій експресії для того, щоб дозволити експресію антитіла, що представляє інтерес, в даному носії. Даний винахід також забезпечує спосіб одержання рекомбінантної клітини, що включає стадію трансформації клітини-хазяїна однією або більше нуклеїновими кислотами, які кодують моноклональне антитіло, що представляє інтерес, де нуклеїнові кислоти є нуклеїновими кислотами, одержаними із клону іморталізованих В-клітин за даним винаходом. Таким чином, процедури для першого одержання нуклеїнової кислоти (нуклеїнових кислот) і наступного використання для трансформації клітини-хазяїна можуть бути здійснені в різний час різними людьми в різних місцях (наприклад, у різних країнах). Такі рекомбінантні клітини за даним винаходом можуть бути потім застосовані для експресії та культивування. Вони, особливо, корисні для експресії антитіл для широкомасштабного фармацевтичного виробництва. Вони також можуть бути застосовані як активний інгредієнт фармацевтичної композиції. Можуть бути застосовані будь-які прийнятні засоби культивування, включаючи, але не обмежуючись наведеним, стаціонарне культивування, культивування за допомогою обертового флакона, асцитну рідину, картридж біореактора мембранного типу, модульний міні-ферментер, реактор з механічним перемішуванням, культуру на мікроносіях, перфузію з керамічними заповнювачами, і т.д. Способи одержання й секвенування імуноглобулінових генів з В-клітин добре відомі з рівня техніки, наприклад, див. посилання 37. Носієм експресії, переважно, є еукаріотна клітина, включаючи дріжджові клітини та клітини тварин, особливо, клітини ссавців (наприклад, CHO клітини, людські клітини, такі як PER.C6 [Crucell; посилання 38] або HKB-11 [Bayer; посилання 39 і 40] клітини, мієломні клітини [41 і 42], і т.д.), а також рослинні клітини. Переважні носії експресії можуть глікозилувати антитіло за даним винаходом, особливо, які мають вуглеводні структури, які самі по собі не є імуногенними у людей. Носії експресії, які можуть рости в середовищах, що не містять сироватки, є переважними. Носії експресії, які можуть рости в культурі за відсутності продуктів, одержаних із тварин, є переважними. Носій експресії може бути культивований з одержанням клітинної лінії. Даний винахід забезпечує спосіб одержання однієї або більше молекул нуклеїнової кислоти (наприклад, генів важкого та легкого ланцюгів), кодуючих антитіло, що представляє інтерес, який містить стадії: (i) одержання клону іморталізованих В-клітин за даним винаходом; (ii) одержання із клону В-клітин нуклеїнової кислоти, кодуючої антитіло, що представляє інтерес. Даний винахід також забезпечує спосіб одержання послідовності нуклеїнової кислоти, кодуючої антитіло, що представляє інтерес, який містить стадії: (i) одержання клону іморталізованих Вклітин за даним винаходом; (ii) секвенування із клону В-клітин нуклеїнової кислоти, кодуючої антитіло, що представляє інтерес. Даний винахід також забезпечує спосіб одержання молекули (молекул) нуклеїнової кислоти, кодуючої антитіло, що представляє інтерес, який містить стадію одержання нуклеїнової кислоти із клону В-клітини, одержанного із трансформованої В-клітини за даним винаходом. Таким чином, процедури першого одержання клону В-клітини та наступного одержання нуклеїнової кислоти (нуклеїнових кислот) з неї, можуть бути здійснені в зовсім різний час різними людьми в різних місцях (наприклад, у різних країнах). 8 UA 100682 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Даний винахід забезпечує спосіб одержання антитіла (наприклад, для фармацевтичного застосування), що включає стадії: (i) одержання та/або секвенування однієї або більше нуклеїнових кислот (наприклад, генів важкого та легкого ланцюгів) з відібраного клону В-клітин, експресуючого антитіло, що представляє інтерес; (ii) вставки нуклеїнової кислоти (нуклеїнових кислот) в або використання нуклеїнової кислоти (нуклеїнових кислот) для одержання носія експресії, що може експресувати антитіло, що представляє інтерес; (iii) культивування або субкультивування носія експресії в умовах експресії антитіла, що представляє інтерес; і, необов'язково, (iv) очищення антитіла, що представляє інтерес. Даний винахід також забезпечує спосіб одержання антитіла, що містить стадії: культивування або субкультивування популяції клітин-носіїв експресії в умовах експресії антитіла, що представляє інтерес, й, необов'язково, очищення антитіла, що представляє інтерес, де зазначену популяцію клітин-носіїв експресії одержують (i) забезпеченням нуклеїнової кислоти (нуклеїнових кислот), кодуючої (кодуючих) відібране антитіло В-клітини, що представляє інтерес, продуковане популяцією В-лімфоцитів пам'яті, одержаними так, як описано вище, (ii) вставкою нуклеїнової кислоти (нуклеїнових кислот) у носій експресії, який може експресувати антитіло, що представляє інтерес, та (iii) культивуванням або субкультивуванням носіїв експресії, що містять зазначені вставлені нуклеїнові кислоти з одержанням зазначеної популяції клітин-носіїв експресії. Таким чином, процедури для першого одержання рекомбінантного носія експресії та його наступного культивування для експресії антитіл можуть бути здійснені в зовсім різний час різними людьми в різних місцях (наприклад, у різних країнах). Фармацевтичні композиції Застосування антитіл як активного інгредієнту фармацевтичних композицій у цей час широко поширене, включаючи продукти Herceptin™ (трастузумаб), Rituxan™, Campath™, Remicade™, ReoPro™, Mylotarg™, Zevalin™, Omalizumab, Synagis™ (палавізумаб), Zenapax™ (даклізумаб) і т.д. Даний винахід, таким чином, забезпечує фармацевтичну композицію, що містить антитіла за даним винаходом та/або нуклеїнову кислоту, кодуючу такі антитіла та/або іморталізовані Вклітини, що експресують такі антитіла та/або епітопи, які розпізнаються антитілами за даним винаходом. Фармацевтична композиція також може містити фармацевтично прийнятний носій для того, щоб дозволити введення. Носій не повинен сам викликати продукування антитіл, шкідливих для пацієнтів, що одержують композицію, і не повинен бути токсичним. Прийнятні носії можуть бути великими макромолекулами з уповільненим метаболізмом, такими як протеїни, поліпептиди, ліпосоми, полісахариди, полімолочні кислоти, полігліколеві кислоти, полімерні амінокислоти, кополімери амінокислот та частки неактивних вірусів. Можуть бути використані фармацевтично прийнятні солі, наприклад, солі мінеральних кислот, такі як гідрохлориди, гідроброміди, фосфати та сульфати, або солі органічних кислот, такі як ацетати, пропіонати, малонати та бензоати. Фармацевтично прийнятні носії в лікувальній композиції можуть додатково містити рідини, такі як вода, сольовий розчин, гліцерин та етиловий спирт. Додатково, у таких композиціях можуть бути присутні допоміжні речовини, такі як змочувальні та емульгуючі агенти або pH буферні речовини. Такі носії дозволяють одержувати фармацевтичні композиції у вигляді таблеток, пігулок, драже, капсул, рідин, гелів, сиропів та суспензій, для прийому усередину пацієнтом. Переважні форми введення включають форми, прийнятні для парентерального введення, наприклад, шляхом ін'єкції або інфузії, наприклад, шляхом болюсної або безперервної інфузії. Якщо продукт призначений для ін'єкції або інфузії, він може мати форму суспензії, розчину або емульсії в носії на основі масла або води, і може містити засоби для одержання композиції, такі як суспендувальні, консервуючі, стабілізуючі та/або диспергуючі засоби. Альтернативно, молекула антитіла може перебувати в сухій формі, для відновлення перед застосуванням з використанням відповідної стерильної рідини. Після одержання, композиції за даним винаходом можуть бути введені безпосередньо суб'єкту. Переважним є, якщо композиції адаптовані для введення людям. Фармацевтична композиція за даним винаходом може бути введена за допомогою будь-якої кількості маршрутів, включаючи, але не обмежуючись наведеним, пероральний, внутрішньовенний, внутрішньом'язовий, внутрішньоартеріальний, внутрішньомозковий, інтраперітонеальний, інтратекальний, інтравентрикулярний, трансдермальний, крізьшкірний, місцевий, підшкірний, інтраназальний, ентеральний, під'язиковий, інтравагінальний або ректальний маршрути. Також для введення фармацевтичної композиції за даним винаходом можуть бути використані безголкові шприци. Типово, лікувальна композиція може бути 9 UA 100682 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 одержана як композиція для впорскування, у вигляді рідких розчинів або суспензій. Також можуть бути одержані тверді форми, прийнятні для розчинів або суспензій у рідких основах перед ін'єкцією. Безпосереднє введення композиції буде, загалом, супроводжуватися ін'єкцією, підшкірно, інтраперітонеально, внутрішньовенно або внутрішньом'язово, або вона буде доставлена в міжклітинний простір тканин. Композиції також можуть бути введені в осередок ураження. Дозоване лікування може бути проведене за схемою одноразового прийому або за схемою багаторазового прийому. Відомі фармацевтичні засоби на основі антитіл забезпечують рекомендації щодо частоти введення, наприклад, відносно того, чи повинні лікарські засоби бути доставлені щодня, щотижня, щомісяця тощо. Частота й дозування також можуть залежати від тяжкості симптомів. Композиція за даним винаходом може бути одержана в різних формах. Наприклад, композиції можуть бути одержані як композиції, що впорскують, у вигляді рідких розчинів або суспензій. Також можуть бути одержані тверді форми, прийнятні для одержання розчинів або суспензій у рідких носіях перед ін'єкцією (наприклад, ліофілізована композиція, така як Synagis™ і Herceptin™, для відновлення стерильною водою, що містить консервант). Може бути одержана композиція для місцевого введення, наприклад, у вигляді мазі, крему або порошку. Може бути одержана композиція для перорального введення, наприклад, у вигляді таблетки або капсули, у вигляді спрею, або у вигляді сиропу (необов'язково ароматизованого). Може бути одержана композиція для легеневого введення, наприклад, у вигляді інгалятора, з використанням тонкодисперсного порошку або спрею. Може бути одержана композиція у вигляді супозиторію або песарію. Може бути одержана композиція для назального введення, введення у вуха або очі, наприклад, у вигляді крапель. Композиція може бути у вигляді набору, сконструйованого таким чином, щоб об'єднана композиція була відновлена безпосередньо перед введенням пацієнтові. Наприклад, може бути забезпечене ліофілізоване антитіло у вигляді набору, що містить стерильну воду або стерильний буфер. Буде оцінено, що активним інгредієнтом у композиції буде молекула антитіла. Як така, вона буде чутлива до розпаду в шлунково-кишковому тракті. Таким чином, якщо композиція призначена для введення за маршрутом, що включає шлунково-кишковий тракт, то необхідно, щоб композиція містила агенти, що захищають антитіло від розпаду, але вивільняють антитіло після його поглинання зі шлунково-кишкового тракту. Докладне обговорення фармацевтично прийнятних носіїв наведене в Gennaro (2000) Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20th edition, ISBN: 0683306472. Фармацевтична композиція за даним винаходом, загалом, має значення pH від 5,5 до 8,5, переважно від 6 до 8, і більш переважно приблизно 7. Значення pH можна підтримувати шляхом застосування буфера. Композиція може бути стерильною та/або не містити пірогенів. Композиція може бути ізотонічною стосовно людей. Фармацевтичні композиції за даним винаходом переважно поставляють у герметично закритих контейнерах. Фармацевтична композиція буде містити ефективну кількість одного або більше антитіл за даним винаходом та/або одну або більше іморталізованих В-клітин за даним винаходом, та/або поліпептид, що містить епітоп, який зв'язує антитіло за даним винаходом, тобто, кількість, достатню для лікування, поліпшення або профілактики бажаного захворювання або стану, або для прояву детектованого лікувального ефекту. Лікувальні ефекти також включають зменшення фізичних симптомів. Точна ефективна кількість для будь-якого конкретного суб'єкта буде залежати від його габаритів та стану здоров'я, природи та ступеня стану, і лікувальних засобів або комбінації лікувальних засобів, відібраних для введення. Ефективну кількість для даної ситуації визначають за допомогою стандартних експериментів і в рамках оцінки, зробленої лікарем-клініцистом. Для цілей даного винаходу, ефективна доза буде, загалом, становити від приблизно 0,01 мг/кг до приблизно 50 мг/кг, або від приблизно 0,05 мг/кг до приблизно 10 мг/кг композиції за даним винаходом для пацієнта, якому її вводять. Відомі фармацевтичні засоби на основі антитіл забезпечують рекомендації щодо такої дози, наприклад, Herceptin™ вводять шляхом внутрішньовенної інфузії розчину в концентрації 21 мг/мл, де первісна ударна доза становить 4 мг/кг маси тіла, а щотижнева підтримуюча доза становить 2 мг/кг маси тіла; 2 Rituxan™ уводять щотижня в дозі 375 мг/м ; і т.д. Композиція може містити більше одного (наприклад, 2, 3, 4, 5 і т.д.) антитіл за даним винаходом, особливо, коли такі антитіла зв'язуються з різними антигенами (або різними епітопами в тому ж самому антигені) для забезпечення адитивного або синергічного лікувального ефекту. Наприклад, одне антитіло може зв'язуватися з комбінацією (або комплексом) UL130-UL131A, у той час, як інше антитіло може зв'язуватися з gH. У додатковому прикладі, одне антитіло може зв'язуватися з комбінацією (або комплексом) UL130-UL131A, у той 10 UA 100682 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 час, як інше антитіло може зв'язуватися з gB. Таким чином, одне антитіло може бути спрямоване на механізм, що опосередковує інфікування фібробластів, у той час як інше антитіло може бути спрямоване на механізм, що опосередковує інфікування ендотеліальних клітин. Для оптимального клінічного ефекту корисним може бути застосування механізмів інфікування та збереження hCMV. Антитіла за даним винаходом можуть бути введені (у комбінації або окремо) з іншими лікарськими засобами, наприклад, з хіміотерапевтичними сполуками, із променевою терапією, і т.д. Переважні лікарські сполуки включають противірусні сполуки, такі як ганцикловір, фоскамед і цидофовір. Така комбінована терапія забезпечує адитивне або синергічне підвищення терапевтичної активності стосовно індивідуальних лікарських засобів при введенні окремо. Термін "синергія" використовують для опису комбінованого ефекту двох або більше активних засобів, що перевищує суму індивідуальних ефектів кожного відповідного активного засобу. Таким чином, якщо комбінований ефект двох або більше засобів приводить до "синергічного інгібування" активності або процесу, мається на увазі, що інгібування активності або процесу перевищує суму інгібуючих ефектів кожного відповідного активного засобу. Термін "синергічний лікувальний ефект" відноситься до лікувального ефекту, що спостерігається при використанні комбінації двох або більше лікарських засобів, де лікувальний ефект (який вимірюють за допомогою будь-якої кількості параметрів) перевищує суму окремих лікувальних ефектів, що спостерігаються при використанні відповідних окремих лікарських засобів. Антитіла можуть бути введені тим пацієнтам, для яких попередньо було показано відсутність реакції на лікування hCMV інфекції, тобто, було показано, що вони не піддаються анти-hCMV лікуванню. Таке лікування може включати попереднє лікування противірусним агентом. Це може бути викликано, наприклад, інфекцією стійкого до противірусного лікування штаму hCMV. У композиції за даним винаходом, яка включає антитіла за даним винаходом, антитіла переважно становлять, як мінімум, 50 % за масою (наприклад, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 97 %, 98 %, 99 % або більше) від загального вмісту протеїну в композиції. Антитіла, таким чином, перебувають в очищеній формі. Даний винахід забезпечує спосіб одержання фармацевтичного засобу, що включає стадії: (i) одержання антитіла за даним винаходом; і (ii) змішування очищеного антитіла з одним або більше фармацевтично прийнятним носієм. Даний винахід також забезпечує спосіб одержання фармацевтичного засобу, що включає стадію змішування антитіла з одним або більше фармацевтично прийнятним носієм, де антитіло є моноклональним антитілом, одержаним із трансформованої В-клітини за даним винаходом. Таким чином, процедури для першого одержання моноклонального антитіла та наступного одержання фармацевтичного засобу можуть бути здійснені в зовсім різний час різними людьми в різних місцях (наприклад, у різних країнах). Як альтернатива доставці антитіл або В-клітин у лікувальних цілях, можливо доставляти суб'єкту нуклеїнову кислоту (типово, ДНК), кодуючу моноклональне антитіло (або його активний фрагмент), що представляє інтерес, таким чином, що нуклеїнова кислота може бути експресована в організмі суб'єкта in situ для забезпечення бажаного лікувального ефекту. Прийнятна генна терапія та вектори доставки нуклеїнових кислот відомі з рівня техніки. Композиція за даним винаходом може бути імуногенною композицією, більш переважно композицією вакцини, що містить антиген, який містить епітоп, виявлений у комбінації hCMV протеїнів UL130 та UL131A. Альтернативна композиція може містити (i) антиген, що містить епітоп, виявлений у комбінації hCMV протеїнів UL130 і UL131A, та (ii) антиген, що містить епітоп, виявлений в hCMV gВ. Вакцини за даним винаходом можуть бути профілактичними (тобто, запобігати інфікування) або лікувальними (тобто, для лікування інфекції), але, типово, будуть профілактичними. Композиції можуть включати антимікробні композиції, особливо, якщо вони упаковані у формат для багаторазового прийому. Композиція може містити детергент, наприклад, Tween (полісорбат), такий як Tween 80. Детергенти, загалом, присутні в малих кількостях, наприклад, 2 мкг/мл).  Cytotect (Biotest) є пулом hCMV гіперімунного IgG. 30 35 40 Деякі антитіла нейтралізували інфікування як фібробластів, так і ендотеліальних клітин при концентраціях IgG у діапазоні від 0,3 до 0,5 мкг/мл. Інші антитіла (1F11, 5A2, 9A11 і 2F4) не були здатні нейтралізувати інфікування hCMV фібробластів, але нейтралізували інфікування ендотеліальних клітин при надзвичайно низьких концентраціях у діапазоні від 0,001 до 0,004 мкг/мл (більш ніж в 1000 разів більш ефективно, ніж раніше відомі антитіла). Слід зазначити, що при початковій характеристиці було визначено, що 5F1 зв'язується з епітопом gB, а не gH. Це узгоджується з результатами, які демонструють, що блокування gB дозволяє нейтралізацію інфікування фібробластів, що спостерігали для 7H3, 10C6 та 6B4. Приклад 2: Ідентифікація антигенів-мішеней, розпізнаних моноклональними антитілами Людські MRC-9 фібробласти інфікували клінічним hCMV ізолятом. Через 3 дні клітини 35 метаболічно позначали S метіоніном і цистеїном. Після попереднього виведення лізату додавали людські моноклональні антитіла 1F11 та 2F4, а імунокомплекси осаджували шляхом додавання підкладок протеїну A і розкладали на SDS-PAGE (Фігура 1). Людське моноклональне 14 UA 100682 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 IgG антитіло з нерелевантною специфічністю використовували як негативний контроль. Результати показують, що людські моноклональні антитіла 1F11 та 2F4 осаджують комплекси CMV протеїнів. Для картирування специфічності людських моноклональних антитіл конструювали вектори експресії, кодуючі маркіровані гемаглютиніном (HA) UL1281-27, UL1301-25 и UL131A1-18 hCMV протеїни, у яких були відсутні сигнальні пептиди. НEK293T клітини трансфікували даними векторами окремо або в комбінації. Через 36 годин, клітини фіксували, перегородку робили проникною та забарвлювали їх анти-HA антитілом (для контролю ефективності трансфекції) і моноклональним антитілом, а потім цапиним антилюдським IgG. HuMab IgG, що мають нерелевантну специфічність, використовували як негативний контроль. На Фігурі 2A показано, що людські моноклональні антитіла 1F11 та 2F4 розпізнають конформаційний епітоп, утворений UL130 та UL131A генними продуктами. На Фігурі 2B показано, що людські моноклональні антитіла 5A2 і 9А11 розпізнають конформаційний епітоп, одержаний з UL130 і UL131A генних продуктів. Висновок Вищевказані результати визначають два людських моноклональних антитіла, здатних до високоефективної нейтралізації та селективності стосовно hCMV інфекції людських ендотеліальних клітин. Для ідентифікації розпізнаного епітопа, антитіла аналізували на їх здатність до імуноосадження протеїнів з інфікованих клітин hCMV (Фігура 1). Людські Mabs 1F11 та 2F4 осаджували кілька протеїнів, що мають середню молекулярну масу 15, 33 - 35 і 100 кДа. Дані моделі узгоджуються з осадженням комплексу, що містить gH, gL та UL128, UL130 і, можливо, UL131 A. Для більш точного визначення мішені таких антитіл ми охарактеризували їх здатність до забарвлення HEK293T клітин, трансфікованих векторами, що кодують HA-маркований UL128, UL130 та UL131A. Як показано на Фігурі 2A, 1F11 та 2F4 забарвлювали тільки клітини, які коекспресували UL130 та UL131A, що припускає розпізнавання ними конформаційного епітопа, визначеного такими двома генними продуктами. Даний висновок підтверджений тим фактом, що дані антитіла не реагують в аналізі вестерн-блотинг із лізатами інфікованих або трансфікованих клітин в умовах відновлення й денатурації (дані не показані). Аналогічні результати одержували для 5A2 та 9A11. На Фігурі 2b показано, що такі антитіла забарвлювали тільки клітини, коекспресуючі UL130 та UL131A, що припускає розпізнавання ними конформаційного епітопа, визначеного такими двома генними продуктами. Приклад 3: Додаткова ідентифікація антигенів-мішеней, розпізнаних моноклональними антитілами Для картирування специфічності людських моноклональних антитіл, що нейтралізують інфікування фібробластів, був сконструйований вектор експресії, що кодує повнорозмірний gB. HEK293T клітини були трансфіковані даним вектором. Через 36 годин, клітини фіксували, порушували проникність стінок і забарвлювали людським моноклональним антитілом (HuMab), а потім цапиним антилюдським IgG. На Фігурі 4 показано, що моноклональні антитіла 7H3, 10C6, 5F1 і 6B4 (але не IgG антитіло, що має нерелевантну специфічність) специфічно забарвлювали клітини, трансфіковані gB, що вказує на те, що вони розпізнають епітоп gB. Слід особливо зазначити, що моноклональні антитіла 10C6, 5F1 і 6B4 нейтралізують інфікування фібробластів і ендотеліальних клітин, у той час, як моноклональне антитіло 7H3 нейтралізує інфікування фібробластів (але не ендотеліальних клітин). Даний винахід припускає, що моноклональні антитіла 10C6, 5F1 і 6B4 зв'язуються з функціональним епітопом gB, відмінним від епітопа, зв'язаного моноклональним антитілом 7H3. Буде зрозуміло, що винахід був описаний тільки за допомогою прикладів, а модифікації можуть бути зроблені, не виходячи за рамки та сутність даного винаходу. ПОСИЛАННЯ (зміст яких включено в дану заявку шляхом посилань) [1] Plachter, В., З, Sinzger, and G. Jahn. 1996. Cell types involved in replication and distribution of human cytomegalovirus. Adv Virus Res 46:195-261. [2] Gerna, G., E. Percivalle, F. Baldanti, and M.G. Revello. 2002. Lack of transmission to polymorphonuclear leukocytes and human umbilical vein endothelial cells as a marker of attenuation of human cytomegalovirus. J Med Virol 66:335-339. [3] Adler, В., L. Scrivano, Z. Ruzcics, B. Rupp, C. Sinzger, and U. Koszinowski. 2006. Role of human cytomegalovirus UL131A in cell type-specific virus entry and release. J Gen Virol 87:24512460. [4] Gema, G., E. Percivalle, D. Lilleri, L. Lozza, З Fornara, G. Hahn, F. Baldanti, and M.G. Revello. 2005. Dendritic-cell infection by human cytomegalovirus is restricted to strains carrying functional 15 UA 100682 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 UL131-128 genes and mediates efficient viral antigen presentation to CD8+T cells. J Gen Virol 86:275-284. [5] Hahn, G., M.G. Revello, M. Patrone, E. Percivalle, G. Campanini, A. Sarasini, M. Wagner, A. Gallina, G. Milanesi, U. Koszinowski, F. Baldanti, and G. Gema. 2004. Human cytomegalovirus UL131-128 genes are indispensable for virus growth in endothelial cells and virus transfer to leukocytes. J Virol 78:10023-10033. [6] Patrone, M., M. Secchi, L. Fiorina, M. Ierardi, G. Milanesi, and A. Gallina. 2005. Human cytomegalovirus UL130 protein promotes endothelial cell infection through a producer cell modification of the virion. J Virol 79:8361-8373. [7] Wang, D., and T. Shenk. 2005. Human cytomegalovirus virion protein complex required for epithelial and endothelial cell tropism. ProcNatlAcadSci USA 102:18153-18158. [8] Wang, D., and T. Shenk. 2005. Human cytomegalovirus UL131 open reading frame is required for epithelial cell tropism. J Virol 79:10330-10338. [9] Nigro, G., S.P. Adler, R. La Torre, and A.M. Best. 2005. Passive immunization during pregnancy for congenital cytomegalovirus infection. N Engl J Med 353:1350-1362. [10] Borucki, M.J., J. Spritzler, D.M. Asmuth, J. Gnann, M.S. Hirsch, M. Nokta, F. Aweeka, P.I. Nadler, F. Sattler, B. Alston, T.T. Nevin, S. Owens, K. Waterman, L. Hubbard, A. Caliendo, and R.B. Pollard. 2004. A phase II, double-masked, randomized, placebo-controlled evaluation of a human monoclonal anti-cytomegalovirus antibody (MSL-109) in combination with standard therapy versus standard therapy alone in the treatment of AIDS patients with Cytomegalovirus retinitis. Antiviral Res. 64:103-111. [11] Hamilton, A.A., D.M. Manuel, J.E. Grandy, A.J. Turner, S.I. King, J.R, Adair, P. White, F.J.Carr, and W.J. Harris. 1997. A humanized antibody against human cytomegalovirus (CMV) gpUL75 (g) for prophylaxis or treatment of CMV infections. J Infect Dis 176:59-68. [12] Lefranc, MP. et al. 2003 IMGT unique numbering for immunoglobulin and T cell receptor variable domains and Ig superfamily V-like domains. Dev Comp Immunol. 27(1):55-77. [13] Lefranc, MP. 1997. Unique database numbering system for immunogenetic analysis. Immunology Today, 18:509. [14] Lefranc, MP. 1999. The IMGT unique numbering for Immunoglobulins, T cell receptors and Ig-like domains. The Immunologist, 7:132-136. [15] US 3,766,162 [16] US 3,791,932 [17] US 3,817,837 [18] US 4,233,402 [19] US 4,676,980 [20] US 4,831,175 [21] US 5,595,721 [22]WO 00/52031 [23] WO 00/52473 [24] US 4,766,106 [25] US 4,179,337 [26] US 4,495,285 [27] US 4,609,546 [28] Knauf et al. (1988)7. Bio. Chem. 263:15064-15070 [29] Gabizon et al. (1982) Cancer Research 42:4734 [30] Cafiso (1981) Biochem Biophys Acta 649:129 [31] Szoka (1980) Ann. Rev. Biophys. Eng. 9:467 [32] Poznansky et al. (1980) Drug Delivery Systems (R.L. Juliano, ed, Oxford, N.Y.) pp. 253-315 [33] Poznansky (1984) Pharm Revs 36:277 [34] Kohler, G. and Milstein, C, . 1975, Nature 256:495-497. [35] Kozbar et al. 1983, Immunology Today 4:72. [36] WO 2004/076677 [37] Chapter 4 °F Kuby Immunology (4th edition, 2000; ASIN: 0716733315 [38] Jones et al. BiotechnolProg 2003,19(l):163-8 [39] Cho et al. Cytotechnology 2001, 37:23-30 [40] Cho et al. Biotechnol Prog 2003, 19:229-32 [41] US 5,807,715 [42] US 6,300,104 60 16 UA 100682 C2 ФОРМУЛА ВИНАХОДУ 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 1. Виділене антитіло або його антигензв'язуючий фрагмент, що інгібує інфікування людським цитомегаловірусом (hCMV), при цьому антитіло містить а) послідовності CDR1, CDR2 та CDR3 важкого ланцюга, зазначені в SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 та SEQ ID NO: 3, відповідно, та послідовності CDR1, CDR2 та CDR3 легкого ланцюга, зазначені в SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 та SEQ ID NO: 6, відповідно; б) послідовності CDR1, CDR2 та CDR3 важкого ланцюга, зазначені в SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12 та SEQ ID NO: 13, відповідно, та послідовності CDR1, CDR2 та CDR3 легкого ланцюга, зазначені в SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15 та SEQ ID NO: 16, відповідно; або в) послідовності CDR1, CDR2 та CDR3 важкого ланцюга, зазначені в SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34 та SEQ ID NO: 35, відповідно, та послідовності CDR1, CDR2 та CDR3 легкого ланцюга, зазначені в SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37 та SEQ ID NO: 38, відповідно. 2. Антитіло або фрагмент за п. 1, що відрізняється тим, що є специфічним стосовно комбінації протеїнів hCMV UL130 і UL131A та нейтралізує інфікування людським цитомегаловірусом (hCMV) ендотеліальних клітин, ретинальних клітин або дендроподібних клітин. 3. Антитіло або фрагмент за п. 2, що відрізняється тим, що концентрація антитіла, необхідна для 50 % інгібування hCMV, становить 0,3 мкг/мл або менше. 4. Антитіло або фрагмент за п. 2, що відрізняється тим, що концентрація антитіла, необхідна для 50 % інгібування hCMV, становить 0,01 мкг/мл або менше. 5. Антитіло або фрагмент за будь-яким з попередніх пунктів, що відрізняється тим, що епітоп являє собою конформаційний епітоп, утворений двома протеїнами. 6. Антитіло або фрагмент за будь-яким з пп. 1-5, що відрізняється тим, що містить: (а) послідовність варіабельного регіону важкого ланцюга, що має послідовність, визначену в SEQ ID NO: 7, та послідовність варіабельного регіону легкого ланцюга, що має послідовність, визначену в SEQ ID NO: 8; (b) послідовність варіабельного регіону важкого ланцюга, що має послідовність, визначену в SEQ ID NO: 17, та послідовність варіабельного регіону легкого ланцюга, що має послідовність, визначену в SEQ ID NO: 18; або (с) послідовність варіабельного регіону важкого ланцюга, що має послідовність, визначену в SEQ ID NO: 39, та послідовність варіабельного регіону легкого ланцюга, що має послідовність, визначену в SEQ ID NO: 40. 7. Антитіло або фрагмент за будь-яким з попередніх пунктів, що відрізняється тим, що антитіло являє собою людське моноклональне антитіло 1F11. 8. Антитіло або фрагмент за будь-яким з попередніх пунктів, що відрізняється тим, що антитіло являє собою людське антитіло, моноклональне антитіло, людське моноклональне, антитіло, одноланцюгове антитіло, Fab, Fab', F(ab')2, Fv або scFv. 9. Виділене анти-hCMV антитіло або його антигензв'язуючий фрагмент, що зв'язується з епітопом, розпізнаним антитілом за п. 6. 10. Антитіло або фрагмент за будь-яким з пп. 1-9 для лікування hCMV інфекції. 11. Виділена молекула нуклеїнової кислоти, що містить нуклеотидну послідовність, що забезпечує кодування варіабельного регіону важкого або легкого ланцюга антитіла або фрагмента за п. 6, при цьому зазначена нуклеотидна послідовність вибрана з групи, що складається з SEQ ID NO: 9 та SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:19 та SEQ ID NO:20 та SEQ ID NO:41 та SEQ ID NO:42. 12. Виділена клітина, що містить молекулу нуклеїнової кислоти за п. 11. 13. Композиція, яка містить антитіло або фрагмент за будь-яким з пп. 1-9 або нуклеїновую кислоту за п. 11 і фармацевтично прийнятний розріджувач або носій. 14. Композиція за п. 13, яка додатково містить друге антитіло або його антигензв'язуючий фрагмент, що інгібує інфікування hCMV. 15. Композиція за п. 14, яка відрізняється тим, що друге антитіло є специфічним до hCMV протеїну gB. 16. Застосування антитіла або фрагмента за будь-яким з пп. 1-9 для виробництва лікарського засобу для лікування hCMV інфекції. 17 UA 100682 C2 18 UA 100682 C2 19 UA 100682 C2 20 UA 100682 C2 21 UA 100682 C2 22 UA 100682 C2 23 UA 100682 C2 24 UA 100682 C2 25 UA 100682 C2 26 UA 100682 C2 27 UA 100682 C2 28