Антитіло, що нейтралізує людський tgf-b1

1. Антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент, що нейтралізує людський TGF-1 і має Kd, менший за 40 пМ, для людського TGF-1, до складу якого входить a) варіабельна ділянка важкого ланцюга і варіабельна ділянка легкого ланцюга, вибрані з групи, яка включає в себе: і) варіабельну ділянку важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність, представлену Послідовністю №90, і варіабельну ділянку легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність, представлену Послідовністю №43; іі) варіабельну ділянку важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність, представлену Послідовністю №92, і варіабельну ділянку легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність, представлену Послідовністю №42; iii) варіабельну ділянку важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність, представлену Послідовністю №107, і варіабельну ділянку легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність, представлену Послідовністю №57; та iv) варіабельну ділянку важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність, представлену Послідовністю №119, і варіабельну ділянку легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність, представлену Послідовністю №73. 2. Антитіло або його антигензв'язувальний за п. 1, до складу якого входять варіабельна ділянка важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність, представлену Послідовністю №90, і варіабельна ділянка легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність, представлену Послідовністю №43. UA (21) a200711364 (22) 20.04.2006 (24) 25.01.2011 (86) PCT/US2006/014943, 20.04.2006 (31) 60/674,082 (32) 22.04.2005 (33) US (46) 25.01.2011, Бюл.№ 2, 2011 р. (72) ДЕЙВІС ДЖУЛІАН, US, ДІКІНСОН КРЕЙГ ДУЕЙН, US, ХАНГ ЛІХА, US, ДЖОУНЗ БРАЙАН ЕДВАРД, US, МАКВІС ДЕЙВІД МЕТЬЮ, US, РОУЛІНСОН СКОТТ УІЛЬЯМ, US, ТАНЬ ЇНЬ, US, ВАЛЛЬЯНКОРТ ПІТЕР ЕДВАРД, US, УОТКІНС ДЖЕФФРІ ДІН, US (73) ЕЛІ ЛІЛЛІ ЕНД КОМПАНІ, US (56) WO A2 2005010049, 03.02.2005. WO A 0066631, 09.11.2000. "Monoclonal anti-TGF-b1 antibody" R&D SYSTEM ORDERING INFORMATION, no. mab2401, 29 January 2003 (2003-01-29), XP002313281. LUCAS C ET AL: "THE AUTOCRINE PRODUCTION OF TRANSFORMING GROWTH FACTOR-BETA1 DURING LUMPHOCYTE ACTIVATION A STUDY WITH A MONOCLONAL ANTIBODY-BASED ELISA" JOURNAL OF IMMUNOLOGY, THE WILLIAMS AND WILKINS CO. BALTIMORE, US, vol. 145, 1 September 1990 (1990-09-01), pages 1415-1422, XP000917385 ISSN: 0022-1767. SHEHATA MEDHAT ET AL: "TGF-beta1 induces bone marrow reticulin fibrosis in hairy cell leukemia." JOURNAL OF CLINICAL INVESTIGATION, vol. 113, no. 5, March 2004 (2004-03), pages 676-685, XP002406208 ISSN: 0021-9738. FLANDERS K C ET AL: "ANTIBODIES TO PEPTIDE DETERMINANTS IN TRANSFORMING GROWTH FACTOR BETA AND THEIR APPLICATIONS" BIOCHEMISTRY, AMERICAN CHEMICAL SOCIETY. EASTON, PA, US, vol. 27, 1988, pages 739-746, XP002044723 ISSN: 0006-2960. CHENG JINGFEI ET AL: "Transforming growth factor-beta signal transduction and progressive renal disease." EXPERIMENTAL BIOLOGY AND MEDICINE (MAYWOOD), vol. 227, no. 11, December 2 (19) 1 3 93201 4 3. Антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент за п. 1 або за 2, до складу якого додатково входить константна ділянка IgG4, що має амінокислотну послідовність, представлену Послідовністю №40, і константна ділянка каппа-ланцюга, що має амінокислотну послідовність, представлену Послідовністю №41. 4. Антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент за п. 1, що має меншу за 20 % перехресну реактивність з людським TGF-2 та/або TGF-3. 5. Антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент за п. 1, що має Kd для людського TGF-1 у межах від 35 пМ до 0,1 пМ. 6. Антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент за будь-яким із пп. 1-3 для застосування як лікарський засіб. 7. Фармацевтична композиція, яка містить антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент за будь-яким із пп. 1-3 та фармацевтично прийнятний носій. 8. Застосування антитіла або його антигензв'язувального фрагмента за будь-яким із пп. 1-3 для виготовлення лікарського засобу для лікування фіброзного захворювання у людини. 9. Застосування антитіла або його антигензв'язувального фрагмента за будь-яким із пп. 1-3 для виготовлення лікарського засобу для лікування хронічного захворювання нирок у людини. 10. Застосування антитіла або його антигензв'язувального фрагмента за будь-яким із пп. 1-3 для виготовлення лікарського засобу для застосування у комбінованій терапії для лікування фіброзного захворювання у людини, причому згаданий лікарський засіб повинен вводитись у комбінації з інгібітором ацетилхолінестерази. 11. Застосування антитіла або його антигензв'язувального фрагмента за будь-яким із пп. 1-3 для виготовлення лікарського засобу для застосування у комбінованій терапії для лікування хронічного захворювання нирок у людини, причому згаданий лікарський засіб повинен вводитись у комбінації з інгібітором ацетилхолінестерази. Галузь, до якої належить винахід Цей винахід, взагалі, стосується композицій, які мають відношення до білків TGF (трансформуючий фактор росту)-бета 1. Зокрема, цей винахід пропонує очищені зв'язувальні композиції і споріднені з ними реактиви, придатні, наприклад, для діагностування, лікування і запобігання розладам, пов'язаним із проліферацією клітин, автоімунним/запальним розладам, розладам, пов'язаним із порушенням діяльності серцево-судинної системи, та фіброзним розладам, і визначення впливу екзогенних сполук на експресію нуклеїновокислотних і амінокислотних послідовностей таких білків. Передумови створення винаходу Перший член суперродини трансформуючого фактора росту-бета (TGF-бета) секретованих поліпептидних факторів, TGF-бета 1, було відкрито приблизно двадцять років тому. Пізніше згадана родина значно виросла, і зараз включає більше тридцяти членів хребетних і десь біля дванадцяти структурно і функціонально пов'язаних білків безхребетних, таких як черв'яки та мухи (дивись, наприклад, Аттізано (Attisano), Лі-Хефліч (LeeHoeflich), 2001, Gen. Biol. 2, оглядова стаття 30101; Мустакас (Moustakas) та інші, 2001, J. Cell Sci., 114:4359; Врана (Wrana), 2000, Cell, 100:189). Члени родини TGF-бета контролюють багато клітинних функцій, і їхні активність є критичною для регулювання численних процесів розвитку і гомеостазу. Експериментальним шляхом у хребетних, черв'яків і мух виявили існування консервативних шляхів передавання сигналів TGF-бета. Один із членів цієї родини, TGF-бета 1, залучений до різноманітних клітинних процесів, наприклад, до проліферації і диференціації, міграції, диференціації, апоптозу клітин, ембріонального розвитку, утворення позаклітинного матриксу, розвитку кісткової тканини, загоювання ран, гемопоезу, імунних і запальних реакцій (дивись, напри клад, Роберте (Roberts), Спорн (Spom), 1990, Peptide Growth Factors and Their Receptors, стор. 419-472, Springer-Verlag, Heidelberg, Германія; Дж. Массаге (J. Massague), 1998, Annu. Rev. Biochem., 67:753). Окрім того, дані передклінічних і клінічних випробувань вказують на те, що TGF-бета 1 є головним сприяючим фактором відкладання матриксного білка у разі інтерстиціального фіброзу і залучений до започаткування і розвитку цілого ряду пов'язаних із ним фіброзних хворобливих станів, у тому числі фіброзу нирок, який є спільним для усіх форм хронічної хвороби нирок (CDR). Ступінь фіброзу нирок позитивно корелює з розвитком хронічної недостатності нирок (CRF, відомої також як термінальна стадія ниркової недостатності (ESRD)), і може призвести до смерті, хронічного діалізу або трансплантації нирок. TGF-бета пов'язується з CRF складними і різноманітними явищами, які впливають на більшість клітин нирок (Боттінгер (Bottinger), 2002, J. Am. Soc. Nephrol, 13:2600). Наслідком цих явищ, зрештою, є як тубулоінтерстиціальний фіброз, так і гломерулосклероз, які призводять до втрати функції нефронів і, зрештою, хронічної ниркової недостатності. З-посеред трьох ізоформ TGF-бета, TGF-бета 1 видається такою, що домінує у опосередкуванні розвитку хронічної хвороби нирок не лише тому, що є найпоширенішою експресованою ізоформою, але також і тому що, як видається, як TGF-бета 2, так і TGF-бета 3 опосередковують свої ефекти шляхом активації експресії TGF-бета 1 (Ю (Yu), 2003, Kid. Int., 64, 844). Унаслідок цього, для запобігання шкідливого впливу таких розладів як CRD, існує необхідність модулювання експресії TGF-бета 1. Отже, відкриття нових TGF-бета 1зв'язувальних композицій задовольняє потребу у цій галузі, пропонуючи композиції, придатні для 5 діагностування, запобігання та лікування фіброзних розладів, наприклад, хронічної хвороби нирок. Суть винаходу Цей винахід частково базується на відкритті зв'язувальних композицій з поліпшеними властивостями, які специфічно та/або селективно зв'язують зрілий TGF-бета 1 зі зрілим TGF-бета 2 та/або зрілим TGF-бета 3, і які нейтралізують зрілий TGFбета 1. До складу цих зв'язувальних композицій входять а) перша частина, що містить щонайменше одну з наведених нижче послідовностей: GYRX1X2Y [Послідовність № 4]; де: Х2 - W або А; Х2 - F або L; і Х3 - А, Е або Υ; b) GYX1FX2DYNX3X4 [Послідовність № 2]; де: Х1 - Τ або D; Х2 - Τ, Ε або F; Х3 - М, І, L або V; і Х4 - Н, V або А; або с) X1X2YPYDGX3TGX4NX5KX6KS [Послідовність № 3]; де: Х1 - Y, Q або S; Х2 - І або V; Х3 - D або Ε; Φ4 - Y, Τ, Η або L; Х5 - Q, Κ, Ρ або S; і X6 - F або Y; та/або b) друга частина, що містить щонайменше одну з наведених нижче послідовностей: X1QWDX2X3X4PA [Послідовність №7]; де: Х1 - Q або S; Х2 - L, D або Р; Х3 -N або R; і Х4 - Р, F, Υ або R; Х1АХ2Х3Х4VХ5YМН [Послідовність №5]; де: Х1 R, Υ, Ε або Q; Х2 - S або Т; Х3 - S, V або А; Х4 - S або L; Х5 - S, Р, L або Υ; або ATSNX1AX2 [Послідовність №6]; де: Х1 - L, N або Р; і Х2 - S, K, Y, L, М, F, Е, Q, R або Н; до складу згаданої зв'язувальної композиції може також входити а) згадана перша частина, що містить щонайменше дві згадані послідовності; b) згадана перша частина, що містить три згадані послідовності; c) згадана друга частина, що містить щонайменше дві згадані послідовності; d) згадана друга частина, що містить три згадані послідовності; e) згадана перша частина, що містить щонайменше дві згадані послідовності, і згадана друга частина, що містить три згадані послідовності; f) згадана друга частина, що містить щонайменше дві згадані послідовності, і згадана перша частина, що містить три послідовності; або g) згадана перша частина, що містить три згадані послідовності, і згадана друга частина, що містить три згадані послідовності; де місце зв'язування зв'язувальної композиції: є специфічно імунореактивним із поліпептидом людського TGF-бета 1; є специфічно імунореактивним із поліпептидом мишачого TGF-бета 1; його одержують проти очищеного або рекомбінантним шляхом продукованого білка людського TGF-бета 1 або його фрагмента; знаходиться у моноклональному антитілі, Fab, Fv, scFv, F(ab)2 або у варіабельному домені антитіла; має щонайменше одну, дві або три консервативні заміни; або знаходиться у каркасі людського чи гуманізованого антитіла; де зв'язувальна композиція: є молекулою антитіла; є молекулою моноклонального антитіла; є молекулою двочасткового антитіла; є молекулою тричасткового антитіла; є молекулою чотиричасткового антитіла; є молекулою мініантитіла; є моноклональною антисироваткою; є міченою з можливістю виявлення; є ліофілізованою; є стерильною; або входить до складу забуференої композиції; де зв'язувальна композиція є моноклональним антитілом із поліпшеними властивостями. 93201 6 Докладний опис варіантів здійснення, яким віддається перевага І. Загальна частина Слід розуміти, що цей винахід не обмежується конкретними композиціями, методами і способами, опис яких наведено, оскільки такі композиції, методи і способи можуть, звичайно, змінюватись. Слід також розуміти, що вжита у цьому описі термінологія призначена лише для опису конкретних варіантів здійснення і не призначена для обмеження обсягу винаходу, який обмежується лише формулою винаходу, що додається. У значенні, вживаному у цьому описі, у тому числі у формулі винаходу, що додається, однина слів, яка позначається невизначеними та визначеним артиклями "a", "an" та "the", включає, наприклад, їхні відповідники у множині, якщо тільки контекстом чітко не вказується інше. Так, наприклад, посилання на "мікроорганізм" включає, наприклад, один або більше різних мікроорганізмів, посилання на "клітину" включає, наприклад, одну або більше таких клітин, і посилання на "спосіб" включає, наприклад, посилання на еквівалентні стадії або способи, відомі пересічному фахівцю у цій галузі техніки тощо. Якщо не зазначено інше, усі технічні і наукові терміни, що вживаються у цьому описі, мають таке саме значення, яке звичайно розуміється пересічним фахівцем у цій галузі техніки, до якої належить винахід. Нижче наведено опис відповідних способів і матеріалів, хоча у разі практичного втілення або випробування цього винаходу можуть застосовуватись способи і матеріали, подібні або еквівалентні тим способам або матеріалам, опис яких наведено. Усі публікації, заявки на патенти, патенти та інші посилання, які обговорюються у цьому описі, наводяться лише для їх розкриття перед датою подання цієї заявки. Жодна частина цього опису не повинна розглядатись як визнання того, що цей винахід не надає права датувати більш раннім числом будь-яке із цих розкриттів унаслідок їх більш раннього винаходу. Усі публікації, заявки на патенти, патенти та інші посилання, які згадуються у цьому описі, включені у повному обсязі шляхом посилання для розкриття тих положень, для яких вони наводяться (як чітко вказується контекстом), у тому числі усі фігури, креслення, малюнки, графіки, гілерпосилання та інші форми робочої програми браузера. II. Визначення "Зв'язувальна композиція" являє собою молекулярну сутність з вибірковою та/або специфічною зв'язувальною спорідненістю до щонайменше однієї іншої молекулярної сутності або партнера зв'язування. За типовим варіантом зв'язування буде являти собою природну фізіологічно відповідну взаємодію, що буде відбуватись ковалентним або нековалентним шляхом, і може включати членів багатобілкового комплексу, у тому числі, без обмеження, сполуки-носії, партнерів димеризації або полімеризації. Зв'язувальну композицію цілком або частково можна одержати природним шляхом (наприклад, виділити та/або очистити) або продукувати синтетичним шляхом. За типовим варіантом зв'язувальна композиція має щонайменше 7 одну ділянку, наприклад, як необмежувальний приклад, ділянку поверхні, форму (наприклад, порожнину, заглиблення, щілину або виступ), розміщення молекул або просторову конфігурацію, яка специфічно та/або селективно "є сумісною", "зв'язується з" або "є комплементарною з" конкретною просторовою та/або полярною організацією ділянки партнера зв'язування. Так, наприклад, коли зв'язувальна композиція знаходиться у достатній близькості до потенційного партнера зв'язування, зв'язувальна композиція і партнер будуть специфічно та/або селективно взаємозв'язуватись. До необмежувальних прикладів зв'язувальної композиції, що утворює пару з партнером зв'язування, належать: антиген-антитіло і гаптензв'язувальна ділянка. Необмежувальними прикладами зв'язувальних композицій на основі антитіла є: антитіла, двочасткові антитіла, тричасткові антитіла, чотиричасткові антитіла, мініантитіла, Fab-фрагменти (у тому числі, наприклад, димерні або тримерні Fab-фрагменти), Fv-фрагменти, scFv-фрагменти, F(аb)2-фрагменти тощо (необмежувальні приклади зв'язувальних композицій на основі антитіла, що входять до обсягу цього винаходу, дивись, наприклад, Хадсон (Hudson), Cypo (Souriau), 2003, Nature Medicine, 9:129-134). Зв'язувальна композиція на основі моноклональних антитіл є моноклональною у тому значенні, що її одержують із популяції по суті однорідних антитіл (тобто окремі антитіла, що складають популяцію, є по суті ідентичними (наприклад, їх можна одержати з клону клітин одного типу)). Це, однак, не означає їх обмеження конкретним походженням. Таке антитіло можна легко одержати у клітинах, які, зазвичай, антитіл не продукують, наприклад, у клітинах СНО, NSO, COS. На додаток до цього, таке антитіло може продукуватись у клітинах інших типів, зокрема, клітинах ссавців і навіть клітинах рослин, методами генної інженерії, де такі клітини експресуються і складають легкі і важкі ланцюги поліпептидів, що утворюють антитіло. На додаток до цього, такі ланцюги можуть синтезуватись хімічним шляхом, однак, оскільки вони повинні бути специфічними по відношенню до даної антигенної детермінанти, такі ланцюги все ще будуть являти собою "моноклональне" антитіло, у тому значенні, у якому цей термін вживають у описі. Таким чином, у значенні, вживаному у цьому описі, термін "моноклональне антитіло" означає більшою мірою специфічність і чистоту молекул антитіла, аніж простий механізм, що застосовується для продукування таких антитіл. "Місце зв'язування" являє собою специфічну ділянку, зону або конфігурацію молекулярної сутності, яка приймає участь у специфічному та/або вибірковому зв'язуванні з іншою молекулярною сутністю. Необмежувальним прикладом місця зв'язування є послідовність суміжних амінокислот, до складу якої входить гіперваріабельна ділянка (CDR) антитіла. За одним із варіантів здійснення ділянка зв'язування за цим винаходом містить послідовність, що має формулу, представлену у Таблиці 1. За іншим необмежувальним варіантом здійснення місце зв'язування містить комбінацію послідовностей Таблиці 1. Іншим необмежуваль 93201 8 ним прикладом є місце зв'язування, що утворюється об'ємною конфігурацією і просторовою організацією амінокислотних послідовностей, що містять шість CDR петльових фрагментів варіабельних ділянок важких і легких ланцюгів на краю восьмиланцюгової бета-бочкоподібної структури Fab-фрагмента (дивись, наприклад, Чотья (Chothia), Леек (Lesk), 1987, J. Mol. Biol., 196:901917). Розкрита гіперваріабельна ділянка за цим винаходом може включатись до складу каркаса або молекулярної структури як це, наприклад, роблять при пересадженні гіперваріабельних ділянок. За одним із варіантів здійснення структурою для перенесення гіперваріабельної ділянки за цим винаходом буде, як правило, послідовність важкого або легкого ланцюга антитіла або її значна частина, де згадана гіперваріабельна ділянка займає місце, що відповідає гіперваріабельній ділянці природних варіабельних доменів важких і легких ланцюгів антитіл, що кодуються реаранжованими імуноглобуліновими генами. Структури і місцезнаходження варіабельних доменів імуноглобулінів можуть визначатись за допомогою довідника Кебот (Kabat) та інші, 1987, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 4-е видання, US Department of Health and Human Services, який зараз оновлений і доступний на інтернет-сайті (http://immuno.bme.nwu.edu)). Гіперваріабельні ділянки, як правило, відповідають визначенню Кебот (Kabat), але можуть також відповідати визначенням Чотья (Chothia) (J. Mol. Biol., 196:901-917) та/або Маккаллум (MacCallum) (J. Mol. Biol., 262:732-745). Фахівці у цій галузі техніки можуть традиційним шляхом визначити, які залишки містять конкретну гіперваріабельну ділянку, приймаючи до уваги амінокислотну послідовність варіабельної ділянки, до складу якої її включено. На додаток до цього, у разі пересадження CDR, можуть пересаджуватись залишки петлі, визначені Чотья, прилеглі до VH CDR1 за визначенням Кебот. За одним із варіантів здійснення послідовності гіперваріабельної ділянки за цим винаходом можуть вводитись до репертуару варіабельних доменів, яким бракує гіперваріабельних ділянок, за допомогою методів рекомбінантних ДНК. Наприклад, Маркс (Marks) та інші (1992, BioTechnology, 10:779-783) описують способи продукування наборів варіабельних доменів антитіл, у яких консенсусні праймери, спрямовані у бік або прилеглі до 5' кінця варіабельної ділянки, застосовують у поєднанні з консенсусними праймерами до третьої каркасної ділянки людських VH генів для одержання набору варіабельних доменів важкого ланцюга, яким бракує CDR3. Маркс (Marks) та інші додатково описують, яким чином цей набір може бути об'єднаний із CDR3 конкретного антитіла (наприклад, антитіла, опис якого наведено у цьому описі). Застосовуючи аналогічні методики, послідовності CDR3 за цим винаходом можуть переставлятись з наборами VH або VL доменів, яким бракує CDR3, а переставлені повні VH або VL домени об'єднуватись із спорідненим VL або VH доменом з одержанням специфічних членів зв'язувальної композиції за цим винаходом. За альтернативним варіантом послідовності CDR3 9 можуть об'єднуватись з іншими гіперваріабельними ділянками за цим винаходом із застосуванням подібної стратегії. Набір у подальшому може проявлятись у відповідній хазяйській системі, наприклад, системі проявлення у фагах за WO 92/01047, завдяки чому можуть відбиратись відповідні специфічні члени зв'язувальної композиції. Комплекс зв'язувальна композиція:ТGF-бета 1 Словосполучення "комплекс зв'язувальна композиція:ТGF-бета 1", яке вживається у цьому описі, означає комплекс зв'язувальної композиції та білка TGF-бета 1, який одержують шляхом специфічного та/або селективного зв'язування зв'язувальної композиції з білком TGF-бета 1. За варіантом, якому віддається перевага, TGF-бета 1, який згадують у цьому описі, являє собою "зрілий" білок TGF-бета 1 приматів. За варіантом, якому віддається більша перевага, TGF-бета 1, який згадують у цьому описі, являє собою зрілий людський білок TGF-бета 1 (дивись, наприклад, номер депонування NCBI (Національний центр біотехнологічної інформації) Р01137, який описує амінокислотну послідовність людського трансформуючого фактора росту бета 1 (TGF-бета 1) та його зрілої частини). У кожному разі, TGF-бета 1, який згадується у цьому описі, являє собою TGF-бета 1 у його зрілій, біологічно активній формі [(TGF-бета 1 виділяється з клітин у вигляді неактивного "латентного" комплексу, до складу якого входить гомодимер TGF-бета 1 у нековалентному комплексі з двома просегментами, з якими часто зв'язаний один із декількох латентних зв'язувальних білків TGF-бета 1 (дивись, наприклад, Еннес (Annes) та інші, 2003, J. Cell Science, 116:217-224; Міазоно (Miyazono) та інші, 1993, Growth Factors, 8:11-22; Мангер (Munger) та інші, 1997, Kidney Int., 51:1376-1382; Оклу (Oklu), Хескет (Hesketh), 2000, Biochem. J., 352:601-610). Цей латентний комплекс TGF-бета 1 являє собою важливу охорону проти "ненавмисної" активації і може стабілізувати і спрямувати латентний TGF-бета 1 на позаклітинний матрикс, де він зв'язується (Тайпел (Таіраіе) та інші, 1998, Adv. Cancer Res., 75:87-134). Позаклітинний матрикс, таким чином, відіграє роль резервуара, з якого TGF-бета 1 може легко активуватись без необхідності у новому клітинному синтезі. Секреція TGF-бета 1 у вигляді латентного комплексу вимагає існування процесу регульованої активації, який, найімовірніше, опосередковується активностями протеаз, які, за варіантом, якому віддається перевага, розкладають просегменти TGF-бета 1 і, тим самим, вивільнюють високостабільну, зрілу активну димерну форму TGF-бета 1)]. Специфічне зв'язування зв'язувальної композиції означає, що зв'язувальна композиція має місце зв'язування, що розпізнає ділянку TGF-бета 1, як правило, у його нативній активній конформації. Наприклад, антитіла, які були одержані проти TGF-бета 1, і які розпізнають антигенну детермінанту TGF-бета 1, здатні до утворення комплексу зв'язувальної композиції:TGF-бета 1 шляхом специфічного зв'язування. Як правило, утворення комплексу зв'язувальна композиція:білок TGF-бета 1 надає можливість визначення TGF-бета 1 у біологічному зразку, наприклад, суміші з іншими біл 93201 10 ками і біологічними препаратами. Антигенна детермінанта зв'язувальної композиції за цим винаходом може бути визначена за допомогою методів, опис яких наведено у цій заявці або у відповідній галузі техніки (дивись, наприклад, Г. Тріббік (G. Tribbick), 2002, Journal of Immunological Methods, 267:27-35; Вудс (Woods), Хамуро (Hamuro), 2001, Journal of Cellular Biochemistry Supplement, 37:8998) та/або як визначається конкурентним зв'язуванням, як описано у цьому описі. За варіантом, якомувіддається перевага, антигенна детермінанта зв'язувальної композиції за цим винаходом містить амінокислотні залишки YYVGRK Послідовності № 1; за іншим варіантом здійснення антигенна детермінанта зв'язувальної композиції за цим винаходом містить амінокислотні залишки YYVGRK Послідовності № 1 і YSKV Послідовності № 1; за додатковим варіантом здійснення антигенна детермінанта зв'язувальної композиції за цим винаходом містить щонайменше 1 залишок, 2 залишки, 3 залишки, 4 залишки, 5 залишків або 6 залишків (суміжних або несуміжних) з YYVGRK Послідовності №1 та/або щонайменше 1 залишок, 2 залишки, 3 залишки або 4 залишки (суміжні або несуміжні) з YSKV Послідовності № 1 (такий варіант здійснення передбачається для включення будь-якої та усіх їх комбінацій, наприклад, без обмеження: YYVGRK та KV Послідовності № 1; або YVGRK та Υ і KV Послідовності № 1 (усі такі комбінації доступні завдяки застосуванню комп'ютерного алгоритму і добре відомих математичних формул для пермутацій та комбінацій). За ще одним додатковим варіантом здійснення, якому віддається перевага, антигенна детермінанта за цим винаходом визначається функціональним шляхом, наприклад, за здатністю зв'язувальної композиції за цим винаходом до запобігання утворенню подальшого зв'язувального комплексу шляхом конкурування зі зв'язувальними композиціями за той самий антиген, наприклад, TGF-бета 1 (опис такого конкурентного зв'язування наведено у цьому описі). Словосполучення "специфічне зв'язування", яке вживається у цьому описі, означає ситуацію, у якій один член специфічної зв'язувальної пари не буде демонструвати значного зв'язування з іншими молекулами, окрім свого специфічного зв'язувального партнера(-ів). Згадане словосполучення вживається також у тому разі, наприклад, коли антигензв'язувальний домен є специфічним для конкретної антигенної детермінанти, яку несе ряд антигенів. У цьому разі специфічний зв'язувальний член, що несе антигензв'язувальний домен, буде здатним до зв'язування з різними антигенами, які несуть згадану антигенну детермінанту. Отже, зв'язувальна композиція, специфічна по відношенню до зрілого TGF-бета 1, "не буде демонструвати значного зв'язування з іншими молекулами, окрім її специфічного зв'язувального партаера(-ів)", тобто зрілого TGF-бета 1. Словосполучення "специфічно зв'язує" або "специфічно імунореактивна з", по відношенню до зв'язувальної композиції, означає зв'язувальну реакцію, що визначає присутність зв'язувальної композиції у присутності гетерогенної популяції білків та інших біологічних компонентів. Таким чи 11 ном, за визначених умов імуноаналізу, визначена зв'язувальна композиція зв'язує специфічний білок і суттєво не зв'язує інші білки, присутні у зразку. Специфічне зв'язування із зв'язувальною композицією за таких умов може потребувати зв'язувальної композиції, яка вибирається за її специфічністю по відношенню до конкретного білка. Наприклад, зв'язувальну композицію, таку як антитіло, можна одержати проти людської активної димерної форми TGF-бета 1, зрілий мономер амінокислотної послідовності якого представлено Послідовністю № 1, з подальшим вибором для одержання антитіл, специфічно імунореактивних із цим білком TGF-бета 1, а не з іншими білками. Така зв'язувальна композиція могла б диференціювати білки з високим ступенем гомолога з людським білком TGF-бета 1, наприклад, інші ізоформи людського TGF-бета (наприклад, людський TGFбета 2 або людський TGF-бета 3). За варіантом здійснення, якому віддається перевага, специфічність зв'язувальної композиції за цим винаходом до зрілого TGF-бета 1 дорівнює або перевищує у 1,5, 2,0, 2,5, 3,0, 3,5, 4,0, 4,5, 5,0, 5,5, 6,0, 7,0, 7,5, 8,0, 8,5, 9,0, 9,5, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 85, 90, 95, 100, 125, 150, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 4500, 5000, 5500, 6000, 6500, 7000, 7500, 8000, 8500, 9000, 9500 або 10000 разів його специфічність до зрілого TGF-бета 2 та/або зрілого TGF-бета 3. За іншим варіантом здійснення, якому віддається перевага, специфічність композиції за цим винаходом може мати конкретне значення для людського TGF-бета 2 з вищенаведеного переліку і інше значення специфічності для людського TGF-бета 3, наприклад, специфічність по відношенню до зрілого TGF-бета 1, яка дорівнює або перевищує більше ніж у 100 разів її специфічність по відношенню до зрілого TGF-бета 2 і дорівнює або перевищує більше ніж у 900 разів її специфічність по відношенню до зрілого TGF-бета 3. Передбачаються будь-які такі комбінації. Зв'язувальна композиція за цим винаходом за варіантом, якому віддається перевага, нейтралізує TGF-бета 1 і має константу дисоціації (Kd) для TGF-бета 1, за варіантом, якому віддається перевага, меншу ніж приблизно: 100 пМ, 95 пМ, 90 пМ, 85 пМ, 80 пМ, 75 пМ, 70 пМ, 65 пМ, 60 пМ, 55 пМ, 50 пМ, 45 пМ, 40 пМ, 35 пМ, 30 пМ, 25 пМ, 20 пМ, 15 пМ, 14 пМ, 13 пМ, 12 пМ, 11 пМ або 10 пМ; за варіантом, якому віддається більша перевага, меншу ніж приблизно: 10 пМ, 9,9 пМ, 9,8 пМ, 9,7 пМ, 9,6 пМ, 9,5 пМ, 9,4 пМ, 9,3 пМ, 9,2 пМ, 9,1 пМ, 9,0 пМ, 8,9 пМ, 8,8 пМ, 8,7 пМ, 8,6 пМ, 8,5 пМ, 8,4 пМ, 8,3 пМ, 8,2 пМ, 8,1 пМ, 8,0 пМ, 7,9 пМ, 7,8 пМ, 7,7 пМ, 7,6 пМ, 7,5 пМ, 7,4 пМ, 7,3 пМ, 7,2 пМ, 7,1 пМ, 7,0 пМ, 6,9 пМ, 6,8 пМ, 6,7 пМ, 6,6 пМ, 6,5 пМ, 6,4 пМ, 6,3 пМ, 6,2 пМ, 6,1 пМ, 6,0 пМ, 5,9 пМ, 5,8 пМ, 5,7 пМ, 5,6 пМ, 5,5 пМ, 5,4 пМ, 5,3 пМ, 5,2 пМ, 5,1 пМ або 5,0 пМ; за варіантом, якому віддається ще більша перевага, меншу ніж приблизно: 5,0 пМ, 4,9 пМ, 4,8 пМ, 4,7 пМ, 4,6 пМ, 4,5 пМ, 4,4 пМ, 4,3 пМ, 4,2 пМ, 4,1 пМ, 4,0 пМ, 3,9 пМ, 3,8 пМ, 3,7 пМ, 3,6 пМ, 3,5 пМ, 3,4 пМ, 3,3 пМ, 3,2 пМ, 3,1 пМ, 3,0 пМ, 2,9 пМ, 2,8 пМ, 2,7 пМ, 2,6 пМ, 2,5 пМ, 2,4 пМ, 2,3 пМ, 2,2 пМ, 2,1 пМ, 2,0 пМ, 1,9 пМ, 1,8 пМ, 1,7 пМ, 93201 12 1,6 пМ, 1,5 пМ, 1,4 пМ, 1,3 пМ, 1,2 пМ, 1,1 пМ, 1,0 пМ; і за варіантом, якому віддається навіть ще більша перевага, 9,9 пМ, 9,8 пМ, 9,7 пМ, 9,6 пМ, 9,5 пМ, 9,4 пМ, 9,3 пΜ, 9,2 пМ, 9,1 пМ, 9,0 пМ, 8,9 пМ, 8,8 пМ, 8,7 пМ, 8,6 пМ, 8,5 пМ, 8,4 пМ, 8,3 пМ, 8,2 пМ, 8,1 пМ, 8,0 пМ, 7,9 пМ, 7,8 пМ, 7,7 пМ, 7,6 пМ, 7,5 пМ, 7,4 пМ, 7,3 пМ, 7,2 пМ, 7,1 пМ, 7,0 пМ, 6,9 пМ, 6,8 пМ, 6,7 пМ, 6,6 пМ, 6,5 пМ, 6,4 пМ, 6,3 пМ, 6,2 пМ, 6,1 пМ, 6,0 пМ, 5,9 пМ, 5,8 пМ, 5,7 пМ, 5,6 пМ, 5,5 пМ, 5,4 пМ, 5,3 пМ, 5,2 пМ, 5,1 пМ, 5,0 пМ, 5,0 пМ, 4,9 пМ, 4,8 пМ, 4,7 пМ, 4,6 пМ, 4,5 пМ, 4,4 пМ, 4,3 пМ, 4,2 пМ, 4,1 пМ, 4,0 пМ, 3,9 пМ, 3,8 пМ, 3,7 пМ, 3,6 пМ, 3,5 пМ, 3,4 пМ, 3,3 пМ, 3,2 пМ, 3,1 пМ, 3,0 пМ, 2,9 пМ, 2,8 пМ, 2,7 пМ, 2,6 пМ, 2,5 пМ, 2,4 пМ, 2,3 пМ, 2,2 пМ, 2,1 пМ, 2,0 пМ, 1,9 пМ, 1,8 пМ, 1,7 пМ, 1,6 пМ, 1,5 пМ, 1,4 пМ, 1,3 пМ, 1,2 пМ, 1,1 пМ, 1,0 пМ, 0,9 пМ, 0,8 пМ, 0,7 пМ, 0,6 пМ, 0,5 пМ, 0,4 пМ, 0,3 пМ, 0,2 пМ, 0,1 пМ або 0,01 пМ. Константа дисоціації (Kd) зв'язувальної композиції може визначатись за допомогою будь-якого відомого у цій галузі техніки методу, наприклад, за допомогою ВІАСоrе, шляхом адаптування методу Карлссон (Karlsson) та інших, 1991, J. Immunol. Methods, 145, 299-340. Інші описи дивись Джонссон (Johnsson) та інші, 1993, Ann. Biol. Clin., 51:1926; Джонссон (Johnsson) та інші, 1991, Biotechniques, 11:620-627; Джонссон (Johnsson) та інші, 1995, J. Mol. Recognit., 8:125-131; та Джонссон (Johnsson) та інші, 1991, Anal. Biochem., 198:268-277. Термін "kon", що вживається у цьому описі, означає константу асоціації або питому швидкість прямої або комплексотвірної реакції, що визначається у одиницях: М-1с-1. Термін " koff", що вживається у цьому описі, означає константу дисоціації або питому швидкість реакції відокремлення антитіла від комплексу антитіло/антиген, що визначається у одиницях: 1/с. Термін "Kd", що вживається у цьому описі, означає константу дисоціації конкретної взаємодії антитіло-антиген. Її значення вираховують за формулою: koff/kon=Kd. Спорідненість зв'язувальної композиції часто корелює з нижчим значенням koff більше, ніж із вищим значенням kon, однак, не зв'язуючи себе теорією, передбачаються обидва варіанти здійснення з поліпшеними koff та kon. За варіантом здійснення, якому віддається більша перевага, зв'язувальними композиціями за цим винаходом є високоактивні антитіла або їхні фрагменти, які, як правило, демонструють низькі значення koff. За варіантом здійснення, якому віддається ще більша перевага, швидкість kon варіанта здійснення цього винаходу з Fab-фрагментом щонайменше у 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2,0, 2,1, 2,2, 2,3 або 2,4 рази перевищує відповідний показник для порівнянного Fab-фрагмента, наприклад, mAb2471, опис якого наведено у PCT/US2004/018921; US60/485,820. За іншим варіантом здійснення композиція за цим винаходом має швидкість koff, яка щонайменше у 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 125, 130, 150, 195, 200, 225, 250, 260, 270, 280, 290 або 300 разів перевищує порівнянну зв'язувальну композицію (наприклад, таку як Fab або mAb). За варіантом, якому віддається перевага, зв'язувальна композиція на основі антитіла специфіч 13 но та/або селективно зв'язує TGF-бета 1, порівняно з TGF-бета 2 та/або TGF-бета 3; за варіантом, якому віддається більша перевага, зв'язувальна композиція на основі антитіла специфічно та/або селективно зв'язує людський TGF-бета 1, порівняно з людським TGF-бета 2 та/або людським TGFбета 3. За варіантом, якому віддається перевага, таке антитіло має нижчу за приблизно 20% перехресну реактивність із TGF-бета 2 та/або TGF-бета 3 (як визначається відношенням констант дисоціації), за варіантом, якому віддається більша перевага, нижчу за приблизно 15% перехресну реактивність і за варіантом, якому віддається ще більша перевага, нижчу за приблизно 10%, а за варіантом, якому віддається навіть ще більша перевага, нижчу за приблизно 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2% або 1% перехресну реактивність. На додаток до цього, зв'язувальна композиція на основі антитіла за варіантом, якому віддається перевага, розпізнає активну, але не латентну форму TGF-бета 1; за варіантом, якому віддається більша перевага, активну, але не латентну форму людського TGF-бета 1. Нейтралізація Термін "нейтралізувати" або "антагонізувати", по відношенню до зв'язувальної композиції, означає ситуацію, у якій наслідком специфічного та/або селективного зв'язування зв'язувальної композиції з іншою молекулярною сутністю є відміна або пригнічення біологічної ефекторної функції молекулярної сутності, яка була зв'язана зв'язувальною композицією. Щодо TGF-бета 1, термін "нейтралізувати" або "антагонізувати" має відношення до зв'язувальної композиції, наслідком зв'язування або взаємодії якої з TGF-бета 1 є пригнічення біологічної активності, що індукується TGF-бета 1. Пригнічення біологічної активності TGF-бета 1 може оцінюватись шляхом вимірювання одного або декількох in vitro або in vivo індикаторів біологічної активності TGF-бета 1, у тому числі, наприклад, без обмеження, пригнічення зв'язування рецепторів, пригнічення фіброзу, пригнічення хемотаксису або пригнічення трансдукції сигналів у аналізі зв'язування TGF-бета 1 (дивись, наприклад, ЕР 0945464 для необмежувальних прикладів передбачених аналізів нейтралізації). За необмежувальним варіантом здійснення здатність зв'язувальної композиції до нейтралізації або антагонізації активності TGF-бета 1 визначається за допомогою аналізу, як описано у наведеному у цьому описі Прикладі. Нейтралізуюча активність зв'язувальної композиції, наприклад, варіанта здійснення з антитілом, може перевірятись прийнятним у цій галузі техніки методом. За необмежувальним прикладом, перевірку здійснюють шляхом адаптування/модифікування аналізу TGF за Ранделл (Randall) та іншими, (1993) J. Immunol. Methods, 164, 61-67. Цей аналіз базується на здатності TGFбета 1 і TGF-бета 2 до пригнічення індукованої інтерлейкіном-5 (IL-5) проліферації клітинної лінії TF1 еритролейкозу і на здатності до обернення пригнічення TGF-бета за допомогою TGF-бетаспецифічних зв'язувальних композицій. За повідомленням, згаданий аналіз є швидким, відтворюва 93201 14 ним і чутливим до менше ніж 500 фм/мл TGF-бета 1 і 5-10 пг/мл TGF-бета 2. Повідомляють також, що згаданий аналіз є у 100-1000 разів менш чутливим до інших інгібіторних молекул, наприклад, бетаінтерферону, гамма-інтерферону і TNF (фактор некрозу пухлин)-альфа. Повідомляють також, що згаданий аналіз можна зробити специфічним по відношенню до TGF-бета 1 або TGF-бета 2 шляхом включенням специфічних нейтралізуючих антитіл для TGF-бета 1 або TGF-бета 2 і придатним для розпізнавання усіх легкодоступних рекомбінантних молекулярних різновидів цих молекул, а також природних білків, що продукуються з людських і бичачих тромбоцитів, а також для виявлення TGF-бета у зразках сироватки. Передбачаються також інші аналізи, про які повідомляється у цьому описі або відомі у цій галузі техніки. Наприклад, пацюча анти-Thy1.1 модель є добре розробленою моделлю мезангіопроліферативного гломерулонефриту (дивись, наприклад, Моріта (Morita) та інші, 1998, Am. J. Kidney Dis., 31:559-573; Багус (Bagchus) та інші, 1986, Lab. Invest., 55:680-687 і Ямамото (Yamamoto), Уілсон (Wilson), 1987, Kidney Int., 32:514-525), у якій ін'єкція антитіла, спрямованого проти Thy антигену, що знаходиться на поверхні мезангіальних клітин, індукує мезангіоліз із подальшою фазою гіперкомпенсаторної проліферації мезангіальних клітин, наслідком чого є підвищені рівні сечового білка (протеїнурія). Модель антиThy1.1 нефриту за багатьма аспектами нагадує людський нефрит IgA-типу або хворобу ШенлейнаГеноха (О'Донохью (O'Donoghue) та інші, 1991, J. Clin. Invest, 88:1522-1530), і її застосовують для перевірки потенційно терапевтичних варіантів підходу до захворювання нирок шляхом визначення здатності експериментальних композицій до спричинення пов'язаного з дозою зниження інтенсивності симптомів протеїнурії (дивись, наприклад, Бург (Burg) та інші, 1997, Lab. Invest, 76:505-516; Джонсон (Johnson) та інші, 1995, Kidney Int., 47:6269). За варіантом, якому віддається перевага, зв'язувальна композиція за цим винаходом знижує інтенсивність симптомів протеїнурії у такій моделі більше ніж або на 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79% або 80%. Додатково передбачаються варіанти здійснення з діапазоном зниження інтенсивності симптомів протеїнурії (у такій моделі) між будьякими двома вказаними значеннями, де згаданий діапазон може включати або може не включати кожне або обидва кінцеві числові значення (наприклад, діапазон >12% і 42%). На додаток до цього, можна прийняти або аналіз на моделі мшпей-діабетиків за Шарма (Sharma) (дивись, наприклад, 2000, PNAS, 97:8015-8020), який демонструє, що хронічне пригнічення біологічних дій TGF-бета у нирках ефективно запобігає нирковій недостатності, що є нас 15 лідком діабетичного виразкового коліту, або ж можна прийняти модель мишей-діабетиків лінії STZ за Шарма (1996, Diabetes, 45, 522-530) для перевірки здатності зв'язувальної композиції до поліпшення симптомів або запобігання діабетичної нефропатії. На додаток до цього, Юберхем (Ueberham) та інші, 2003, Hepatology, 37(5): 10671078, описує регульовану тетрацикліном систему експресії генів на моделі фіброзу печінки на подвійних трансгенних мишах, де експресія TGFбета 1 регулюється доданням або видаленням доксицикліну гідрохлориду з питної води, що надає можливість довільного включення або відключення експресії TGF-бета 1. Наслідком підвищення експресії TGF-бета 1 у печінці таких тварин є фіброзні хворобливі стани, які обертаються шляхом відключення експресії TGF-бета 1 - навіть після того, як маса печінки зменшилась на 59%. Застосування цієї моделі надає можливість визначення впливу зв'язувальних композицій за цим винаходом на пригнічення біологічних функцій TGF-бета 1 шляхом порівняння зв'язувальної композиції за цим винаходом із впливом відключення експресії TGF-бета 1 за допомогою доксицикліну гідрохлориду. За конкретним варіантом здійснення, застосовуючи аналіз проліферації клітин НТ-2 (як описано у цьому описі), заявники за варіантом, якому віддається перевага, передбачають варіанти здійснення зв'язувальних композицій з поліпшенням ІС50  щонайменше у 50, 60, 70, 80, 90, 100, 105, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425 або 450 разів, порівняно зі значенням ІС50, яке одержали із застосуванням подібної зв'язувальної композиції, наприклад, mAb2471 (опис якої наведено у PCT/US2004/018921; US 60/485,820) за таких самих або подібних умов проведення аналізу. Додатково передбачаються варіанти здійснення, що мають діапазон поліпшення ІС50 (як визначено вище) між двома такими значеннями, де згаданий діапазон може включати або може не включати кожну або обидві кінцеві точки (наприклад, поліпшення ІС50 у діапазоні >80- і 100-разового поліпшення порівняно, наприклад, з mAb2471). Антитіла Зв'язувальні композиції на основі антитіла за цим винаходом включають, наприклад, без обмеження, поліклональні, моноклональні, мультиспецифічні, людські, гуманізовані або химерні антитіла, одноланцюгові антитіла, Fab-фрагменти, F(аb')-фрагменти, фрагменти, продуковані бібліотекою експресованих послідовностей Fab, антиідіотипові (анти-Id) антитіла (у тому числі, наприклад, анти-Id антитіла проти антитіл за цим винаходом) та епітопзв'язувальний фрагмент будь-якого з вищенаведених. Термін "антитіло", що вживається у цьому описі, означає композиції на основі імуноглобулінів та композиції на основі імунологічно активних частин імуноглобулінів, наприклад, молекулу зв'язувальної композиції, що містить місце зв'язування, яке специфічно та/або селективно зв'язує антиген. Композиція на основі імуноглобулінів за цим винаходом може бути будь-якого типу (наприклад, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA та IgY), класу (наприклад, lgG1, 93201 16 IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 та IgA2) або підкласу імуноглобулінової молекули. За варіантом, якому віддається перевага, антитіло являє собою фрагмент людського антигензв'язувального антитіла за цим винаходом, наприклад, без обмеження, Fab, Fab' and F(ab')2, Fc, одноланцюгові Fvs (scFv), одноланцюгові антитіла, дисульфідзв'язані Fvs (sdFv) та фрагменти, що містять VL домен або VH домен. Фрагменти антигензв'язувальних антитіл, у тому числі одноланцюгові антитіла, можуть містити лише варіабельну(-і) ділянку(-и) або варіабельну(-і) ділянку(-и) у комбінації (у повному обсязі або частково) з наведеним нижче: шарнірна ділянка, CH1 домен, СН2 домен або CH3 домен або їх комбінації. Цей винахід також включає, наприклад, без обмеження, антигензв'язувальний фрагмент, який також може містити будь-яку комбінацію варабельної(-их) ділянки(-ок) із шарнірною ділянкою, наприклад, CH1 доменом, СН2 доменом або CH3 доменом або їх комбінаціями. Антитіло за цим винаходом може походити з будь-якого тваринного джерела, у тому числі від птахів і ссавців. За варіантом, якому віддається перевага, антитіла походять від людей, приматів, мишей і пацюків, віслюків, кролів, кіз, морських свинок, верблюдів, коней або курчат. Словосполучення "людські антитіла", що вживається у цьому описі, включає, наприклад, без обмеження, антитіла, що мають амінокислотну послідовність людського імуноглобуліну, у тому числі, наприклад, без обмеження, антитіло, виділене з бібліотеки людських імуноглобулінів (наприклад, бібліотеки людських зародкових ліній), або з тварини, трансгенної за одним або декількома людськими імуноглобулінами, і яка не експресує ендогенних імуноглобулінів, як описано у цьому описі або як розкривається, наприклад, у патенті США № 5,939,598. Зв'язувальна композиція може бути моноспецифічною, біспецифічною, триспецифічною або мати більшу поліспецифічність. Поліспецифічні антитіла можуть бути специфічними по відношенню до різних антигенних детермінант білка-мішені, поліпептиду (або його фрагмента) або можуть бути специфічними по відношенню як до TGF-бета 1, так і до гетерологічної антигенної детермінанти, наприклад, гетерологічної ізоформи TGF-бета або твердого матеріалу основи (дивись, наприклад, WO 2093/17715; WO 92/08802; WO 91/00360; WO 92/05793; Татт (Tutt) та інші, (1991), J. Immunol, 147:60-69; патенти CША № 4,474,893; № 4,714,681; № 4,925,648; № 5,573,920; або № 5,601,819; чи Костельні (Kostelny) та інші, (1992), J. Immunol, 148:1547-1553). Зв'язувальна композиція може описуватись або визначатись із точки зору антигенної(-их) детермінанти (детермінант) або частини (частин) білка TGF-бета 1 (або його фрагмента), які вона розпізнає або селективно та/або специфічно зв'язує. Антигенна(-і) детермінанта (детермінанти) або частина (частини) поліпептиду можуть визначатись як описувалось вище, наприклад, за Nкінцевим або С-кінцевим положеннями, за розміром у суміжних амінокислотних залишках або як представлено у супровідній Таблиці та/або Фігурі 17 чи як описано у цьому описі. На додаток до цього, антитіло, яке конкретно зв'язує антигенну детермінанту, поліпептид, білок або фрагмент поліпептиду або білка, може також конкретно виключатись із цього винаходу. Наприклад, Заявники зберігають за собою право виключати будь-яке антитіло, яке конкретно зв'язує антигенну детермінанту, поліпептид, білок або фрагмент поліпептиду або білка. Відповідним чином, цей винахід може включати перше (або інше) антитіло, яке конкретно зв'язує поліпептид або білок чи їх фрагмент і, у той самий час, виключати друге (або інше) антитіло, яке може також селективно зв'язувати той самий білок або поліпептид чи їхній фрагмент, наприклад, шляхом зв'язування іншої антигенної детермінанти. За варіантом, якому віддається перевага, Заявники виключають зв'язувальну композицію, яка конкретно та/або селективно зв'язує ізоформу TGF-бета 1, порівняно з TGF-бета 2 та/або TGFбета 3, і яка нейтралізує TGF-бета 1, до складу якої входить щонайменше одне місце зв'язування, що містить: щонайменше чотири суміжні амінокислоти з QQWNGNPPA [Послідовність № 126]; щонайменше шість суміжних амінокислот з QQWDSNPPA [Послідовність № 127]; щонайменше п'ять суміжних амінокислот з YIYPYNGDTGYNQKFKS [Послідовність № 128] (де однією із згаданих щонайменше п'яти суміжних амінокислот є D); або щонайменше п'ять суміжних амінокислот з GYTFTDYTMH [Послідовність № 129]. Антитіла за цим винаходом можуть також описуватись або визначатись із точки зору їхньої перехресної реактивності. Включеними є антитіла, які не зв'язують жодного іншого аналога, ортолога, паралога або гомолога білка-мішені, поліпептидумішені (або їхнього фрагмента). Цей винахід додатково включає антитіло, яке селективно зв'язує поліпептид, який кодується полінуклеотидом, що стабільно гібридизується, за суворих умов гібридизації (як описано у цьому описі), з полінуклеотидною послідовністю людського TGF-бета 1. Зв'язувальна композиція може також характеризуватись або визначатись із точки зору її зв'язувальної спорідненості до білка або поліпептиду (їхнього фрагмента) чи антигенної детермінанти. За іншим варіантом здійснення переважна зв'язувальна спорідненість зв'язувальної композиції, наприклад, антитіла або зв'язувального фрагмента антитіла, включає, наприклад, зв'язувальну спорідненість (із застосуванням аналізу, опис якого наведено у цьому описі), яка демонструє константу дисоціації або Kd меншу за (або у діапазоні між двома цифрами, визначеними нижче, де згаданий діапазон може включати або може не включати кожну або обидві кінцеві точки): 510-2 Μ, 10-2 М, 510-3 Μ, 10-3 М, 510-4 М, 10-4 Μ, 510-5 Μ, 10-5 -6 -6 -7 -7 -8 -8 Μ, 510 Μ, 10 Μ, 510 М, 10 М, 510 Μ, 10 -9 -9 -10 -10 -11 М, 510 М, 10 Μ, 510 Μ, 10 Μ, 510 Μ, 10-11 Μ, 510-12 Μ, 4,910-12 Μ, 4,810-12 Μ, 4,71012 Μ, 4,610-12 Μ, 4,510-12Μ, 4,410-12 Μ, 4,310-12 Μ, 4,210-12 Μ, 4,110-12 Μ, 4,010-12 Μ, 3,910-12 Μ, 3,810-12 Μ, 3,710-12 Μ, 3,610-12 Μ, 3,510-12 Μ, 3,410-12 Μ, 3,310-12 Μ, 3,210-12 Μ, 3,110-12 Μ, 93201 18 3,010-12 Μ, 2,910-12 Μ, 2,810-12 Μ, 2,710-12 Μ, 2,610-12 Μ, 2,510-12 Μ, 2,410-12 Μ, 2,310-12 Μ, 2,210-12 Μ, 2,110-12 Μ, 2,010-12 Μ, 1,910-12 Μ, 1,810-12 Μ, 1,710-12 Μ, 1,610-12 Μ, 1,510-12 Μ, 1,410-12 Μ, 1,310-12 Μ, 1,210-12 Μ, 1,110-12 Μ, 1,010-12 Μ, 0,910-12 Μ, 0,810-12 Μ, 0,710-12 Μ, 0,610-12 Μ, 0,510-12 Μ, 0,410-12 Μ, 0,310-12 Μ, 0,210-12 Μ, 0,110-12 Μ, 10-12 Μ, 510-13 Μ, 10-13 Μ, 510-14 Μ, 10-14 Μ, 510-15 Μ або 10-15 Μ. Цей винахід включає також антитіла, які конкурентно пригнічують зв'язування зв'язувальної композиції з антигенною детермінантою TGF-бета 1, як визначається за допомогою будь-якого відомого у цій галузі техніки методу для визначення конкурентного зв'язування, наприклад, імуноаналізу, який описано або на який посилаються у цьому описі. За варіантами здійснення, яким віддається перевага, антитіло конкурентно пригнічує зв'язування з антигенною детермінантою на щонайменше 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92% або 91%, на щонайменше 90%, 89%, 88%, 87%, 86%; на щонайменше 85%, на щонайменше 80%, на щонайменше 75%, на щонайменше 70%, на щонайменше 60% або на щонайменше 50% (або у діапазоні між двома такими значеннями, де згаданий діапазон може включати або може не включати кожну або обидві кінцеві точки). Антитіла за цим винаходом можуть виступати як антагоністи TGF-бета 1 (або його фрагмента). Наприклад, антитіло або зв'язувальна композиція за цим винаходом може руйнувати, наприклад, взаємодію, частково або повністю, TGF-бета 1 зі спорідненим рецептором/лігандом. За варіантом, якому віддається перевага, антитіла за цим винаходом зв'язують антигенну детермінанту TGF-бета 1 або його частини. Подібним чином, цей винахід включає антитіла, що зв'язують ліганд і запобігають його зв'язуванню з рецептором (наприклад, шляхом стеричної перешкоди). Аналогічно передбачаються лігандзв'язувальні антитіла, які пригнічують активацію рецептора без пригнічення зв'язування рецептора. Антитіла за цим винаходом можуть застосовуватись, наприклад, без обмеження, для очищення, виявлення або спрямовування TGF-бета 1 (або його фрагмента) для, наприклад, in vitro та/або in vivo діагностичних та терапевтичних методів. Згадані антитіла, наприклад, можуть застосовуватись у імуноаналізах для якісного та/або кількісного визначення рівнів TGF-бета 1 (або його фрагмента) за цим винаходом у біологічному зразку (дивись, наприклад, Гарлоу (Harlow), Лейн (Lane), Using Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999). Зв'язувальна композиція може застосовуватись самостійно або у комбінації з іншими композиціями. На додаток до цього, зв'язувальна композиція, наприклад, антитіло, може рекомбінантним шляхом приєднуватись до гетерологічного поліпептиду на N- або С-кінці або хімічним шляхом спрягатися (у тому числі шляхом ковалентного або нековалентного спряження) з поліпептидом або іншими композиціями. Наприклад, антитіла за цим винаходом можуть рекомбінантним шляхом приє 19 днуватись або спрягатись з молекулами, які застосовують як мітки у аналізах виявлення та ефекторних молекулах, наприклад, гетерологічних поліпептидах, лікарських засобах, радіонуклідах або токсинах (дивись, наприклад, WO 92/08495; WO 91/14438; WO 89/12624; патент CША № 5,314,995; та ЕР 396,387). Зв'язувальна композиція включає, наприклад, похідні, які модифікуються, наприклад, шляхом ковалентного приєднання молекули будь-якого типу до, наприклад, антитіла таким чином, що ковалентне приєднання не перешкоджає проявленню антитілом анти-ідіотипової реакції. Наприклад, похідне антитіло включає, без обмеження, антитіла, модифіковані, наприклад, шляхом глікозилування, ацетилування, пегілування, фосфоритування, амідування, дериватизації відомими захисними/блокувальними групами, протеолітичного розщеплення, зчеплення з клітинним лігандом або іншим білком тощо. Будь-яка із численних хімічних модифікацій може здійснюватись відомими методами, у тому числі, наприклад, однак без обмеження, специфічним хімічним розщепленням, ацетилуванням, введенням до складу лікарської форми, метаболічним синтезом тунікаміцину тощо. На додаток до цього, похідна може містити одну або декілька некласичних амінокислот. Зв'язувальну композицію можна одержати за допомогою будь-якого відповідного відомого у цій галузі техніки способу. Наприклад, моноклональні антитіла можна одержати за допомогою будь-якого відомого у цій галузі техніки способу. Дивись, наприклад, Гарлоу (Harlow), Лейн (Lane), Using Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999) Гарлоу (Harlow), Лейн (Lane), Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988); Гарлоу (Harlow), Лейн (Lane), Using Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999); Брейтлінг (Breitling), Дюбель (Dtibel), 1999, Recombinant Antibodies (John Wiley & Sons, New York); Г. Золя (Η. Zola), Monoclonal Antibodies (Garland Press); та Джеймс У. Годінг (James W. Goding), Monoclonal Antibodies: Principles and Practice (Academic Press). Термін "моноклональне антитіло", що вживається у цьому описі, не обмежується антитілами, які одержують за допомогою конкретного методу (наприклад, за допомогою гібридомної технології). Способи одержання і перевірки для виявлення специфічних антитіл із застосуванням гібридомної технології є традиційними і відомими у цій галузі техніки. Термін "моноклональне антитіло" означає антитіло, яке одержали з одного клону, у тому числі будь-якого еукаріотного, прокаріотного або фагового клону, а не спосіб, за допомогою якого його одержали. Фрагменти антитіл, що розпізнають специфічні антигенні детермінанти, можна одержати за допомогою відомих способів. Наприклад, Fab- і F(аb')2фрагменти за цим винаходом можна одержати шляхом протеолітичного розщеплення імуноглобулінових молекул із застосуванням таких ферментів, як папаїн (для одержання Fab-фрагментів) або пепсин (для одержання F(аb')2-фрагментів). F(аb')2-фрагменти містять варіабельну ділянку, 93201 20 константну ділянку легкого ланцюга і CH1 домен легкого ланцюга. Наприклад, зв'язувальну композицію можна також одержати за допомогою різних методів проявлення у фагах, відомих у цій галузі техніки, за якими функціональні домени антитіл проявляються на поверхні фагових частинок, які несуть полінуклеотидну послідовність, що їх кодує. За конкретним варіантом здійснення, метод проявлення у фагах застосовують для проявлення антигензв'язувальних доменів, експресованих із набору або комбінаторної бібліотеки гібридних антитіл (наприклад, людських або мишачих). Фаг, що експресує антигензв'язувальний домен, який зв'язує антиген, що становить інтерес, може вибиратись або ідентифікуватись антигеном, наприклад, із застосуванням міченого антигену або антигену, зв'язаного або іммобілізованого на твердій поверхні або гранулі. Після вибору фага, антитілокодувальні ділянки фага виділяють і застосовують для одержання цілих антитіл, у тому числі людських антитіл, або будь-якого іншого необхідного антигензв'язувального фрагмента, і експресують у будь-якому бажаному хазяїні, у тому числі клітинах ссавців, клітинах комах, клітинах рослин, дріжджах і бактеріях, наприклад, як описано у цьому описі або у літературі. Для рекомбінантного продукування Fab, Fab' і F(ab')2 фрагментів можуть також застосовуватись методи, відомі у цій галузі техніки, дивись, наприклад, WO 92/122324; Муліно (Мullinах) та інші, BioTechniques, 1992 12(6):864-869; і Савай (Sawai) та інші, 1995, AJRI, 34:26-34; і Беттер (Better) та інші, 1988, Science, 240:1041-1043. Приклади одержання одноланцюгових Fvs і антитіл включають, наприклад, патенти США № 4,946,778 і № 5,258,498; Хастон (Huston) та інші, 1991, Methods in Enzymology, 203:46-88; Шу (Shu) та інші, 1993, PNAS USA, 90:7995-7999; і Скерра (Skerra) та інші, 1988, Science, 240: 1038-1040. Для деяких варіантів застосування, у тому числі in vivo застосування антитіл на людях та in vitro аналізах із виявлення, перевагу можуть віддавати застосуванню гуманізованих або людських антитіл, які були одержані методами, відомими у цій галузі техніки. Гуманізованими антитілами у цьому описі є зв'язувальні композиції, що зв'язують необхідний антиген, який має одну або декілька гіперваріабельних ділянок (CDR), як описано у цьому описі, введених до складу каркасної ділянки, що з меншою ймовірністю може спричинити шкідливу імунну реакцію у разі in vivo введення до людської хазяйської системи (наприклад, після парентерального введення). Часто, CDR донорні ділянки відповідним чином вводяться до людських каркасних ділянок для поліпшення зв'язування антигену та/або зменшення імуногенності. Придатні каркасні ділянки можна ідентифікувати за допомогою методів, відомих у цій галузі техніки, наприклад, (1) шляхом моделювання взаємодій CDR і каркасних залишків для ідентифікування каркасних залишків, важливих для зв'язування антигену; (2) шляхом порівняння послідовностей для ідентифікування незвичних каркасних залишків у конкретних положеннях (дивись, наприклад, патент CША № 5,585,089, Річмен 21 93201 (Riechmaim) та інші, Nature, 332:323 (1988); або (3) емпіричним шляхом. Гіперваріабельні ділянки (CDR) варіабельного фрагмента важких і легких ланцюгів варіантів здійснення зв'язувальних композицій на основі конкретних моноклональних антитіл за цим винаходом показані нижче у Таблиці 1 (а і b). Гіперваріабельні ділянки позначені за допомогою стандартного однолітерного амінокислотного коду і стандартної номенклатури (тобто зростаючого числового значення гіперваріабельної ділянки, що відповідає зростаючому наближенню до константного домену важкого або легкого ланцюга IgG типової структури; наприклад, VH CDR3 є ближчим до CH1 домену, аніж VH CDR1). Конкретні варіанти гіперваріабельних ділянок представлені характерним для даного роду чином із застосуванням амінокислотних формул для опису роду гіперваріабельних ділянок (знову ж таки, із застосуванням стандартного однолітерного амінокислотного коду із замінними амінокислотними залишками, позначеними літерою "X", і місцезнаходженням залишку у межах конкретної гіперваріабельної ділянки, показаним числовим підрядковим індексом, значення якого зростає з найнижчого (найближчого до аміно-кінця) до найвищого (найближчого до карбоксильного кінця) залишку у гіперваріабельній ділянці (наприклад, X1 у VHCDR2 є найближчим до аміно-кінця залишком CDR, у той час як найближчим до карбоксильного кінця замінним залишком є X6). Використовуючи ці характерні для даного роду формули, пересічний фахівець у цій галузі техніки може визначити усі можливі варіанти здійснення CDR у кожному поз 22 наченому положенні на варіанті здійснення варіабельного домену важких або легких ланцюгів (VL або VH), передбаченому винаходом. Будь-який конкретний варіант можливої амінокислотної послідовності визначається усього лише шляхом утворення всіх можливих замін кожного конкретного залишку X у межах конкретної формули гіперваріабельної ділянки із застосуванням амінокислотного коду. Усі такі варіанти здійснення передбачаються у цій заявці). На додаток до цього, цей винахід рівною мірою включає усі можливі варіанти VL або VH можливих комбінацій CDR (наприклад, використовуючи надану інформацію, можна легко підрахувати, що існує 72 можливі VHCDR1; 384 можливі VHCDR2 та 12 можливих VHCDR3, які здатні утворити у загальній кількості 7238412 можливих VH CDR комбінацій у межах конкретного варіанта варіабельної ділянки важкого ланцюга антитіла зв'язувальної композиції за цим винаходом. У цьому описі також передбачаються усі такі комбінації. Подібні міркування мають відношення до будь-якої VL CDR та до усіх можливих комбінацій, які передбачені для варіабельної ділянки легкого ланцюга VL. Наприклад, існує 192 можливі VLCDR1; 12 можливих VLCDR2 та 48 можливих VLCDR3, які здатні утворити у загальній кількості 1921248 VL CDR комбінацій у межах конкретного варіанта варіабельної ділянки легкого ланцюга антитіла зв'язувальної композиції за цим винаходом). Подібним же чином, передбачаються усі можливі комбінації парування VH та VL у межах конкретного варіанта зв'язувальної композиції. Таблиця 1а Формула CDR важкого ланцюга зв'язувальної композиції CDR1 GYX1FX2DYNX3X4* [Послідовність № 2] Гіперваріабельні ділянки важкого ланцюга CDR2 CDR3 X1X2YPYDGX3TGX4NX5KX6KS** GYRX1X2X3Y*** [Послідовність № 3] [Послідовність №4] *Для VHCDR1: Х1 - T або D; Х2 - Τ, Ε або F; Х3 - М, І, L або V; та Х4 - Н, V або А. **Для VHCDR2: Х1 - Y, Q або S; Х2 - І або V; Х3 - D або Ε; Φ4 - Υ, Τ, Η або L; Х5 - Q, Κ, Ρ або S; та Х6 - F або Υ. ***Для VHCDR3: Х1 - W або A; X2 - F або L; та X3 - A, E або Υ. Таблиця 1b Формула CDR легкого ланцюга зв'язувальної композиції CDR1 X1AX2X3X4VX5YMH* [Послідовність № 5] Гіперваріабельні ділянки легкого ланцюга CDR2 CDR3 ATSNX1AX2** X1QWDX2X3X4PA*** [Послідовність № 6] [Послідовність № 7] *Для VLCDR1: Х1 - R, Υ, Ε або Q; Х2 - S або Т; Х3 - S, V або А; Х4 - S або L; Х5 - S, Р, L або Υ. **Для VLCDR2: Х1 - L, N або Р; та Х2 - S, Κ, Υ, L, М, F, Е, Q, R або Н. ***Для VLCDR3: Х1 - Q або S; Х2 - L, D або Р; Х3 - N або R; та Х4 - Р, F, Υ або R. На додаток до цього, цей винахід включає зв'язувальні композиції на основі антитіл, у яких застосовують передбачені цим винаходом гіпер варіабельні ділянки, які введені (з відповідною орієнтацією) до складу або знаходяться у межах каркасних ділянок людського антитіла і забезпе 23 чують можливість зв'язувальній композиції, яка була одержана, специфічно та/або селективно зв'язувати зрілий TGF-бета 1, порівняно зі зрілим TGF-бета 2 та/або зрілим TGF-бета 3, та нейтралізувати зрілий TGF-бета 1. Для введення до складу або розміщення конкретних гіперваріабельних ділянок у межах відповідних каркасів можуть застосовуватись відомі у цій галузі техніки методи. Варіабельні домени, що застосовуються за цим винаходом, можуть бути одержані з будь-якої зародкової лінії або реаранжованого людського варіабельного домену, або це може бути синтетичний варіабельний домен, який базується на консенсусних послідовностях відомих людських варіабельних доменів. До числа каркасів варіабельних доменів, яким віддається перевага, належать ті, які мають незначний вплив на біологічні властивості варіанта зв'язувальної композиції на основі анти-TGF-бета 1 антитіла - тобто здатність специфічно та/або селективно зв'язувати та нейтралізувати зрілий TGF-бета 1, порівняно зі зрілим TGF-бета 2 та/або TGF-бета 3. Більшу перевагу віддають каркасам, які, на додаток до цього, не викликають значних імуногенних реакцій у разі введення людині (наприклад, парентеральним шляхом). Каркасними послідовностями, яким віддається перевага, можуть бути послідовності природних людських антитіл або консенсусні послідовності декількох людських антитіл. Необмежувальні приклади каркасних послідовностей варіабельної ділянки важкого ланцюга варіантів антитіл за цим винаходом включають VH сегмент DP-5 (Томлінсон (Tomlinson) та інші, 1992, J. Mol. Biol., 227:776-798) та J-сегмент JH4, JH1 або JH5 (Равеч (Ravetch) та інші, 1981, Cell, 27:583-591). Vk-сегмент L1 (Кокс (Сох) та інші, 1994, Eur. J. Immunol, 24:827-836) та J-сегмент Jk4 (Хайетер (Hieter) та інші, 1982, J. Biol. Chem., 10:1516-1522) є необмежувальним прикладом каркасних послідовностей варіабельної ділянки легкого ланцюга. За варіантом здійснення, якому віддається перевага, HCVR FR1 каркас містить QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKAS [Послідовність № 8]; HCVR FR2 каркас містить WVRQAPGQGLEWMG [Послідовність № 9]; HCVR FR3 каркас містить RVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCAR [Послідовність № 10]; і HCVR FR4 каркас містить WGQGTLVTVSS [Послідовність № 11]. За іншим варіантом здійснення, якому віддається перевага, LCVR FR1 каркас містить DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC [Послідовність № 12]; LCVR FR2 каркас містить послідовність, вибрану з-посеред [Послідовності № 13-36], LCVR FR3 каркас містить GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC [Послідовність № 37]; і LCVR FR4 каркас містить FGQGTKLEIK [Послідовність № 38]. За варіантом здійснення, якому віддається більша перевага, такі каркасні ділянки можуть містити зміни, делеції, додання, заміни або будь-які їхні комбінації. Більш того, перевага також віддається каркасам, у яких 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 або 10 амінокислот замінені, видалені або додані у будь-якій комбінації. 93201 24 За одним із варіантів здійснення, константна ділянка важкого ланцюга для застосування при введенні гіперваріабельних ділянок зв'язувальної композиції на основі антитіла за цим винаходом, якій віддається перевага, включає, наприклад, константну ділянку IgG. За варіантом, якому віддається більша перевага, константною ділянкою IgG є константна ділянка lgG1 або константна ділянка IgG4, як показано нижче: lgG1 [Послідовність № 39]: STKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFP EPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVV TWSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDK THTCPPCPAPELLGGPSWLFPPKPKDTLMISRTPEV TCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPRE EQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKAL PAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVS LTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLD SDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALH NHYTQKSLSLSPG; або IgG4 [Послідовність № 40]: ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYF PEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSW TVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGP PCPPCPAPEFLGGPSWLFPPKPKDTLMISRTPEVT CVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREE QFNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLP SSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSL TCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDS DGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHN HYTQKSLSLSLG Послідовністю константної ділянки легкого ланцюга за цим винаходом, якій віддається перевага, є константна ділянка каппа-ланцюга, показана нижче: RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFY PREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYS LSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFN RGEC [Послідовність № 41] За іншим варіантом здійснення, якому віддається перевага, зв'язувальна композиція містить константну ділянку важкого ланцюга lgG1 або константну ділянку важкого ланцюга IgG4 і константну ділянку легкого ланцюга типу каппа. Застосовуючи інформацію, яка надається цим описом, пересічний фахівець може одержати варіант mAb за цим винаходом, такий, наприклад, як № 46P-L1-6, який буде мати легкий ланцюг, що містить: DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCEASSSVSYMH WYQQKPGKAPKPLIYATSNLASGVPSRFSGSGSGT DFTLTISSLQPEDFATYYCQQWDLNPPAFGQGTKL EIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYP REAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSL SSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFN RGEC [Послідовність № 130], де: LCVR FR1 каркас=DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC; VL CDR1=EASSSVSYMH формули X1AX2X3X4VX5YMH, де X1 - R, Υ, Ε або Q; Х2 - S або Τ; Х3 - S, V або А; Х4 - S або L; і Х5 - S, Р, L або Y; LCVR FR2 каркас=WYQQKPGKAPKPLIY; VL CDR2=ATSNLAS формули ATSNX1AX2, де Φ1 - L, N або Р; і Х2 - S, Κ, Υ, L, M, F, Ε, Q, R або Н; 25 LCVR FR3 каркас=GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC; VL CDR3=QQWDLNPPA формули X1QWDX2X3X4PA, де X1 - Q або S; X2 - L, D або Ρ; X3 - N або R; і Х4 - Ρ, F, Υ або R; LCVR FR4 каркас=FGQGTKLEIK; та константна ділянка легкого ланцюга = RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPRE AKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSS TLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRG EС; і важкий ланцюг, що містить: QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDY NMHWVRQAPGQGLEWMGYIYPYDGDTGYNQKFK SRVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARGY RWFAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRST SESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTF PAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKP SNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFP PKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYV DGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWL NGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYT LPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNG QPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEG NVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLG [Послідовність № 131], де: HCVR FR1 каркас=QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKAS; VH CDR1=GYTFTDYNMH формули GYX1EX2DYNX3X4; X1 - Τ або D; X2 - Τ, Ε або F; Х3 Μ, І, L або V; і Х4 - Η, V або А; HCVR FR2 каркас=WVRQAPGQGLEWMG; VH CDR2=YIYPYDGDTGYNQKFKS формули X1X2YPYDGX3TGX4NX5KX6KS; Х1 - Υ, Q або S; X2 І або V; X3 - D або Е; X4 - Υ, Τ, Η або L; X5 - Q, Κ, Ρ або S; і Х6 - F або Υ; HCVR FR3 каркас=RVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCAR; VH CDR3=GYRWFAY формули GYRX1X2X3Y; де X1 - W або А; Х2 - F або L; і X3 - A, E або Υ; HCVR FR4 каркас=WGQGTLVTVSS; і константна ділянка важкого ланцюга = ASTKGPSVFPIAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEP VTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTV PSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPC PPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCV WDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQF NSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSS IEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTC LVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDG SFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYT QKSLSLSLG. Полінуклеотиди, які кодують антитіла Цей винахід додатково включає нуклеїновокислотні молекули, що містять полінуклеотидні послідовності, які кодують зв'язувальну композицію (або її фрагмент) або поліпептидну послідовність за цим винаходом. Можна одержати полінуклеотиди і визначити нуклеотидну послідовність полінуклеотидів за допомогою будь-якого відомого у цій галузі техніки методу, наприклад, якщо відома поліпептидна послідовність (наприклад, антитіла або його фрагмента), полінуклеотид, який кодує поліпептид, можна визначити просто шляхом застосування виродження генетичного коду у будь 93201 26 якому комп'ютерному алгоритмі, і одержана інформація щодо послідовності може застосовуватись для складання, наприклад, хімічно синтезованих олігонуклеотидів (наприклад, як описано у Кутмейєр (Kutmeier) та інші, (1994) BioTechniques, 17:242), що, у скороченому описі, залучає синтезування олігонуклеотидів, що перекриваються, які містять частини послідовності, яка кодує поліпептидну послідовність, ренатурацію та літування цих олігонуклеотидів із подальшим ампліфікуванням лігованих олігонуклеотидів за допомогою полімеразної ланцюгової реакції. За альтернативним варіантом полінуклеотид, який кодує поліпептидну послідовність за цим винаходом, можна одержати з нуклеїнової кислоти будь-якого відповідного джерела. Якщо клон, який містить нуклеїновокислотну молекулу, що кодує конкретне антитіло, недоступний, але, разом із цим, послідовність молекули антитіла відома, у такому разі нуклеїнова кислота, яка кодує імуноглобулін, може бути синтезована хімічним шляхом або її можна одержати з відповідного джерела. Згаданим джерелом, наприклад, може бути бібліотека кДНК антитіл або бібліотека кДНК, які одержали з полі А+РНК, виділеної з будь-якої тканини або клітини, що експресує антитіло, яке становить інтерес, наприклад, із гібридомних клітин, які були вибрані для експресії антитіла за цим винаходом, шляхом ПЛР ампліфікації із застосуванням синтетичних праймерів, які можуть гібридизуватись із 3' та 5' кінцями полінуклеотидної послідовності, яка становить інтерес, або шляхом клонування із застосуванням олігонуклеотидного зонда, специфічного для конкретної послідовності гена, для ідентифікування, наприклад, клону кДНК із бібліотеки кДНК, який кодує антитіло, можна одержати нуклеїновокислотну молекулу для згаданого антитіла. Ампліфіковані нуклеїнові кислоти можуть клонуватись у клонувальних векторах, здатних до реплікації, за допомогою будь-якого відомого у цій галузі техніки методу. Після визначення нуклеотиду і відповідної амінокислотної послідовності антитіла, маніпуляції з нуклеотидною послідовністю антитіла можуть здійснюватись за допомогою будь-якого відомого у цій галузі техніки методу, наприклад, методу рекомбінантних ДНК, сайтспрямованого мутагенезу, ПЛР тощо для одержання антитіл, що мають іншу амінокислотну послідовність, для здійснення амінокислотних замін, делецій та/або інсерцій (дивись, наприклад, Сембрук (Sambrook) та інші і Осбел (Ausubel) та інші, редактори, сучасне видання, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Нью-Йорк). За конкретним варіантом здійснення амінокислотна послідовність варіабельних доменів важких та/або легких ланцюгів може перевірятись для ідентифікування послідовностей гіперваріабельних ділянок (CDR) відомими методами, наприклад, шляхом порівняння відомих амінокислотних послідовностей інших варіабельних ділянок важких і легких ланцюгів для визначення ділянок гіперваріабельності. За допомогою традиційних методів рекомбінантних ДНК, одна або декілька гіперваріабельних ділянок, опис яких наведено, можуть вставлятись до відповідних каркасних ділянок, 27 наприклад, до людських каркасних ділянок, для зменшення імуногенності. Каркасні ділянки можуть бути природними або консенсусними каркасними ділянками (або як розкривається у цьому описі) і, за варіантом, якому віддається перевага, є людськими каркасними ділянками (перелік людських каркасних ділянок дивись, наприклад, Чотья (Chothia) та інші, 1998, J. Mol. Biol., 278: 457-479). Взагалі, для ідентифікування залишків у межах людських каркасів, які, ймовірно, впливають на цілісність антигензв'язувального центра антитіла і, унаслідок цього, на зв'язування антигену, як донорні, так і вибрані людські акцепторні послідовності можуть впорядковано розміщатись для порівняння з декількома матрицями послідовностей, які були одержані з наборів антитіл. Ідентифікують "інваріантні залишки" (Кебот (Kabat) та інші, 1991) та "ключові залишки" (Чотья (Chothia) та інші, 1989), і канонічну приналежність зв'язувальних петель донорних антитіл L1-L3, Н1 та Н2, відповідно, визначають шляхом перевірки згаданої послідовності проти матриць послідовностей (Мартін (Martin), Торнтон (Thornton), 1996, Mol. Biol, 263:800-815 на http://www.bioinf.org.uk/). На додаток до цього, залишки на ділянці контакту VH/VL (Чотья (Chothia) та інші, 1985) та структурно консервативні залишки на корових сайтах (Чотья (Chothia) та інші, 1998) порівнюють із відповідними донорними та акцепторними залишками. Несуміщені донорні та акцепторні каркасні залишки на цих сайтах аналізують, виходячи з інформації для інших антитіл відомої структури з Банку даних білків (Берман (Berman) та інші, 2000, Nucl. Acids Res., 28(1):235-242). Вибір людських каркасів для застосування у ролі матриць для гуманізації чужорідних V-ділянок може визначити подальші рішення щодо того, які залишки гуманізувати. Варіантами є вибір гомологічних матриць з антитіл з відомою кристалічною структурою із зародкової лінії, незародкової лінії або консенсусних послідовностей, які були одержані з доступних баз даних (огляд дивись Рутледж (Routledge) та інші (Рутледж (Routledge) та інші, 1993, у Protein Engineering of Antibody Molecules for Prophylactic and Therapeutic Applications in Man (редактор Кларк Μ. (Clark Μ.)) стор. 14-44, Academic Titles, Nottingham, Великобританія та Б. Ло (В. Lo), 2004 Antibody Ensineerins: Methods and Protocols, Humana Press)). Інша стратегія гуманізації антитіл полягає у виборі найближчої людської послідовності зародкових ліній (Томлінсон (Tomlinson) та інші, 1992) як каркаса для введення донорних гіперваріабельних ділянок. Цей варіант підходу із застосуванням зародкових ліній базується на такому самому логічному обгрунтуванні, що і стратегія найкращої відповідності, однак у базах даних відшукуються лише послідовності зародкових ліній (дивись, наприклад, V BASE, яка являє собою вичерпний каталог усіх послідовностей варіабельних ділянок зародкових ліній людини, який складається більше ніж із тисячі опублікованих послідовностей, у тому числі послідовностей сучасних бібліотек данних Genbank та EMBL. База даних V BASE розроблялась впродовж декількох років у Дослідному центрі білкової інженерії (MRC Center for Protein 93201 28 Engineering, Кембридж, Великобританія) як продовження роботи із секвенування та картування генів людських антитіл і як зручний для користувача інструмент для їх аналізу). Метод каркаса зародкових ліній є дуже корисним, оскільки людська послідовність зародкових ліній не представляє соматичних гіпермутацій, які є потенційно імуногенними. Гіперваріабельні ділянки можуть також пересаджуватись або вводитись до складу людських каркасів за допомогою стратегії консенсусних людських зародкових ліній, за якою одна з людських підгруп застосовується як каркас (дивись, наприклад, Преста (Presta) та інші, 1993, J. Immunol, 151:2623-2632; Куто (Couto) та інші, 1994, Hybridoma, 13:215-219; Куто (Couto) та інші, 1995, Cancer Res. (Suppl.), 55, 5973s-5977s; Вертер (Werther) та інші, 1996, J. Immunol, 157:4986-4995; О'Коннор (O'Connor) та інші, 1998, Protein Engng., 11:321-328). За варіантом, якому віддається перевага, полінуклеотид, який одержали шляхом комбінування каркасних ділянок і гіперваріабельних ділянок, кодує антитіло (або його фрагмент), який специфічно та/або селективно зв'язує TGF-бета 1 (або його антигенну детермінанту). За варіантом, якому віддається перевага, як обговорюється у цьому описі, для поліпшення зв'язування антитіла з його антигеном у межах каркасних ділянок може здійснюватись одна або декілька амінокислотних замін. На додаток до цього, такі методи можуть застосовуватись для здійснення амінокислотних замін або делецій одного або декількох залишків цистеїну варіабельних ділянок, що приймають участь у створенні внутрішньоланцюгового дисульфідного зв'язку, для одержання молекул антитіл, яким бракує одного або декількох внутрішньоланцюгових дисульфідних зв'язків. Винаходом передбачаються інші зміни полінуклеотиду, які знаходяться у межах можливостей пересічного фахівця, наприклад, молекулярного біолога. За альтернативним варіантом методи можуть адаптуватись для продукування одноланцюгових антитіл (дивись, наприклад, патент CША № 4,946,778; Bird (Бєрд), Science, 242:423-442 (1988); Хастон (Huston) та інші, PNAS, 85:5879-5883 (1988); та Уорд (Ward) та інші, Nature, 334:544-554 (1989)). Одноланцюгові антитіла одержують шляхом зв'язування фрагментів Fv-ділянки важких і легких ланцюгів за допомогою амінокислотного містка, наслідком чого є одержання одноланцюгового поліпептиду. Можуть також застосовуватись методи складання функціональних Fv-фрагментів у Е. coli (Скерра (Skerra) та інші, (1988), Science, 242: 1038-1041). Поліпептидні фрагменти Цей винахід включає також фрагменти зв'язувальної композиції. Словосполучення "поліпептидний фрагмент або сегмент" означає амінокислотну послідовність, що є частиною послідовності, опис якої наведено, або частиною поліпептидної послідовності. Білкові та/або поліпептидні фрагменти чи сегменти можуть бути "вільними" або вони можуть становити частину більшого поліпептиду або білка, фрагмент або сегмент якого утво 29 рює частину або ділянку, наприклад, одну суцільну ділянку, яка входить до складу гібридного білка. За варіантом, якому віддається перевага, поліпептидний сегмент у довжину може складатись щонайменше з приблизно: 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 110, 120, 130, 140 або 150 суміжних амінокислот. У цьому контексті "приблизно" включає, наприклад, конкретно вказані діапазони або значення, наведені у цьому описі, і ним також передбачаються значення, які відрізняються від зазначених значень декількома амінокислотними залишками (наприклад, плюс або мінус 5, плюс або мінус 4, плюс або мінус 3, плюс або мінус 2 або плюс або мінус 1 амінокислотний залишок) на будь-якому або обох кінцях фрагмента. Полінуклеотиди, що кодують такий поліпептидний фрагмент, також передбачаються цим винаходом. Більш того, цей винахід включає білки або поліпептиди, що містять деяку кількість згаданих амінокислотних сегментів або фрагментів, наприклад, сегментів певної довжини, що не перекриваються. За типовим варіантом деяка кількість означає щонайменше два, як правило, щонайменше три, і за варіантом, якому віддається перевага, щонайменше чотири, п'ять, шість, сім, вісім, дев'ять або більше. Незважаючи на те, що надається мінімальна довжина сегмента, для будь-якої конкретної кількості сегментів передбачається також максимальна довжина різних розмірів, наприклад, кількість із трьох сегментів in toto буде представляти один сегмент довжиною 7 суміжних амінокислот і два додаткові сегменти, що не перекриваються, довжина кожного з яких буде дорівнювати 12. Перевага віддається також поліпептидним фрагментам або сегментам (та їхнім відповідним полінуклеотидним фрагментам), що характеризують структурні або функціональні домени, наприклад, фрагментам або їх комбінаціям, які містять, наприклад, гілерваріабельні ділянки (CDR, наприклад, VL або VH: CDR1, CDR2 або CDR3), варіабельні ділянки (наприклад, важкого або легкого ланцюгів, VL або VH), каркасні ділянки (FH1, 2, 3 або 4), D- або J-сегменти, константні ділянки (наприклад, CL, СН1, СН2 або СН3), шарнірні ділянки, ділянки зв'язування рецептора Fc-гамма, альфаспіраль, ділянки, що утворюють альфа-спіраль, бета-складку і ділянки утворення бета-складки, оборот і ділянки утворення обороту, спіраль і ділянки утворення спіралі, гідрофільні ділянки, гідрофобні ділянки, альфа-амфіпатичні ділянки, бетаамфіпатичні ділянки, гнучкі ділянки, петльові ділянки, ділянки шпильок, бета-альфа-бета мотиви, спіральні вузли, альфа/бета бочкоподібні фрагменти, зворотні і прямі бета-бочкоподібні фрагменти, мотиви за типом "рулет з джемом", трансмембранні домени, ділянки утворення поверхні, ділянки зв'язування субстрату, трансмембранні ділянки, лінкери, імуногенні ділянки, антигенні детермінанти і ділянки з високим антигенним індексом. Більш того, передбачаються також полінуклеотиди, що кодують ці ділянки. 93201 30 Іншими поліпептидними сегментами, яким віддається перевага, є біологічно активні фрагменти. Біологічно активними фрагментами є фрагменти, що демонструють активність, подібну, але не обов'язково ідентичну, до активності поліпептиду (або його фрагмента) зв'язувальної композиції, наприклад, Fab, Fv, scFv або F(ab)2. Полінуклеотиди, що кодують ці поліпептидні фрагменти, також передбачаються цим винаходом. За варіантом, якому віддається перевага, полінуклеотидні фрагменти кодують поліпептид, який демонструє функціональну активність. Словосполучення "функціональна активність" означає поліпептидний сегмент, який може здійснювати одну або декілька відомих функціональних активностей. До числа таких функціональних активностей належить, наприклад, без обмеження, біологічна активність, антигенність [здатність до зв'язування (або конкурування з поліпептидом за зв'язування) із зв'язувальною композицією на основі антитіла з поліпептидом за цим винаходом], імуногенність (здатність до утворення антитіла, яке зв'язується з поліпептидом за цим винаходом), здатність до утворення мультимерів із поліпептидом за цим винаходом і здатність до зв'язування з рецептором або лігандом поліпептиду, опис якого наведено. Функціональна активність поліпептиду (у тому числі його фрагментів, варіантів, похідних і аналогів) може аналізуватись різними методами. Наприклад, у разі аналізу здатності поліпептиду за цим винаходом до зв'язування або конкурування з непроцесованим поліпептидом за цим винаходом за зв'язування з антитілом, можуть застосовуватись різні імуноаналізи, відомі у цій галузі техніки, у тому числі, наприклад, без обмеження, конкурентні і неконкурентні аналітичні системи із застосуванням таких методів, як радіоімунологічні аналізи, ELISA (твердофазний імуноферментний аналіз), імунологічні сендвіч-аналізи, імунорадіометричні аналізи, реакції преципітації у гелі, реакції імунодифузії, in situ імуноаналізи (із застосуванням, наприклад, колоїдного золота, як мітки та ферментативних або радіоізотопних міток), вестерн-блотинги, реакції преципітації, реакції аглютинації (наприклад, реакції аглютинації у гелі, реакції гемаглютинації, реакції зв'язування комплементу, імунофлуоресцентні аналізи, реакції на білок А та методи імуноелектрофорезу тощо). За іншим варіантом здійснення зв'язування антитіла відбувається шляхом виявлення мітки на першому антитілі. За іншим варіантом здійснення перше антитіло виявляють шляхом виявлення зв'язування другого антитіла або реагента з першим антитілом. За додатковим варіантом здійснення друге антитіло є міченим. У цій галузі техніки відомо багато способш виявлення зв'язування у разі імуноаналізу, які входять до обсягу цього винаходу. За іншим варіантом здійснення, коли ідентифікується ліганд або оцінюється здатність поліпептидного фрагмента, варіанта або похідної за цим винаходом до полімеризації, зв'язування може визначатись, наприклад, засобами відновної та невідновної гель-хроматографії, білок-специфічної афінної хроматографії та афінного блотингу (ди 31 вись, взагалі, Фізіцкі (Phizicky) та інші, (1995), Microbial. Rev., 59:94-123). За іншим варіантом здійснення фізіологічна кореляція зв'язування поліпептиду із субстратами (трансдукція сигналів) може аналізуватись за допомогою традиційних методів. На додаток до цього, аналізи, опис яких наведено (дивись, наприклад, розділ "Приклади" цього опису) або відомі у цій галузі техніки, можуть звичайним чином застосовуватись для визначення здатності зв'язувальної композиції (її фрагментів, варіантів, похідних та аналогів) до модулювання відповідної біологічної активності (in vitro або in vivo) TGF-бета 1. Способи одержання антитіл Зв'язувальну композицію на основі антитіл можна одержати за допомогою будь-якого відомого у цій галузі техніки методу, зокрема, шляхом хімічного синтезу або, за варіантом, якому віддається перевага, методами рекомбінантної експресії. Рекомбінантна експресія зв'язувальної композиції або її фрагмента, похідної чи аналога (наприклад, важкого або легкого ланцюга антитіла за цим винаходом чи одноланцюгового антитіла за цим винаходом) потребує конструювання експресійного вектора, який містить полінуклеотидну послідовність, що кодує антитіло. Після одержання полінуклеотидної послідовності, що кодує молекулу антитіла або важкий чи легкий ланцюг антитіла або його частину (яка за варіантом, якому віддається перевага, містить варіабельний домен важкого або легкого ланцюга) за цим винаходом, вектор для продукування молекули антитіла можна одержати за допомогою відомих методів рекомбінантних ДНК. Для конструювання експресійних векторів, що містять кодувальні послідовності зв'язувальної композиції та відповідні контрольні транскрипційні та трансляційні сигнали, можуть застосовуватись методи, відомі у цій галузі техніки. До числа цих методів належать, наприклад, без обмеження, in vitro методи рекомбінантних ДНК, методи синтезу та in vivo методи генетичної рекомбінації. Цей винахід, таким чином, включає вектори, здатні до реплікації, які містять нуклеотидну послідовність, що кодує антитіло за цим винаходом (або його фрагмент), його важкий або легкий ланцюг чи варіабельний домен важкого або легкого ланцюга чи гіперваріабельну ділянку, функціонально зв'язану з промотором. Такі вектори можуть включати, наприклад, нуклеотидну послідовність, що кодує константну ділянку молекули антитіла (дивись, наприклад, WO 86/05807; WO 89/01036; або патент США № 5,122,464)), і варіабельний домен антитіла може клонуватись у такому векторі для експресії повного важкого або легкого ланцюга чи будь-якої його частини. Взагалі, експресійний вектор переносять до клітини-хазяїна традиційними методами, і трансфіковані клітини у подальшому культивують для продукування антитіла або його частини. Таким чином, цей винахід також включає, наприклад, клітини-хазяї, що містять полінуклеотид, який кодує антитіло за цим винаходом або його важкий чи легкий ланцюг або одноланцюгове антитіло за цим 93201 32 винаходом, функціонально зв'язане з гетерологічним промотором. За варіантами, яким віддається перевага, для експресії дволанцюгових антитіл вектори, що кодують як важкий, так і легкий ланцюги, можуть коекспресуватись у клітині-хазяїні для експресії повної імуноглобулінової молекули, як докладно описано у цій заявці або відомо у цій галузі техніки. Для експресії молекул антитіла за цим винаходом можуть застосовуватись різноманітні системи хазяїн-експресійний вектор. Такі системи хазяїна-експресійного вектора являють собою носії, за допомогою яких може продукуватись і у подальшому очищатись будь-яка кодувальна послідовність, що становить інтерес. Однак, у разі трансформації або трансфекції відповідною нуклеотидною кодувальною послідовністю, клітинихазяї з системою експресії можуть також являти собою молекулу антитіла за цим винаходом in situ. Такі клітини включають, наприклад, без обмеження, мікроорганізми, наприклад, бактерії (наприклад, Е. coli, В. subtilis), трансформовані експресійними векторами на основі рекомбінантної ДНК бактеріофага, ДНК плазміди або ДНК косміди, що містять кодувальні послідовності антитіла; дріжджі (наприклад, Saccharomyces, Pichia), трансформовані експресійними векторами на основі рекомбінантної ДНК дріжджів, що містять кодувальні послідовності антитіла; системи клітин комах, інфіковані експресійними векторами на основі рекомбінантного вірусного геному (наприклад, бакуловірусу), що містять кодувальні послідовності антитіла; системи рослинних клітин, інфіковані експресійними векторами на основі рекомбінантного вірусного геному (наприклад, вірусу мозаїки цвітної капусти, CaMV; вірусу мозаїчної хвороби тютюну, TMV) або трансформовані експресійними векторами на основі рекомбінантної плазмідної ДНК (наприклад, Ті-плазміди), що містять кодувальні послідовності антитіла; або системи клітин ссавців (наприклад, клітини COS, СНО, ВНK, 293, 3Т3), що містять рекомбінантні експресійні генноінженерні конструкції, до складу яких входять промотори, одержані з геному клітин ссавців (наприклад, промотор металотіонеїну) або з вірусів ссавців (наприклад, пізній промотор аденовірусу; 7,5K промотор вірусу коров'ячої віспи). За варіантом, якому віддається перевага, для експресії молекули рекомбінантного антитіла застосовують клітини бактерій, наприклад, Escherichia coli, а за варіантом, якому віддається більша перевага, клітини-еукаріоти. Наприклад, ефективною експресійною системою для антитіл є клітини ссавців, наприклад, клітини яєчника китайського хом'ячка (СНО), у поєднанні з вектором, наприклад, головним проміжним раннім промоторним елементом гена людського цитомегаловірусу (Фокінг (Foecking) та інші, (1986), Gene, 45:101; Коккет (Cockett) та інші, (1990), Bio/Technology, 8:2). В бактеріальних системах, кількість експресійних векторів може переважно вибиратись у залежності від гаданого застосування експресованої молекули антитіла. Наприклад, у разі необхідності продукування великої кількості білка, наприклад, 33 для одержання фармацевтичних композицій молекули антитіла, бажаними можуть виявитись вектори, що спрямовують експресію високих рівнів гібридних білкових продуктів, які легко піддаються очищенню. Такі вектори включають, наприклад, без обмеження, експресійний вектор pUR278 на основі геному Е. coli (Радер (Ruther) та інші, ЕМВО J., 2: 1791 (1983)), де кодувальна послідовність антитіла може індивідуально лігуватись із вектором у рамці зчитування з кодувальною ділянкою lac Z таким чином, що продукується гібридний білок; вектори ρΙΝ (Іною (Inouye) та Іною (Inouye), Nucleic Acids Res., 13:3101-3109 (1985); Ван Хек (Van Heeke) та Шустер (Schuster), J. Biol. Chem., 24:5503-5509 (1989)); тощо. Для експресії чужорідних поліпептидів, наприклад, гібридних білків із глутатіон-S-трансферазою (GST), можуть також застосовуватись вектори pGEX. Взагалі, такі гібридні білки є розчинними і можуть легко очищатись із лізованих клітин шляхом адсорбції і зв'язування з матричними глутатіонагарозними гранулами з подальшим елююванням у присутності вільного глутатіону. Вектори pGEX конструюються таким чином, щоб включати, наприклад, тромбін або сайти розщеплення протеазою фактора Ха, для того, щоб клонований цільовий генний продукт можна було виділяти зі складової GST. Однією із систем клітин комах, що застосовується як вектор для експресії чужорідного гена, є система вірусу ядерного поліедрозу Autographa californica (AcNPV). Вірус AcNPV культивують у клітинах Spodopteru frugiperda. Кодувальну послідовність антитіла можна індивідуально клонувати до замінних ділянок (наприклад, гена поліедрину) згаданого вірусу і ставити під контроль промотору AcNFV (наприклад, промотору поліедрину). У клітинах-хазяях ссавців може застосовуватись цілий ряд експресійних систем на основі вірусів. У тих випадках, коли аденовірус застосовують як експресійний вектор, кодувальна послідовність антитіла, яка становить інтерес, може лігуватись із контрольним транскрипційно/трансляційним комплексом аденовірусу, наприклад, пізнім промотором і трикомпонентною лідерною послідовністю. Цей химерний ген у подальшому може вставлятись у геном аденовірусу шляхом in vitro або in vivo рекомбінації. Наслідком інсерції до замінної ділянки вірусного геному (наприклад, ділянка Е1 або Е3) є одержання рекомбінантаого вірусу, що є життєздатним і здатним до експресії молекули антитіла у інфікованих хазяях (Доган (Logan), Шенк (Shenk), 1984, PNAS, 8 1:355-359). Для ефективної трансляції вставлених кодувальних послідовностей антитіла може виникнути потреба у специфічних сигналах ініціації. Ці сигнали включають, наприклад, ATG-ініціювальний кодон та прилеглі послідовності. На додаток до цього, ініціювальний кодон може знаходитись у фазі з рамкою зчитування бажаної кодувальної послідовності для забезпечення відповідної трансляції інсерційного сегмента у цілому. Ці екзогенні трансляційні контрольні сигнали і ініціювальні кодони можуть походити з різноманітних джерел, як природних, так і синтетичних. 93201 34 Ефективність експресії може підсилюватись включенням відповідних енхансерів транскрипції, термінаторів транскрипції тощо (дивись, наприклад, Біттнер (Bittner) та інші, 1987, Methods in Enzymol., 153:51-54). На додаток до цього, штам клітин-хазяїв може підбиратись таким чином, щоб він модулював експресію вставленої послідовності або модифікував і процесував генний продукт бажаним специфічним чином. Такі модифікації (наприклад, глікозилування) та процесинг (наприклад, розщеплення) білкових продуктів можуть бути важливими для функціонування білка. Різні клітини-хазяї мають характерні і специфічні механізми для посттрансляційного процесингу і модифікування білків і генних продуктів. Можуть підбиратись відповідні лінії клітин або системихазяї для забезпечення правильного модифікування та процесингу чужорідного білка, що експресується. З цією метою можуть застосовуватись еукаріотні клітини-хазяї, що мають клітинний механізм для відповідного процесингу первинного транскрипту, глікозилування і фосфоритування. Такі клітини-хазяї ссавців включають, наприклад, без обмеження, клітини СНО, VERY, BHK, HeLa, COS, MDCK, 293, 3Т3, W138, і, зокрема, клітинні лінії раку молочної залози, наприклад, ВТ483, Hs578T, HTB2, ВТ20 та T47D, і клітинні лінії нормальних молочних залоз, наприклад, CRL7030 та Hs578Bst. Цей винахід включає антитіла, злиті рекомбінантним шляхом або спряжені хімічним чином (з включенням як ковалентних, так і нековалентних спряжень) з поліпептидом (або його частиною, яка за варіантом, якому віддається перевага, містить щонайменше, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 або 100 прилеглих амінокислот поліпептиду), з одержанням гібридних білків. Злиття не обов'язково повинно бути прямим, а може відбуватись через лінкерні послідовності. Антитіла, злиті або спряжені з поліпептидом, можуть також застосовуватись у in vitro імуноаналізах та у методах очищення із застосуванням методів, відомих у цій галузі техніки (дивись, наприклад, Харбор (Harbor) та інші, supra, і WO 9312 1232; ЕР 439,095; Нарамура (Naramura) та інші, (1994), Immunol. Lett., 39:91-99; патент США № 5,474,981; Джілліс (Gillies) та інші, 1992, PNAS, 89:1428-1432; Фелл (Fell) та інші, 1991, J. Immunol, 146:2446-2452). Цей винахід додатково включає композиції, які містять поліпептид (або його фрагмент), злитий або спряжений з доменом антитіла, окрім варіабельної ділянки. Наприклад, поліпептид за цим винаходом (або його фрагмент) може бути злитий або спряжений із константною ділянкою антитіла, D- або J-сегментом, Fc-ділянкою або їх частиною. Частина антитіла, що злита з поліпептидом за цим винаходом (або його фрагментом), може містити константну ділянку, шарнірну ділянку, CH1 домен, СН2 домен та/або CH3 домен чи будь-яку комбінацію цілих доменів або їхніх частин. Поліпептид (або його фрагмент) може також бути злитий або спряжений із частиною антитіла, опис якої наведено у цьому описі, з утворенням мультимерів. Наприклад, Fc-частини, злиті з поліпептидом за цим 35 винаходом (або його фрагментом), можуть утворювати димери шляхом дисульфідного зв'язування Fc-частин. Мультимерні форми більш високого порядку можна одержати шляхом злиття поліпептидів із частинами IgA та IgM. Методи злиття або спряження поліпептиду за цим винаходом (або його фрагмента) із частиною антитіла є відомими (дивись, наприклад, патенти США № 5,336,603; № 5,622,929; № 5,359,046; № 5,349,053; № 5,447,851; № 5,112,946; ЕР 307,434; ЕР 367,166; WO 96/04388; WO 9106,570; Ашкеназі (Ashkenazi) та інші, (1991), PNAS, 88: 10535-10539; Женг (Zheng) та інші, (1995), J. Immunol., 154:5590-5600; і Ві (Vie) та інші, (1992), PNAS, 89: 11337-11341). Як обговорюється у цьому описі, поліпептид, поліпептидний фрагмент можуть зливатись або спрягатись із частиною антитіла, опис якої наведено або відомою у цій галузі техніки, для підвищення in vivo періоду напіввиведення. На додаток до цього, поліпептид, поліпептидний фрагмент можуть зливатись або спрягатись із частиною антитіла для полегшення очищення. У одному з прикладів застосовують химерні білки, що містять перші два домени людського СВ4-поліпептиду і різні домени константних ділянок важких або легких ланцюгів імуноглобулінів ссавців (дивись, наприклад, ЕР 394,827; Траунекер (Traunecker) та інші, (1988), Nature, 33 1:84-86). У багатьох випадках Fc-частина гібридного білка має благотворну дію у процесі лікування та діагностування і, таким чином, може сприяти, наприклад, поліпшенню фармакокінетичних властивостей (дивись, наприклад, ЕРА232, 262). За альтернативним варіантом прийнятним може виявитись видалення Fc-частини після експресії, виявлення і очищення гібридного білка. Наприклад, Fc-частина може перешкоджати проведенню лікування і встановленню діагнозу, якщо згаданий гібридний білок застосовують як антиген для імунізації. У процесі розробки лікарських засобів, наприклад, людські білки, наприклад, ML (людський інтерлейкін)-5, зливали з Fc-частинами для здійснення високопродуктивних відбіркових аналізів для ідентифікування антагоністів hIL-5 (дивись, наприклад, Беннетт (Bennett) та інші, (1995), J. Molecular Recognition, 8:52-58; Джохансон (Johanson) та інші, (1995), J. Biol. Chem., 270:94599471). Більш того, зв'язувальна композиція (або її фрагмент) може зливатись із маркерними послідовностями, наприклад, пептидом, для полегшення очищення. За варіантом, якому віддається перевага, маркерною амінокислотною послідовністю є гексагістидиновий пептид, наприклад, мітка, що надається у векторі pQE (компанія QIAGEN, Inc., Chatsworth, штат Каліфорнія), окрім інших, багато з яких є наявними на ринку. Гексагістидин забезпечує зручне очищення гібридного білка (Генц (Gentz) та інші, (1989), PNAS, 86:821-824). Інші пептвдні мітки, придатні для очищення, включають, наприклад, мітку "НА", яка відповідає антигенній детермінанті, яку одержують з білка гемаглютиніну вірусу грипу (Уілсон (Wilson) та інші, (1984), Cell, 37:767) та "сигнальну" мітку. 93201 36 Цей винахід додатково включає антитіла або їхні фрагменти, спряжеш з діагностичним або терапевтичним агентом. Згадані антитіла можуть застосовуватись із діагностичною метою, наприклад, для моніторингу розвитку або прогресування пухлини, як частина процедури клінічного випробування для визначення ефективності запровадженої схеми лікування. Виявлення може полегшуватись шляхом сполучення антитіла з виявлюваною речовиною. Приклади виявлюваних речовин включають, наприклад, різні ферменти, простетичні групи, флуоресцентні матеріали, люмінесцентні матеріали, біолюмінесцентні матеріали, радіоактивні матеріали, позитронно-активні метали із застосуванням позитронно-емісійної томографії різних типів, та нерадіоактивні іони парамагнітних металів. Виявлювана речовина може сполучатись або спрягатись з антитілом (або його фрагментом) або безпосередньо, або опосередковано, через посередника (наприклад, через відомий у цій галузі техніки лінкер), за допомогою розроблених методів (дивись, наприклад, патент США № 4,741,900 щодо іонів металу, які можуть спрягатись з антитілами для застосування у ролі діагностичних засобів за цим винаходом). Приклади відповідних ферментів включають, наприклад, без обмеження, пероксидазу з хрону, лужну фосфатазу, бета-галактозидазу або ацетилхолінестеразу; приклади відповідних комплексів простетичних груп включають, наприклад, без обмеження, стрептавідин/біотин та авідин/біотин; приклади відповідних флуоресцентних матеріалів включають, наприклад, без обмеження, умбеліферон, флуоресцеїн, флуоресцеїнізотіоціанат, родамін, діхлоротриазиніламшфлуоресцеїн, дансилу хлорид або фікоеритрин; прикладом люмінесцентного матеріалу є, наприклад, без обмеження, любінол; приклади біолюмінесцентних матеріалів включають, наприклад, без обмеження, люциферазу, люциферин та екворин; і приклади відповідного радіоактивного матеріалу включають, наприклад, І125, І131, І111 або Тс99. Зв'язувальна композиція за цим винаходом може також приєднуватись до твердих основ, які є особливо придатними для імуноаналізів або очищення антигену-мішені. До числа таких твердих основ належать, наприклад, без обмеження, скло, целюлоза, поліакриламід, нейлон, полістирол, полівінілхлорид або поліпропілен. Методи спряження терапевтичної складової з антитілом є відомими, дивись, наприклад, Амон (Amon) та інші, "Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy", у Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Рейсфелд (Reisfeld) та інші (редактори), стор. 243-256 (Alan R. Liss, Inc., 1985); Хеллстром (Hellstrom) та інші, "Antibodies For Drag Delivery", у Controlled Drug Delivery (2-е видання), Робінсон (Robinson) та інші, (редактори), стор. 623-653 (Marcel Dekker, Inc., 1987); Торп (Thorpe), "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review", у Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications, Пінчера (Pinchera) та інші, (редактори), стор. 475-506 (1985); "Analysis, Results, and Future Prospective of the Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody in 37 Cancer Therapy", у Monoclonal Antibodies for Cancer Detection and Therapy, Болдуїн (Baldwin) та інші, (редактори), стор. 303-316 (Academic Press 1985), і Торп (Thorpe) та інші, "The Preparation and Cytotoxic Properties of Antibody-Toxin Conjugates", Immunol. Rev., 62:119-158 (1982). В. Імунологічні аналізи Конкретний білок, наприклад, TGF-бета 1, може визначатись за допомогою різноманітних імунологічних аналізів, наприклад, без обмеження, конкурентних та неконкурентних аналітичних систем із застосуванням таких, наприклад, методів, без обмеження, як вестерн-блотинги, радіоімуноаналізи, ELISA (твердофазний імуноферментний аналіз), імунологічні сендвіч-аналізи, реакції імунопреципітації, преципітинові тести, преципітинові тести з дифузією у гелі, реакції імунодифузії, реакції аглютинації, реакції зв'язування комплементу, імунорадіометричні аналізи, флуоресцентні імуноаналізи та імуноаналізи на білок А. Огляд імунологічних методів та імунологічних аналізів дивись, у цілому, Стайте (Stites), Tepp (Terr) (редактори) (1991) Basic and Clinical Immunology (7-е видання). Більш того, імунологічні аналізи за цим винаходом можуть здійснюватись у багатьох конфігураціях, вичерпний огляд яких дивись Маджіо (Maggio) (редактор) (1980) Enzyme Immunoassav CRC Press, Boca Raton, Florida; Гослінг Дж.П. (Gosling J.P.), 2000 Immunoassavs: A Practical Approach (Practical Approach Series) Oxford Univ Press; Діамандіс (Diamandis), Хрістопулус (Christopoulus), 1996 Immunoassav Academic Press, San Diego, штат Каліфорнія; Тіжан (Tijan), (1985) "Practice and Theory of Enzyme Immunoassays," Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology. Elsevier Science Publishers B.V., Amsterdam; Уайлд Д. (Wild D.) (Редактор), 2001 The Immunoassay Handbook (2-е видання) Nature Pub Group; Джеймс Т. By (James T. Wu), 2000 Quantitative Immunoassay: A Practical Guide for Assay Establishment, Troubleshooting, and Clinical Application, Amer Assn for Clinical Chemistry, Бруссо (Brousseau), Боде (Beaudet) (Редактори) Manual of Immunological Methods CRC Press Boca Raton, Florida; і Гарлоу (Harlow), Лейн (Lane), Antibodies, A Laboratory Manual, supra. Дивись також Чен (Chan) (редактор) (1987) Immunoassay: A Practical Guide Academic Press, Orlando, FL; Прайс (Price), Ньюмен (Newman) (редактори), (1991) Principles and Practice of Immunoassavs Stockton Press, NY; і Нго (Ngo) (редактор) (1988) Non-isotopic Immunoassays Plenum Press, NY. Імунологічні аналізи для визначення можуть здійснюватись різноманітними відомими у цій галузі техніки методами. Стисло, імуноаналізи для визначення білка можуть бути конкурентними або неконкурентними зв'язувальними аналізами. У конкурентних зв'язувальних аналізах зразок, який піддають аналізу, конкурує із міченою досліджуваною речовиною за місця специфічного зв'язування на захватному агенті, зв'язаному з твердою поверхнею. За варіантом, якому віддається перевага, захватним агентом є антитіло, яке специфічно реагує з білком TGF-бета 1, як описано у цьому описі. Концентрація міченої досліджуваної речовини, 93201 38 зв'язаної із захватним агентом, є обернено пропорційною до кількості вільної досліджуваної речовини, присутньої у зразку. У конкурентному зв'язувальному імуноаналізі білок-мішень, присутній у зразку, конкурує з міченим білком за зв'язування зі специфічною зв'язувальною композицією, наприклад, зв'язувальною композицією, такою як антитіло, яке специфічно та/або селективно реагує з білком-мішенню. Зв'язувальна композиція може бути зафіксована на твердій поверхні для здійснення відокремлення зв'язаного міченого білка від незв'язаного міченого білка. За альтернативним варіантом конкурентний зв'язувальний аналіз може здійснюватись у рідкій фазі і різноманітні відомі у цій галузі методи можуть застосовуватись для відокремлення зв'язаного міченого білка від незв'язаного міченого білка. Після відокремлення визначають кількість зв'язаного міченого білка. Кількість білка, присутнього у зразку, є обернено пропорційною до кількості зв'язування міченого білка. За альтернативним варіантом може здійснюватись гомогенний імунологічний аналіз, який не потребує стадії відокремлення. При проведенні цих імунологічних аналізів, мітка на білку змінюється унаслідок зв'язування білка зі специфічною зв'язувальною композицією. Наслідком цієї зміни міченого білка є ослаблення або посилення сигналу, який випускає мітка, завдяки чому визначення мітки на кінці імунологічного аналізу надає можливість виявлення або кількісного визначення білка. Конкурентні аналізи є також особливо придатними у тому разі, коли клітини контактують та їх інкубують із міченим партнером зв'язування або антитілом, що має відому зв'язувальну спорідненість до білка, наприклад, 125І-антитілом, та експериментальним зразком, зв'язувальна спорідненість якого до зв'язувальної композиції визначається. Зв'язана і вільна мічені зв'язувальні композиції після цього відокремлюються для визначення ступеня зв'язування білка. Кількість зв'язаної експериментальної сполуки є обернено пропорційною до кількості міченого партнера зв'язування, яка зв'язалась із відомим джерелом. Будь-який із численних методів може застосовуватись для відокремлення зв'язаного білка від вільного білка для визначення ступеня зв'язування білка. Ця стадія відокремлення може, як правило, включати таку процедуру, як адгезія до фільтрів із подальшим промиванням, адгезія до пластику з подальшим промиванням або центрифугування клітинних мембран. Життєздатні клітини можуть також застосовуватись для перевірки впливу лікарських засобів на функцію, що опосередковується білком TGF-бета (наприклад, рівні вторинного месенджера, такі як проліферація клітин; зміни пулу інозитфосфату, транскрипція із застосуванням люциферазного аналізу та інші). Деякі методи виявлення надають можливість виключення стадії відокремлення, наприклад, чутлива до наближення система виявлення. Якісний або кількісний аналізи білків можуть також здійснюватись за допомогою різноманітних неконкурентних імуноаналітичних методів. Наприклад, може застосовуватись двостадійний твер 39 дофазний імунологічний сендвіч-аналіз. У аналізі цього типу зв'язувальна композиція для білка, наприклад, антитіло, приєднується до твердої основи. Другу білок-зв'язувальну композицію, яка також може бути антитілом і яка зв'язує білок на іншому місці, мітять. Після того, як відбулось зв'язування білка на обох місцях, незв'язану мічену зв'язувальну композицію видаляють і визначають кількість міченої зв'язувальної композиції, зв'язаної з твердою фазою. Кількість зв'язаної міченої зв'язувальної композиції є прямо пропорційною до кількості білка у зразку. У форматах імунологічного аналізу, опис яких наведено вище, застосовують мічені аналітичні компоненти. Мітка може сполучатись безпосередньо або опосередковано з бажаним компонентом аналізу у залежності від методів, добре відомих у цій галузі техніки. Можуть застосовуватись різноманітні мітки і методи. Як правило, застосовували радіоактивну мітку, що містить 3Н, 125I, 35S, 14С або 32 Р. Нерадіоактивні мітки включають білки, які зв'язуються з міченими антитілами, флюорофорами, хемілюмінесцентними агентами, ферментами і антитілами, які можуть відігравати роль специфічнозв'язувальних членів пари для міченого білка. Вибір мітки залежить від необхідної чутливості, легкості спряження зі сполукою, вимог до стабільності та доступного обладнання. Огляд різних систем мічення або продукування сигналів, що можуть застосовуватись, дивись у патенті США № 4,391,904. Зв'язувальні композиції на основі антитіл, які реагують із конкретним білком, можуть також визначатись за допомогою різноманітних імуноаналітичних методів. Огляд імунологічних та імуноаналітичних процедур, придатних для визначення антитіл за допомогою імуноаналітичних методів, дивись у Стайте (Stites), Tepp (Terr) (редактори) Basic and Clinical Immunology (7-е видання) supra; Маджіо (Maggio) (редактор) Enzyme Immunoassay, supra; і Гарлоу (Harlow), Лейн (Lane) Using Antibodies, A Laboratory Manual, supra. Стисло, імуноаналізи для визначення антисироваток, які реагують із білком-мішенню, можуть бути конкурентними або неконкурентними зв'язувальними аналізами. У конкурентних зв'язувальних аналізах досліджувана речовина зразка конкурує з міченою речовиною за специфічне місце зв'язування на захватному агенті, зафіксованому на твердій поверхні. За варіантом, якому віддається перевага, захватним агентом є очищений рекомбінантний білок. Можуть застосовуватись також інші джерела білків, у тому числі виділеного або частково очищеного природного білка. Неконкурентні аналізи включають сендвіч-аналізи, у яких досліджувана речовина зв'язується між двома специфічними для досліджуваної речовини зв'язувальними реагентами. Одна із зв'язувальних композицій застосовується як захватний агент і зафіксована на твердій поверхні. Друга зв'язувальна композиція є міченою і застосовується для визначення або виявлення одержаного комплексу візуальним або інструментальним способом. Може застосовуватись цілий ряд комбінацій захватного агента і міченої зв'язувальної композиції. Можуть 93201 40 застосовуватись різноманітні формати імунологічних аналізів, методи відокремлення і мітки, подібні до тих, опис яких було наведено вище для визначення білка. Здатність антитіла, яке становить інтерес, до утворення імунопреципітату з конкретним антигеном, може оцінюватись, наприклад, за допомогою аналізу вестерн-блотингу. Фахівцю у цій галузі техніки відомо, які параметри можуть модифікуватись для підвищення ступеня зв'язування антитіла з антигеном і для зниження фону (наприклад, шляхом попереднього очищення клітинного лізату на гранулах сефарози). Додаткове обговорення методик імунопреципітації можна знайти, наприклад, у Осбел (Ausubel) та інші, редактори, 1994, Current Protocols in Molecular Biology, том 1, John Wiley & Sons, Inc., New York. Проведення твердофазного імуноферментного аналізу (ELISA) включає одержання антигену, сенсибілізацію лунок 96-лункового титраційного мікропланшета антигеном, додання антитіла, що становить інтерес, спряженого з виявлюваною сполукою, наприклад, ферментативним субстратом (наприклад, пероксидаза з хрону або лужна фосфатаза) до лунки, інкубування впродовж певного періоду часу і виявлення присутності антигену. При проведенні твердофазних імуноферментних аналізів антитіло, яке становить інтерес, не повинно спрягатись із виявлюваною сполукою; замість цього до лунки може додаватись друге антитіло (яке розпізнає антитіло, що становить інтерес), яке спрягають із виявлюваною сполукою. На додаток до цього, замість сенсибілізування лунки антигеном, лунка може сенсибілізуватись антитілом. У цьому разі друге антитіло, спряжене з виявлюваною сполукою, може додаватись після додання до сенсибілізованої лунки антигену, який становить інтерес. Пересічний фахівець може визначити без зайвого експериментування, які параметри необхідно відрегулювати, наприклад, посилити сигнал, або які інші зміни можна внести до методики проведення твердофазного імуноферментного аналізу (дивись, наприклад, Осбел (Ausubel) та інші, редактори, 1994, Current Protocols in Molecular Biology, том 1, John Wiley & Sons, Inc., New York). Зв'язувальна спорідненість антитіла до антигену та швидкість асоціації та дисоціації взаємодії антитіло-антиген може визначатись, наприклад, за допомогою конкурентного зв'язувального аналізу. Одним необмежувальним прикладом є радіоімунологічний аналіз, що включає інкубування міченого антигену (наприклад, за допомогою 3Н або 125І) з антитілом, що становить інтерес, у присутності зростаючої кількості неміченого антигену з подальшим визначенням кількості антитіла, що зв'язалась із міченим антигеном. Спорідненість антитіла, що становить інтерес, до конкретного антигену і швидкість дисоціації можуть бути визначені за даними, які одержують, наприклад, шляхом аналізу графіка Скетчарда. Конкуренція з другим антитілом також може визначатись за допомогою, наприклад, радіоімунологічних аналізів. У цьому разі антиген інкубують з антитілом, що становить інтерес, спряженим із міченою сполукою (наприклад, 41 3 Н або 125І), у присутності зростаючої кількості неміченого другого антитіла. Фізичні варіанти Цей винахід включає також поліпептидні послідовності, що мають значну подібність та/або ідентичність амінокислотної послідовності з амінокислотною послідовністю, опис якої наведено. Подібність амінокислотної послідовності або ідентичність послідовності визначають шляхом оптимізації пар залишків. Це положення змінюється, якщо парами залишків вважати консервативні заміни. Консервативні заміни, як правило, включають заміни у межах наведених нижче груп: гліцин, аланін; валін, ізолейцин, лейцин; аспарагінова кислота, глутамінова кислота; аспарагін, глутамін; серии, треонін; лізин, аргінін; і фенілаланін, тирозин. Дивись також Нідлхем (Needleham) та інші, (1970), J. Mol. Biol. 48:443-453; Санкоф (Sankoff) та інші, (1983), Time Warps, String Edits, and Macromolecules: The Theory and Practice of Sequence Comparison Chapter One, AddisonWesley, Reading, MA; і пакети програм від компанії IntelliGenetics, Mountain View, штат Каліфорнія; та від University of Wisconsin Genetics Computer Group, Madison, штат Вісконсін. Цей винахід включає, але ними не обмежується, поліпептидні послідовності, які функціонально пов'язуються з поліпептидом, закодованим специфічним ідентифікатором послідовностей за цією заявкою. Функціонально пов'язані поліпептиди включають будь-який поліпептид, що має спільну функціональну характеристику зі зв'язувальною композицією (наприклад, здатність до селективного та/абo специфічного зв'язування TGF-бета 1 і не зв'язування TGF-бета 2 та/або TGF-бета 3). Такі функціонально пов'язані поліпептиди включають, без обмеження, додання або заміни амінокислотних залишків у межах амінокислотної послідовності, закодованої послідовностями, опис яких наведено; зокрема, додання та заміни, наслідком яких є мовчазна зміна, з одержанням, таким чином, функціонально еквівалентного поліпептиду. Амінокислотні заміни можуть здійснюватись на основі подібності полярності, заряду, розчинності, гідрофобності, гідрофільності та/або амфіпатичної природи залучених залишків. Наприклад, неполярні (гідрофобні) амінокислоти включають аланін, лейцин, ізолейцин, валін, пролін, фенілаланін, триптофан та метіонін; полярні нейтральні амінокислоти включають гліцин, серин, треонін, цистеїн, тирозин, аспарагін та глутамін; позитивно заряджені (основні) амінокислоти включають аргінін, лізин та гістидин; і негативно заряджені (кислі) амінокислоти включають аспарагінову кислоту і глутамінову кислоту. На додаток до цього, некласичні амінокислоти або хімічні амінокислотні аналоги можуть бути замінені або додані до полілептидної послідовності. Некласичні амінокислоти включають, наприклад, без обмеження, D-ізомери традиційних амінокислот; 2,4-діаміномасляну кислоту; а-аміномасляну кислоту, 4-аміномасляну кислоту, Abu, 2аміномасляну кислоту, g-Abu, e-Ahx, 6амінокапроєву кислоту, Aid, 2-аміноізомасляну кислоту, 3-амінопропіонову кислоту, орнітин, нор 93201 42 лейцин, норвалін, гідроксипролін, саркозин, цитрулін, гомоцитрулін, цистеїнову кислоту, tбутилгліцин, t-бутилаланін, фенілгліцин, циклогексилаланін, b-аланін, фторамінокислоти, штучні амінокислоти, наприклад, b-метиламінокислоти, Са-метиламінокислоти, Na-метиламінокислоти і амінокислотні аналоги взагалі. На додаток до цього, амінокислоти можуть бути правообертальними (D) або лівообертальними (L). Додання пептидних складових для полегшення маніпулювання є знайомою і традиційною методикою у цій галузі техніки. Більш того, зв'язувальна композиція (у тому числі будь-який її фрагмент і, зокрема, антигенна детермінанта) може комбінуватись із ділянками константного домену імуноглобуліну, наприклад, (IgA, IgE, IgG, IgM), їхніми частинами (CH1, СН2, CH3) і будь-якою їх комбінацією (з включенням доменів у цілому і їхніх частин), з одержанням химерного поліпептиду. Такі гібридні білки можуть полегшити очищення, і часто є придатними для підвищення in vivo періоду напіввиведення білка. Наприклад, це було продемонстровано для химерних білків, що містять перші два домени людського CD4 поліпептиду і різні домени константних ділянок важкого або легкого ланцюгів імуноглобулінів ссавців (ЕР 394,827; Траунекер (Traunecker) та інші, 1988, Nature, 331:8486). Гібридні білки з димерними структурами, зв'язаними дисульфідними містками (завдяки домену IgG) можуть також бути більш ефективними у зв'язуванні та нейтралізуванні інших молекул, аніж мономерний секретований білок або поодинокий фрагмент білка (Фунтулакіс (Fountoulakis) та інші, 1995, J. Biochem., 15 270:3958-3964). Посилена доставка антигену через епітеліальний бар'єр до імунної системи була продемонстрована для антигенів (наприклад, інсуліну), спряжених із FcR зв'язувальним партнером, наприклад, IgG або Fcфрагментами (дивись, наприклад, WO 96/22024 та WO 99/104813). На додаток до цього, гібридний білок може містити різні частини константної ділянки імуноглобулінової молекули разом із людським білком (або його частиною). У багатьох випадках, Fc частина гібридного білка відіграє сприятливу роль при лікуванні і встановленні діагнозу і, таким чином, може забезпечити, наприклад, поліпшені фармакокінетичні властивості. За альтернативним варіантом бажаним може бути видалення Fc частини після того, як гібридний білок був експресований, виявлений і очищений. Наприклад, Fc частина може ускладнювати лікування та/або діагноз, якщо гібридний білок застосовують як імуноген для імунізації. При розробці лікарських засобів, наприклад, людські білки зливали з Fc частинами для проведення високопродуктивних відбіркових аналізів для ідентифікування антагоністів. На додаток до цього, нові генно-інженерні конструкції можна створювати шляхом комбінування подібних функціональних доменів від інших білків. Наприклад, білок-зв'язувальні або інші сегменти можуть "обмінюватись" між різними новими гібридними поліпептидами або фрагментами. Таким чином, завдяки функціональному зв'язку білокзв'язувальних специфічностей та інших функціо 43 нальних доменів будуть одержані нові химерні поліпептиди, що демонструють нові комбінації специфічностей. На додаток до цього, гібридні конструкції можна одержати за допомогою перестановки генів, перестановки мотивів, перестановки екзонів та/або перестановки кодонів. Словосполучення "по суті чиста(-ий)" означає нуклеїнову кислоту, білок або поліпептид, видалені зі свого природного середовища і виділені та/або відокремлені від інших забруднювальних білків, нуклеїнових кислот та інших біологічних препаратів. Чистота або "виділення" можуть аналізуватись стандартними методами, і нуклеїнова кислота, білок або поліпептид будуть, звичайно, мати щонайменше приблизно 50% чистоту, звичайніше щонайменше приблизно 60% чистоту, як правило щонайменше приблизно 70% чистоту, зазвичай щонайменше приблизно 80% чистоту, часто щонайменше приблизно 85% чистоту, частіше щонайменше приблизно 90% чистоту, за варіантом, якому віддається перевага, щонайменше приблизно 95% чистоту, за варіантом, якому віддається більша перевага, щонайменше приблизно 98% чистоту і за варіантами, яким віддається найбільша перевага, щонайменше 99% чистоту. Подібні концепції можуть застосовуватись, наприклад, до зв'язувальних композицій, наприклад, антитіл за цим винаходом. Наприклад, необхідним може виявитись очищення поліпептиду з рекомбінантних клітинних білків або поліпептидів. "Розчинність" білка або поліпептиду відображається осадженням, яке вимірюють у одиницях Сведберга, які є критерієм швидкості осадження молекули за конкретних обставин. Визначення швидкості осадження традиційно здійснювали у аналітичній ультрацентрифузі, зараз, однак, як правило, здійснюють у стандартній ультрацентрифузі (дивись, Фрейфелдер (Freifelder), 1982, Physical Biochemistry (2-е видання), W.H. Freeman & Co., San Francisco, штат Каліфорнія; і Кантор (Cantor), Шіммель (Schimmel), (1980), Biophysical Chemistry, частини 1-3, W.H. Freeman & Co., San Francisco, штат Каліфорнія). Як приблизне визначення, зразок, що містить гіпотетично розчинний поліпептид, центрифугують у стандартній ультрацентрифузі натуральної величини із частотою приблизно 50000 об/хв впродовж приблизно 10 хв. Розчинні молекули залишать у надосадовій рідині. Коефіцієнт седиментації розчинної частинки або поліпептиду буде, як правило, меншим за приблизно 30S, за більш типовим варіантом, меншим за приблизно 15S, звичайно меншим за приблизно 10S, звичайніше меншим за приблизно 6S, і, за конкретними варіантами, яким віддається перевага, меншим за приблизно 4S, і за варіантом, якому віддається більша перевага, меншим за приблизно 3S. Розчинність поліпептиду або фрагмента залежить від довколишнього середовища і самого поліпептиду. Багато параметрів впливають на розчинність поліпептиду, у тому числі температура, електролітичне оточення, розмір і молекулярні характеристики поліпептиду та природа розчинника. За типовим варіантом температура, при якій застосовують поліпептид, коливається у межах від приблизно 4°С до приблизно 65°С. Як правило, 93201 44 температура при застосуванні є вищою за приблизно 18°С і ще частіше вищою за приблизно 22°С. Для діагностичних цілей температура буде, як правило, дорівнювати приблизно кімнатній температурі або буде вищою, однак, нижчою за температуру денатурації компонентів аналізу. Для терапевтичних цілей температура буде, як правило, дорівнювати температурі тіла, як правило, приблизно 37°С для людей, хоча, за певних ситуацій, температура може підвищуватись або зменшуватись in situ або in vitro. Розмір і структура поліпептиду повинні бути, взагалі, у по суті стабільному стані, і, як правило, не у денатурованому стані. Поліпептид може об'єднуватись з іншими поліпептидами у четвертинну структуру, наприклад, для забезпечення розчинності, або зв'язуватись із ліпідами або детергентами таким чином, який нагадує взаємодії подвійного шару природних ліпідів. Розчинником, як правило, буде біологічно сумісний буфер того типу, який застосовують для збереження біологічних активностей і він буде, як правило, наближатись до фізіологічного розчинника. Розчинник, як правило, буде мати нейтральний рН, за типовим варіантом у межах від приблизно 5 до 10, за варіантом, якому віддається перевага, він буде дорівнювати приблизно 7,5. У деяких випадках буде додаватись детергент, як правило, м'який неденатурований детергент, наприклад, CHS (холестерину гемісукцинат) або CHAPS (3-[3хлорамідопропіл)диметиламоніо]-1пропансульфонат) із достатньо низькою концентрацією для запобігання значного порушення структурних або фізіологічних властивостей білка. За варіантом, якому віддається перевага, розчинність зв'язувальної композиції за цим винаходом (рН 5,0-6,0 і 150 мМ розчин NaCl) є більшою за 10 мг/мл, 15 мг/мл, 20 мг/мл, 25 мг/мл, 30 мг/мл, 35 мг/мл або 40 мг/мл; за варіантом, якому віддається більша перевага, більшою за 41 мг/мл, 42 мг/мл, 43 мг/мл, 44 мг/мл, 45 мг/мл, 46 мг/мл, 47 мг/мл, 48 мг/мл, 49 мг/мл, 50 мг/мл; за варіантом, якому віддається ще більша перевага, більшою за 51 мг/мл, 52 мг/мл, 53 мг/мл, 54 мг/мл, 55 мг/мл, 56 мг/мл, 57 мг/мл, 58 мг/мл, 59 мг/мл або 60 мг/мл, і за варіантом, якому віддається іще більша перевага, більшою за 65 мг/мл, 70 мг/мл, 75 мг/мл, 80 мг/мл, 85 мг/мл, 90 мг/мл, 95 мг/мл, 100 мг/мл, 105 мг/мл, 110 мг/мл, 115 мг/мл, 120 мг/мл, 125 мг/мл, 130 мг/мл, 135 мг/мл, 140 мг/мл або 150 мг/мл (або у діапазоні між будь-яким двома такими значеннями, де згаданий діапазон може включати або не включати кожну або обидві кінцеві точки). Варіанти Цей винахід спрямовано на поліпептиди, що містять або, за альтернативним варіантом, складаються з амінокислотної послідовності, яка є щонайменше на 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ідентичною, наприклад, поліпептидній послідовності за цим винаходом (або її фрагментам). Визначення того, чи демонструє конкретна послідовність ідентичність до послідовності зв'язувальної композиції, може здійснюватись за допомогою відомих у цій галузі техніки методів. Як правило, у разі такого порівняння послідовностей, одна послідовність відіграє роль еталонної 45 послідовності, з якою порівнюють експериментальні послідовності. У разі застосування алгоритму порівняння послідовностей, експериментальну та еталонну послідовності вводять до комп'ютера, після чого, у разі необхідності, визначають координати і параметри програми алгоритму порівняння послідовностей. Після цього алгоритм порівняння послідовностей обчислює відсоткову ідентичність послідовностей для експериментальної(-их) послідовності(-ей) відносно еталонної послідовності, виходячи з параметрів визначеної програми. Оптимальне впорядковане розміщення послідовностей для порівняння може здійснюватись, наприклад, алгоритмом локальної гомології за Сміт (Smith) і Уотермен (Waterman), (1981), Adv. Appl. Math., 2:482, алгоритмом порівняльного гомологічного аналізу за Нідлменом (Needlman) та Вушпем (Wunsch), (1970), J. Mol. Biol. 48:443, методом пошуку подібності за Пірсоном (Pearson) та Ліпманом (Lipman), (1988), Ргос. Nat'l Acad. Sci. USA 85:2444, комп'ютеризованим здійсненням цих алгоритмів (GAP, BESTFIT, FASTA і TFASTA у пакеті програм Wisconsin Genetics Software Package, компанія Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, штат Вісконсін), набором біоінформатичних комп'ютерних програм LASERGENE, який випускається компанією DNASTAR (Madison, штат Вісконсін), методом порівняльного аналізу численних послідовностей, який було розроблено Нотрдамом (Notredame) та іншими (наприклад, 3Dcoffee або Tcoffee у, наприклад, Nucleic Acids Res., 2004:32 (веб-серверне видання):W37-40; Nucleic Acids Res., 2003, червень, 1;31(13):35033506; або Pharmacogenomics, 2002, січень; 3(1):131-134); або візуальною перевіркою (дивись, взагалі, Осбел (Ausubel) та інші, supra). Добре відомими є інші методи порівняння нуклеотидних або амінокислотних послідовностей шляхом визначення оптимального суміщення (дивись, наприклад, Перускі (Peraski) та Перускі (Peruski), The Internet and the New Biology: Tools for Genumic and Molecular Research (ASM Press, Inc. 1997); By (Wu) та інші, (редактори), "Information Superhighway and Computer Databases of Nucleic Acids and Proteins." у Methods in Gene Biotechnology, стор. 123-151 (CRC Press, Inc. 1997); або Бішоп (Bishop) (редактор), Guide to Human Genome Computing. 2-е видання (Academic Press, Inc. 1998)). Поліпептид, що демонструє або має щонайменше приблизно, наприклад, 95% "ідентичність послідовності" з іншою амінокислотною послідовністю, може включати, наприклад, до п'яти амінокислотних змін на кожен відрізок із 100 амінокислот експериментальної амінокислотної послідовності. Іншими словами, у першої амінокислотної послідовності, що має щонайменше 95% ідентичність з другою амінокислотною послідовністю, до 5% від загальної кількості амінокислотних залишків можуть відрізнятись від згаданої другої послідовності, наприклад, унаслідок вставок, делецій або заміни амінокислотних залишків. Зміни амінокислотних залишків поліпептидної послідовності можуть відбуватись, наприклад, у аміно- чи карбоксикінцевих положеннях або будь-де між 93201 46 цими кінцевими положеннями, і розміщатись по черзі серед залишків згаданої послідовності або одним чи декількома відрізками, частинами або фрагментами суміжних амінокислотних залишків у межах згаданої послідовності. На практиці визначення того, чи будь-яка конкретна поліпептидна послідовність демонструє щонайменше приблизно 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% або 99% подібність до іншої послідовності, наприклад, як показано у наведеній у цьому описі Таблиці, може здійснюватись за допомогою відомих у цій галузі техніки методів. Варіанти, які входять до складу цього винаходу, можуть містити зміни у кодувальних ділянках, некодувальних ділянках або у обох із них. Більш того, перевага віддається також варіантам, у яких 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 або 10 амінокислот є заміненими, видаленими або доданими у будь-який комбінації. Штучні варіанти можна одержати методами мутагенезу або безпосереднім синтезуванням за допомогою відомих методів білкової інженерії та методів рекомбінантних ДНК. Такі варіанти можуть продукуватись для поліпшення або зміни характеристик поліпептиду зв'язувальної композиції (або його фрагмента). Наприклад, одна або декілька амінокислот можуть видалятись із N-кінця або С-кінця секретованого поліпептиду за цим винаходом (або його фрагмента) без суттєвої втрати біологічної функції. Наприклад, Рон (Ron) та інші, 1993, J. Biol. Chem., 268:2984-2988, повідомляли про варіанти білків KGF, що мають гепарин-зв'язувальну активність навіть після видалення 3, 8 або 27 амінокінцевих амінокислотних залишків. Наприклад, антигенність та/або імуногенність може бути збереженою (наприклад, здатність делеційного варіанта індукувати та/або зв'язувати антитіла, що розпізнають зрілу форму поліпептиду), коли на N-кінці або С-кінці видаляють менше ніж більшість залишків секретованої форми. Чи зберігає поліпептид, якому бракує Nабо С-кінцевих залишків білка, такі активності, можна легко визначити традиційними методами, опис яких наведено або які є відомими у цій галузі техніки. Таким чином, цей винахід включає також, наприклад, варіанти поліпептидів, які демонструють біологічну активність, наприклад, імуногенність або антигенність. Такі варіанти включають, наприклад, делеції, вставки, інверсії, повтори і заміни, вибрані таким чином, щоб мати незначний вплив на активність, за допомогою загальних правил, відомих у цій галузі техніки. Наприклад, Боуі (Bowie) та інші, (1990), Science, 247: 1306-1310, розкривають спосіб здійснення фенотипово мовчазних амінокислотних замін. Окрім застосування консервативних амінокислотних замін, інші варіанти за цим винаходом включають, наприклад, однак обмежуються, наприклад, (і) замінами одним або декількома неконсервативними амінокислотними залишками, де замінені амінокислотні залишки можуть бути або можуть не бути залишками, які кодуються генетичним кодом, (іі) заміною одним або декількома амінокислотними залишками, що мають замінну групу, або (ііі) злиттям зрілого поліпептиду з іншою сполукою, наприклад, сполукою для підвищення 47 стабільності та/або розчинності поліпептиду (наприклад, поліетиленгліколь) або (iv) злиттям поліпептиду з додатковими амінокислотами, наприклад, пептидом IgG Fc гібридної ділянки або лідерною чи секреторною послідовністю або послідовністю, що полегшує очищення. Усі такі варіанти будуть знаходитись у межах можливостей фахівців у галузі молекулярної біології, приймаючи до уваги розкриття, надане Заявниками у цьому описі, наприклад, із визначенням специфічних полінуклеотидних і поліпептидних послідовностей. Наприклад, варіанти поліпептидів, що містять амінокислотні заміни заряджених амінокислот на інші заряджені або нейтральні амінокислоти, можуть продукувати поліпептиди з поліпшеними характеристиками, наприклад, із меншим ступенем агрегації. Агрегація фармацевтичних композицій знижує активність і підвищує кліренс унаслідок імуногенної активності агрегату (Пінкард (Pinckard) та інші, (1967), Clin. Exp. Immunol, 2:331-340; Роббінс (Robbins) та інші, (1987), Diabetes, 36:838-845; Клеланд (Cleland) та інші, (1993), Crit. Rev. Therapeutic Drug Carrier Systems, 10:307-377). За варіантом здійснення, якому віддається перевага, зв'язувальна композиція за цим винаходом, яку одержали у буферній системі з відповідним рН (як описано у цьому описі або відомо у цій галузі техніки), не демонструє значної агрегації після інкубування впродовж щонайменше 1 місяць, 2 місяці, 3 місяці, 4 місяці, 5 місяців, 6 місяців, 7 місяців, 8 місяців або 9 місяців при температурі у діапазоні приблизно 1-10°С, за варіантом, якому віддається більша перевага, 2-8°С, за варіантом, якому віддається ще більша перевага, 3-7°С, і за варіантом, якому віддається навіть ще більша перевага, 56°С. Додатковим варіантом здійснення цього винаходу передбачається композиція, до складу якої входить амінокислотна послідовність за цим винаходом, що містить щонайменше одну амінокислотну заміну, але не більше ніж 50 амінокислотних замін, за варіантом, якому віддається більша перевага, не більше ніж 40 амінокислотних замін, за варіантом, якому віддається ще більша перевага, не більше ніж 30 амінокислотних замін і за варіантом, якому віддається навіть ще більша перевага, не більше ніж 20 амінокислотних замін, не більше ніж 15 амінокислотних замін. Звичайно, у порядку все зростаючої переваги, для пептиду або поліпептиду вкрай бажано мати амінокислотну послідовність, до складу якої входить амінокислотна послідовність за цим винаходом, що містить щонайменше: одну, але не більше ніж: 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 або 1 амінокислотна заміна. За конкретними варіантами здійснення кількість додань, замін та/або делецій у Поліпептидній послідовності за цим винаходом або її фрагментах становить щонайменше: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 10-50 або 50-150; де консервативним амінокислотним замінам віддається більша перевага, аніж неконсервативним замінам. Варіанти терапевтичного застосування Цей винахід пропонує також реактиви придатної терапевтичної цінності. Терапевтичні зв'язува 93201 48 льні композиції за цим винаходом включають, наприклад, без обмеження, зв'язувальні композиції на основі антитіл за цим винаходом (з включенням їхніх фрагментів, аналогів та похідних, як описано у цьому описі) та нуклеїновокислотні молекули, які кодують їх (з включенням їх фрагментів, аналогів і похідних та антиідіотипових антитіл, як описано у цьому описі). Таке антитіло може застосовуватись для модулювання, лікування, пригнічення, полегшення інтенсивності симптомів або запобігання захворюванням, розладам або станам, пов'язаним з експресією та/або активністю TGF-бета 1 (або його фрагмента), що відхиляється від норми, у тому числі, наприклад, без обмежень, будь-якому одному або декільком захворюванням, розладам, синдромам або станам, що описані у цьому описі. Лікування, полегшення інтенсивності симптомів та/або запобігання захворюванням, розладам або станам, пов'язаним з експресією та/або активністю TGF-бета 1, що відхиляється від норми, включає, наприклад, без обмеження, полегшення інтенсивності симптомів, пов'язаних із цими захворюваннями, розладами або станами. Наприклад, захворювання або розлад, пов'язані з експресією, що відхиляється від норми, або передачею сигналу TGF-бета 1, що відхиляється від норми, є мішенню для антагоніста TGF-бета 1, такого як зв'язувальна композиція за цим винаходом. Цей винахід включає методи лікування на основі зв'язувальної композиції, що залучають введення зв'язувальної композиції тварині, за варіантом, якому віддається перевага, ссавцю, за варіантом, якому віддається найбільша перевага, примату (наприклад, людині), для модулювання, лікування, пригнічення, впливання або зменшення важкості одного або декількох із розкритих захворювань, розладів або станів, опис яких наведено. Наприклад, не зв'язуючи себе теорією, було показано, що антитіла, специфічні по відношенню до людського TGF-бета, є ефективними на тваринних моделях для лікування захворювань, де відбувається надекспресія рецептора TGF (TGFR). Було показано, що антисироватка проти TGF-бета є ефективною при лікуванні гломерулонефриту (Бордер (Border) та інші, 1990, Nature, 346:371-374) і фіброзу легень (Гірі (Giri) та інші, 1993, Thorax, 48:959-966). Унаслідок цього, нові зв'язувальні композиції за цим винаходом із поліпшеними характеристиками також будуть ефективними щодо зменшення важкості станів або захворювань, наприклад, фіброзних захворювань і станів, пов'язаних із TGF-бета 1. Рекомбінантні та/або виділені зв'язувальні композиції за цим винаходом, такі як, наприклад, антитіла, можуть бути очищені і введені суб'єкту для лікування. Ці реагенти можуть бути об'єднані для застосування з додатковими активними або інертними інгредієнтами, наприклад, у традиційних фармацевтично прийнятних носіях або розріджувачах, наприклад, імуногенних ад'ювантах, разом із фізіологічно нешкідливими стабілізаторами та наповнювачами. Ці комбінації можуть стерилізуватись шляхом фільтрування з одержанням дозованих лікарських форм, наприклад, шляхом ліофілізації у дозованих ампулах або для зберігання у 49 вигляді стабілізованих водних препаратів. Цей винахід передбачає також застосування антитіл або їхніх зв'язувальних фрагментів, у тому числі форм, які не зв'язують комплементу. Інший варіант терапевтичного підходу, включений до цього винаходу, включає безпосереднє введення реагентів, лікарських форм або композицій суб'єкту будь-яким традиційним способом введення (таким як, наприклад, без обмеження, місцева ін'єкція, інгаляція або системне введення). Цей винахід пропонує також фармацевтичну упаковку або набір, до складу яких входить один або декілька контейнерів, заповнених одним або декількома інгредієнтами композицій за цим винаходом, та інструкції, наприклад, по видаленню (як правило у формі, приписаній урядовим органом, що регулює виготовлення, застосування або продаж фармацевтичних препаратів або біологічних продуктів). Способи введення включають внутрішньовенне, внутрішньоочеревинне або внутрішньом'язове введення, черезшкірну дифузію тощо. Фармацевтично прийнятні носії включають воду, фізіологічний розчин, буфери та інші сполуки, опис яких наведено, наприклад, у довіднику Merck Index, компанія Merck & Co., Rahway, штат НьюДжерсі. Відомо, що у клітин тих типів, які, за даними назерн-блотингу, мають мРНК TGF-бета 1, існують інші атипові еволюційністани, які включені до цього винаходу (дивись, наприклад, Берков (Berkow) (редактор), The Merck Manual of Diagnosis and Therapy, Merck & Co., Rahway, N.J.; Торн (Thorn) та інші, Harrison's Principles of Internal Medicine, McGraw-Hill, N.Y.; і Річ (Rich) (редактор), Clinical Immunology; Principles and Practice, Mosby, St. Louis (сучасне видання)). Еволюційні або функціональні відхилення від норми (наприклад, у нервовій, імунній або кровотворній системі) спричинюють значні медичні відхилення від норми і стани, які можуть бути сприйнятливими до запобігання або лікування із застосуванням композицій, які пропонуються цим винаходом. Інший варіант терапевтичного підходу, включений до цього винаходу, включає безпосереднє введення реагентів, лікарських форм або композицій суб'єкту будь-яким традиційним способом введення (таким як, наприклад, без обмеження, місцева ін'єкція, інгаляція або системне введення). Передбачені цим винаходом реагенти, лікарські форми або композиції можуть цілеспрямовуватись за допомогою будь-якого способу, опис якого наведено, або відомого у цій галузі техніки. Фактична доза реагента, лікарської форми або композиції, що модулює захворювання, розлад, стан, синдром тощо, залежить від багатьох факторів, у тому числі величини та стану здоров'я організму, хоча пересічний фахівець у цій галузі техніки може вдаватись до наведених нижче джерел, які описують способи і методи визначення клінічних доз (дивись, наприклад, Спілкер (Spilker), (1984), Guide to Clinical Studies and Developing Protocols, Raven Press Books, Ltd., New York, стор. 7-13, 54-60; Спілкер (Spilker), (1991), Guide to Clinical Trials, Raven Press, Ltd., New York, стор. 93-101; Kper (Craig), Стіцел (Stitzel), (редактори, 1986), Modern 93201 50 Pharmacology, 2-е видання, Little, Brown and Co., Boston, стор. 127-133; Спіхт (Speight), (редактор, 1987), 3-є видання, Williams and Wilkins, Baltimore, стор. 50-56; Талларіда (Tallarida) та інші, (1988), Principles in General Pharmacology, Springer-Verlag, New York, стор. 18-20; та патенти США № 4,657,760; № 5,206,344; або № 5,225,212.). Як правило, дорослій людині вводять лікарську форму з кінцевою концентрацією у межах приблизно від 0,5 фг/мл до 500 мкг/мл включно у будь-якому фармацевтично прийнятному носії. На додаток до цього, результати експериментів на тваринах є надійним порадником щодо визначення ефективних доз для лікування людей. Міжвидове масштабування ефективних доз може здійснюватись за принципами, відомими у цій галузі техніки (дивись, наприклад, Морденті (Mordenti) та Чеппелл (Спарреll), (1989), "The Use of Interspecies Scaling in Toxicokinetics," у Toxicokinetics and New Drug Development; Якобі (Yacobi) та інші, (редактори) Pergamon Press, NY). Ефективні дози можуть також бути екстрапольовані за допомогою кривих залежності "дозавплив", які були одержані in vitro або за допомогою тест-систем з на тваринних моделях. Наприклад, для антитіл доза, як правило, становить 0,1-100 мг/кг маси тіла реципієнта. За варіантом, якому віддається перевага, доза знаходиться у межах 0,1-20 мг/кг маси тіла реципієнта, за варіантом, якому віддається більша перевага, 1-10 мг/кг маси тіла реципієнта. Взагалі, гомоспецифічні антитіла мають довший період напіввиведення, аніж гетероспецифічні антитіла (наприклад, людські антитіла довше залишаються у межах організму людини-хазяїна, аніж антитіла від іншого виду, наприклад, мишей, ймовірно, унаслідок імунної реакції хазяїна на чужорідну композицію). Таким чином, часто можливою є нижча доза людських антитіл і рідше введення, якщо антитіла вводять людині. На додаток до цього, доза і частота введення антитіл за цим винаходом можуть бути зменшені шляхом підсилення поглинання і проникнення до тканин (наприклад, до головного мозку) завдяки застосуванню модифікацій, наприклад, ліпідизації. Цей винахід пропонує також фармацевтичну упаковку або набір, до складу яких входить один або декілька контейнерів, заповнених одним або декількома інгредієнтами композицій за цим винаходом, та інструкції, наприклад, по видаленню (як правило у формі, приписаній урядовим органом, що регулює виготовлення, застосування або продаж фармацевтичних препаратів або біологічних продуктів). Кількість реагентів, необхідна для ефективного лікування, буде залежати від багатьох різних факторів, у тому числі засобів введення, місцямішені, фізіологічного стану хворого та інших лікарських засобів, які були введені. Таким чином, лікувальні дози повинні титруватись для оптимізації безпечності та ефективності. Як правило, дози, що застосовують in vitro, можуть надати корисну інформацію щодо кількості, придатної для in situ введення цих реагентів. Випробування ефективних доз для лікування конкретних розладів на тва 51 ринах надасть додаткову прогностичну вказівку щодо дозування для людей. Різні міркування описують, наприклад, у Гілман (Gilman) та інші, (редактори) (1990) Goodman and Gilman's: The Pharmacological Bases of Therapeutics, (8-е видання) Pergamon Press; та (1990) Remington's Pharmaceutical Sciences, (17-e видання) Mack Publishing Co., Easton, PA. У цих виданнях і нижче обговорюються способи введення, наприклад, пероральне, внутрішньовенне, внутрішньоочеревинне або внутрішньом'язове введення, черезшкірна дифузія тощо. Фармацевтично прийнятні носії включають воду, фізіологічний розчин, буфери та інші сполуки, опис яких наведено, наприклад, у довіднику Merck Index, Merck & Co., Rahway, NJ. Діапазони доз, за нормальних обставин, очікуються у кількостях, нижчих за 1 мМ концентрації, як правило, у концентраціях, менших за приблизно 10 мкМ, як правило, менших за приблизно 100 нМ, за варіантом, якому віддається перевага, менших за приблизно 10 пМ (пікамольні концентрації), і за варіантом, якому віддається найбільша перевага, менших за приблизно 1 фМ (фемтомольні концентрації), з відповідним носієм. Для безперервного введення часто будуть застосовуватись лікарські форми пролонгованої дії або апарати пролонгованої дії. Зв'язувальні композиції можуть вводитись безпосередньо до хазяїна, якого піддають лікуванню, або, у залежності від розміру сполук, може виникнути необхідність їх спряження з білкаминосіями, наприклад, овальбуміном або сироватковим альбуміном, перед їх введенням. Терапевтичні композиції можуть вводитись у будь-якій традиційній лікарській формі. Незважаючи на те, що активний інгредієнт може вводитись самостійно, перевага віддається представленню його у вигляді фармацевтичної композиції. До складу композиції, як правило, входить щонайменше один активний інгредієнт, як визначено у цьому описі, разом з одним або декількома прийнятними носіями згаданого активного інгредієнта. Кожен носій повинен бути фармацевтично і фізіологічно прийнятним у тому розумінні, що він повинен бути сумісним з іншими інгредієнтами і не шкідливим для хворого. До числа композицій належать композиції, придатні для перорального, ректального, інтраназального або парентерального (у тому числі підшкірного, внутрішньом'язового, внутрішньовенного та внутрішньошкірного) введення. Композиції для зручності можуть бути представлені у вигляді дозованої лікарської форми і виготовлятись за допомогою будь-яких методів, добре відомих у галузі фармації. Дивись, наприклад, Гілман (Gilman) та інші, (редактори) (1990) Goodman and Gilman's: The Pharmacological Bases of Therapeutics, (8-е видання) Pergamon Press; та (1990) Remington's Pharmaceutical Sciences, (17-е видання) Mack Publishing Co., Easton, PA; Евіс (Avis) та інші, (редактори), (1993), Pharmaceutical Dosage Forms: Parenteral Medications Dekker, NY; Ліберман (Lieberman) та інші, (редактори), (1990), Pharmaceutical Dosage Forms: Tablets Dekker, NY; і Ліберман (Lieberman) та інші, (редактори), (1990), Pharmaceutical Dosage Forms: Disperse Systems 93201 52 Dekker, NY. Лікарський засіб за цим винаходом може об'єднуватись або застосовуватись у поєднанні з іншими терапевтичними засобами, наприклад, інгібіторами АСЕ (ацетилхолінестерази). Цей винахід пропонує також фармацевтичну композицію. Така композиція містить, наприклад, терапевтично ефективну кількість композиції за цим винаходом у фармацевтично прийнятному носії. Словосполучення "фармацевтично прийнятний носій", яке вживається у цьому описі, означає носій, схвалений федеральним регулятивним органом Сполучених Штатів Америки або регуляторним/адміністративним органом уряду штату Сполучених Штатів, або носій, який наведено у Фармакопеї CША або іншій фармакопеї, який, як правило, визнається фахівцями у цій галузі техніки, як придатний для застосування на тварині, наприклад, ссавці, і, конкретніше, на приматі, наприклад, людині. Термін "носій", який вживається у цьому описі, означає розріджувач, ад'ювант, наповнювач, який вводять спільно з композицією за цим винаходом. Фармацевтичний носій, як правило, може бути стерильною рідиною, наприклад, водою або маслами (оліями) (у тому числі нафтового, тваринного, рослинного або синтетичного походження, наприклад, арахісова олія, соєва олія, мінеральне масло, кунжутна олія тощо). Стерильна вода, як правило, є носієм, якому віддається перевага, у тому разі, коли фармацевтичну композицію вводять внутрішньовенним шляхом. Фізіологічні розчини та водні розчини декстрози і гліцерину можуть також застосовуватись як рідкі носії, зокрема, для ін'єкційних розчинів. Прийнятні фармацевтичні наповнювачі включають, наприклад, без обмеження, крохмаль, глюкозу, лактозу, цукрозу, желатин, солод, рис, муку, крейду, силікагель, стеарат натрію, моностеарат гліцерину, тальк, хлорид натрію, сухе знежирене молоко, гліцерин, пропіленгліколь, воду, етанол тощо. Композиція за цим винаходом, у разі потреби, може також містити незначні кількості змочувальних або емульгувальних речовин чи агентів для регулювання рН. Композиція за цим винаходом може бути у формі розчину, суспензії, емульсії, таблетки, драже, капсули, порошку, лікарської форми пролонгованої дії тощо, або їй може надаватись форма супозиторію (з традиційними в'яжучими речовинами та/або носіями, наприклад, тригліцеридами). Додаткові приклади відповідних фармацевтичних носіїв описують у сучасному виданні Remington's Pharmaceutical Sciences Е.У. Мартін (E.W. Martin). Такі лікарські форми будуть містити терапевтично ефективну кількість композиції за цим винаходом, за варіантом, якому віддається перевага, у очищеному вигляді, спільно з відповідною кількістю носія для забезпечення можливості відповідного введення суб'єкту. За традиційним варіантом лікарська форма буде відповідати способу введення. За варіантом, якому віддається перевага, композицію виготовляють за традиційними методами як фармацевтичну композицію, пристосовану для внутрішньовенного введення, наприклад, людині. За типовим варіантом композиції для внутрішньо 53 венного введення являють собою розчини у стерильному ізотонічному рідкому буфері. У разі необхідності, композиція може також містити, наприклад, солюбілізаційний агент і місцевий анестетик, наприклад, лідокаїн, для забезпечення відчуття комфорту у місці ін'єкції. Взагалі, ипредієнти постачають роздільно або змішаними у дозованій лікарській формі, наприклад, у вигляді сухого ліофілізованого порошку або безводного концентрату у герметично закритому контейнері (наприклад, ампулі або саше із зазначеною кількістю активного агента). У разі, якщо композицію повинна вводитись шляхом вливання, вона може відпускатись у флаконі для внутрішньовенного вливання, що містить стерильну воду або фізіологічний розчин фармацевтичної чистоти. У разі, якщо композицію вводять шляхом ін'єкції, може надаватись ампула стерильної води для ін'єкцій або фізіологічного розчину для того, щоб інгредієнти можна було змішати перед введенням. Композиціям за цим винаходом можуть надаватись нейтральні або сольові форми. Фармацевтично прийнятні солі включають, наприклад, без обмеження, аніонні солі (наприклад, солі хлористоводневої, фосфорної, оцтової, щавлевої, винної кислот тощо) і катіонні солі (наприклад, солі натрію, калію, амонію, кальцію, гідроксидів заліза, ізопропіламіну, триетиламіну, 2-етиламіноетанолу, гістидину, прокаїну тощо). Фіброзні захворювання, розлади або стани Зв'язувальна композиція, наприклад, така як антитіло, придатна для лікування станів, пов'язаних із фіброзними захворюваннями. Наслідком накопичення компонентів позаклітинного матриксу (ЕСМ) або заміни нормального клітинного матеріалу компонентами ЕСМ у різноманітних клітинах, тканинах і органах може бути фіброз, який спричинює захворювання. Прогресуючий фіброз може бути летальним, таким, що викликає одночасну недостатність багатьох органів, наприклад, нирок. Дані як передклінічних, так і клінічних випробувань вказують на те, що TGF-бета 1 є головним сприяючим фактором відкладення матричного білка у разі інтерстиціального фіброзу і залучений до започаткування і розвитку цілого ряду пов'язаних із ним фіброзних хворобливих станів, у тому числі фіброзу нирок, який є спільним для усіх форм хронічної хвороби нирок (CDR). Ступінь фіброзу нирок позитивно корелює з розвитком хронічної недостатності нирок (CRF, відомої також як термінальна стадія ниркової недостатності (ESRD)), наслідком якої може бути хронічний діаліз або трансплантація нирок і смерть. TGF-бета 1 є цитокіном, який у дослідах на людях і тваринах найпослідовніше зв'язаний як експериментально, так і супровідно, з такими фіброзними процесами. Сильний вплив TGF-бета 1 на ЕСМ, у тому числі його роль у стимуляції синтезу і пригнічення розкладу компонентів позаклітинного матриксу, були предметом численних оглядових робіт (дивись, наприклад, Рокко (Rocco), Зьяде (Ziyadeh), 1991, у Contemporary Issues in Nephrology, том 23, "Hormones, autocoids and the kidney" Ed. Jay Stein, Churchill Livingston, New York, стор. 391-410; Роберте (Roberts) та інші, 1988, Rec. Prog. Hormone 93201 54 Res., 44:157-197). TGF-бета 1 може індукувати накопичення ЕСМ численними і сукупними шляхами, наприклад, TGF-бета 1 стимулює експресію мРНК і продукування білка ключових компонентів ЕСМ, у тому числі колагену типу І, колагену типу IV, фібронектину і ламініну (Шарма (Sharma), Зьяде (Ziyadeh), 1997, Semin. Nephrol., 17:80-92). У той самий час, TGF-бета 1 перешкоджає розкладу ЕСМ шляхом пригнічення продукування протеаз (наприклад, активатора плазміногену, колагенази, еластази і стромелізину), які розщеплюють матрикс, і шляхом активування інгібіторів цих протеаз, наприклад, тканинних інгібіторів металопротеїназ та інгібітора активатора плазміногену 1 (Шарма (Sharma), Зьяде (Ziyadeh), 1995, Kidney Int., 51:S34-S36). TGF-бета 1 також активує інтегрини і поверхневоклітинні рецептори ЕСМ, тим самим підсилюючи здатність клітин до взаємодії зі специфічними білками ЕСМ (Гейно (Неіnо) та інші, 1989, J. Biol. Chem., 264:380-388). На додаток до цього, TGF-бета 1 має сильну хемотаксичну властивість притягувати клітини ЕСМ, наприклад, фібробласти і фагоцити (Рейбман (Reibman) та інші, 1991, PNAS, 88:6805-6809). Більш того, TGF-бета 1 має специфічну здатність до індукування своєї власної експресії, що значно посилює атипові фіброзні процеси (Кім (Кіm) та інші, 1990, Mol. Cell Biol., 10:1492-1497). TGF-бета 1 є залучений до наведених нижче захворювань, синдромів та/або станів: Захворювання нирок - наприклад, хронічна хвороба нирок (CRD); хронічна ниркова недостатність (CRF); термінальна стадія ниркової недостатності (ESRD); гломерулонефрит (GN), у тому числі, наприклад, мезангіальний проліферативний гломерулонефрит, мезангіокапілярний гломерулонефрит, мембранозний гломерулонефрит, вогнищевий і сегментарний гломерулонефрит, імунний гломерулонефрит, півмісяцевий гломерулонефрит; гломерулосклероз; нефросклероз, мембранозна нефропатія, хвороба Берже; нирковий інтерстиціальний фіброз; вогнищевий сегментарний гломерулосклероз, нирковий фіброз у хворих, яким зробили пересадку, які одержують циклоспорин; хронічне відторгнення ниркового трансплантата; ВІЛ-пов'язана нефропатія; гіпертрофія клітин ниркового епітелію; тубулоінтерстиціальний фіброз, що супроводжує хронічні захворювання нирок, у тому числі фіброз, що є наслідком непрохідності сечових шляхів, нефропатія, пов'язана із застосуванням аналгезивних засобів, або фіброз після нападу гострої ниркової недостатності, наприклад, гострої ниркової недостатності, що є наслідком ішемії нирок (Спурджон (Spurgeon) та інші, Am. J. Physiol. Renal Physiol., 288:F568-F577, 2005); тромботична мікроангіопатія нирок, наприклад, пов'язана з, наприклад, пошкодженням клітин гломерулярного ендотелію або з іншими пошкодженнями клітин капілярного ендотелію, наприклад, пов'язаними з прееклампсією, ендотоксемією та радіоактивним опроміненням; васкуліт нирок; вогнищевий некротизуючий гломерулонефрит; діабетична нефропатія [TGF-бета пов'язується з CRF складними і різноманітними явищами, які впливають на більшість клітин нирок (Боттінгер (Bottinger), 2002, J. 55 Am. Soc. Nephrol., 13, 2600). Наслідком цих явищ, зрештою, є як тубулоінтерстиціальний фіброз, так і гломерулосклероз, які ведуть до втрати функції нефронів і, зрештою, хронічної ниркової недостатності. З-посеред трьох ізоформ TGF-бета, TGFбета 1 видається такою, що домінує у опосередкуванні розвитку хронічної хвороби нирок не лише тому, що є найпоширенішою експресованою ізоформою, але також і тому що, як видається, як TGF-бета 2, так і TGF-бета 3 опосередковують свої ефекти шляхом активування експресії TGFбета 1 (Ю (Yu), 2003, Kid. Int., 64, 844). Як in vitro, так і in vivo дослідження припускають причетність TGF-бета 1 до патогенезу діабетичної хвороби нирок, у тому числі ускладнень, пов'язаних із цукровим діабетом типу 1 або типу 2, наприклад, гломерулосклерозу та тубулоінтерстиціального фіброзу (Зьяде (Ziyadeh), 1998, Cur. Pract. Med., 1:8789). Антисироватка проти TGF-бета є ефективною при лікуванні гломерулонефриту (Бордер (Border) та інші, 1990, Nature, 346:371-374)]; фіброзна хвороба нирок [TGF-бета 1 опосередковує ниркову клітинну гіпертрофію, іншу характеристику діабетичної нефропатії, втручанням до нормальної регуляції клітинного циклу шляхом індукування циклінзалежних інгібіторів кіназ, наприклад, p27Kip1 та p21Cip1 (Вулф (Wolf), Зьяде (Ziyadeh), 1999, Kidney Int., 56:393-405). Рівень цих інгібіторів також підвищується високим рівнем глюкози і діабетичним станом (Вулф (Wolf) та інші, 2001, Am. J. Pathol, 158:1091-1100; Вулф (Wolf) та інші, 1999, Diabetologia, 42:1425-1432; Вулф (Wolf) та інші, 1997, Am. J. Physiol., 273:F348-F356). Вони пригнічують активність циклінзалежних кіназ, головним чином, циклінзалежної кінази 2/циклінкінази Ε (Лю (Liu), Прейсіг (Preisig), 1999, Am. J. Phusiol., 277:F186-F194), що веде до пригнічення фосфорилування ретинобластомного білка і зупинки розвитку клітинного циклу на пізній стадії G1. Клітина вступає до періоду синтезу білка без реплікації ДНК і зазнає гіпертрофії. Таким чином, TGF-бета 1 спричинює зміни на клітинному рівні, які проявляються у патофізіологічних особливостях діабетичної нефропатії]; експериментальна діабетична нефропатія; гілертензивний нефросклероз [Оскільки структура і фільтраційні властивості клубочків значною мірою визначаються складом позаклітинного матриксу мезангію і гломерулярної мембрани, не викликає подиву те, що TGF-бета 1 сильно впливає на нирки. TGF-бета 1 опосередковує патологічні зміни діабетичної хвороби нирок (Зьяде (Ziyadeh), 1998, Cur. Prac. Med., 1:87-89). Накопичення мезангіального матриксу у разі проліферативного гломерулонефриту (Бордер (Border) та інші, 1990, Kidney Int., 37:689-695) та діабетичної нефропатії (Мауер (Mauer) та інші, (1984), J. din. Invest., 74:1143-1155) є чітко вираженими та переважаючими патологічними особливостями згаданих захворювань. Рівні TGF-бета 1 підвищені у разі діабетичного гломерулосклерозу людей (задавнена невропатія) (Ямамото (Yamamoto) та інші, 1993, Proc. Natl. Acad. Sci., 90:1814-1818). На ряді тваринних моделей було встановлено також, що TGF-бета 1 є важливим посередником у генезі фіброзу нирок (Фан (Phan) та інші, 1990, Kidney 93201 56 Int., 37:426; Окуда (Okuda) та інші, 1990, J. Clin. Invest., 86:453). У пацюків було продемонстровано пригнічення експериментально індукованого гломерулонефриту за допомогою антисироватки проти TGF-бета (Бордер (Border) та інші, 1990, Nature, 346:371) та білка позаклітинного матриксу, декорину, який може зв'язувати TGF-бета 1 (Бордер (Border) та інші, 1992, Nature, 360:361-363; дивись також, наприклад, Бордер (Border), Нобл (Noble), 1994, N. Engl. J. Med., 331:1286-1292; Бордер (Border) та інші, 1989, Semin. Nephrol., 9:307-317; Хан (Han) та інші, 2000, Am. J. Phusiol. Renal Phusiol., 278-.F628-F634; та Зьяде (Ziyadeh) та інші, 2000, PNAS, 97:8015-8020)]. Унаслідок цього, зв'язувальна композиція за цим винаходом може бути придатною для лікування, полегшення інтенсивності симптомів, модулювання, діагностування та/або пригнічення захворювання, розладу, синдрому та/або стану, як описано вище. Захворювання печінки - наприклад, цироз; фіброз печінки; [фіброз печінки є звичайною реакцією на гепатоцелюлярний некроз або пошкодження, яке може індукуватись найрізноманітнішими агентами, наприклад, будь-яким процесом, що порушує гомеостаз печінки (зокрема, запалення, токсичне пошкодження або зміна печінкового кровотоку) та інфекціями печінки (вірусними, бактеріальними, грибковими і паразитарними). Численні хвороби накопичення, що є наслідком вроджених порушень метаболізму, часто пов'язують із фіброзом, у тому числі порушення екскреції ліпідів (хвороба Гоше); порушення обміну глікогену (зокрема, типи III, IV, VI, IX та X); дефіцит інгібітора трипсину-1; накопичення екзогенних речовин, як спостерігається у разі синдрому надлишкового накопичення заліза і порушення метаболізму міді (хвороба Вільсона-Коновалова); накопичення токсичних продуктів обміну речовин (як у разі тирозинемії, фруктоземії та галактоземії); і розлади, спричинені функціональною недостатністю пероксисом (синдром Цельвегера). Численні хімічні речовини і лікарські засоби спричинюють фіброз, зокрема, алкоголь, метотрексат, ізоніазид, оксифенізатин, метилдофа, хлорпромазин, толбутамід та аміодарон. Порушення кровообігу печінки (наприклад, хронічна серцева недостатність, синдром Бадда-Кіарі, первинний тромбоз печінкових вен, тромбофлебіт ворітної вени) і хронічне утруднення виділення жовчі можуть призвести до фіброзу. І, нарешті, вроджений фіброз печінки є автосомним рецесивним пороком розвитку. Більшість людей у світі страждає на хронічний вірусний гепатит або стеатогепатит, пов'язаний з алкоголем або ожирінням, однак інші ураження, які індукують фіброз, включають, наприклад, паразитарні захворювання (наприклад, шистосомоз), автоімунну реакцію на гепатоцити або біліарний епітелій, хворобу печінки новонароджених, метаболічні порушення, у тому числі гемохроматоз Вільсона і цілий ряд хвороб накопичення, хронічні запальні стани (наприклад, саркоїдоз), токсичність лікарських засобів (наприклад, метотрексату або гіпервітаміноз А) та судинні розлади, вроджені або набуті. 57 Зірчасті клітини печінки (HSC) є важливим клітинним джерелом ЕСМ у разі фіброзу печінки (Лі (Li), Фрідман (Friedman), 1999, J. Gastroenterol. Hepatol, 14:618-633). HSC знаходяться у перисинусоїдальному просторі Діссе, який відокремлює гепатоцити від синусоїдального ендотелію. Пошкодження печінки, як було описано, активують неактивні за нормальних умов HSC, наслідком чого є їх подальша проліферація і активація. Активовані HSC зазнають подальшої фенотипової трансдиференціації з перетворенням на скоротливі міофібробласти (MFB), які експресують актин гладеньких м'язів і надлишок молекул ЕСМ, що спостерігаються у разі фіброзу печінки. Трансдиференціація HSC у MFB обумовлюється надекспресією TGF-1 у ролі ключового регулятора фіброзної реакції печінки на стрес та пошкодження (Гресснер (Gressner) та інші, 2002, Front Biosci., 7:d793-807). TGF-1 є найсильнішим відомим індуктором фіброгенезу у ефекторних клітинах фіброзу печінки (Шуппан (Schuppan) та інші, 2003, Cell Death Differ., 10 Supl 1:S59-67). Відповідним чином, рівні активного TGF-1 у тканинах і сироватці у разі фіброзу печінки є підвищеними і було показано, що надекспресія TGF-1 у трансгенних мишей і застосування екзогенного TGF-1 індукують фіброз органів (Канцлер (Kanzler) та інші, 1999, Am. J. Physiol., 276:G1059-68; Сандерсон (Sanderson) та інші, 1995, PNAS, 2572-2576). На додаток до цього, експериментальний фіброз може пригнічуватись лікарськими засобами, спрямованими проти TGF1, наприклад, нейтралізуючими антитілами або розчинними рецепторами TGF (Джордж (George) та інші, 1999, PNAS, 12719-12724; Кі (Qi) та інші, 1999, PNAS, 2345-2349). Експресія TGF-1 активованими HSC/MFB, що спостерігається, активність TGF-1 щодо позитивної регуляції експресії ЕСМ і експресія рецепторів TGF на HSC призвели до створення загальноприйнятої моделі, за якою постійна авто-/паракринна стимуляція активованих HSC/MFB TGF-1 є ключовою фіброгенною реакцією, що сприяє фіброзу органів. Унаслідок цього передбачається, що зниження рівня TGF-1 забезпечить ослаблення фіброгенезу печінки (By (Wu), Зерн (Zern), 2000, J. Gastroenterol., 35:665672)]. Захворювання легень - наприклад, фіброз легень (Гірі (Giri) та інші, Thorax, 48, 959-966, 1993); ідіопатичний фіброз легень; синдром дихальної недостатності дорослих; криптогенна пневмонія, облітеруючий бронхіоліт (ВО), облітеруючий бронхіоліт (пов'язаний з трансплантацією); захворювання легень, спричинене лікарськими засобами; захворювання легень, спричинене опроміненням; фіброз, локалізований довкола повітроносних шляхів при астмі та емфіземі; алергійний альвеоліт; криптогенна пневмонія (СОР); хронічне обструктивне захворювання легень (COPD); гострий інтерстиціальний пневмоніт (АІР); азбестоз; інтерстиціальний фіброз легень, пов'язаний з автоімунними розладами, наприклад, системним червоним вовчаком і склеродермією, контактом із хімічними речовинами або алергіями; астма; хронічне захворювання легень новонароджених (CLD) [Розрегу 93201 58 льована експресія TGF-1 відіграє важливу роль у патогенезі атипового розвитку повітроносних шляхів у разі ряду хронічних захворювань легень, у тому числі астми, фіброзу легень та хронічного захворювання легень новонароджених (CLD) (Холгейт (Holgate) та інші, 2001, Int. Arch. Allergy Immunol, 124 1-3:253-258; Халіл (Khalil) та інші, 2001, Thorax, 56 12:907-915; Лекарт (Lecart) та інші, 2000, Biol. Neonate., 77 4:217-223; Пуллін (Pulleyn) та інші, 2001, Hum. Genet., 109 6:623-627; Сагара (Sagara) та інші, 2002, J. Allergy Clin. Immunol, 110 2:249-254; Шеппард (Sheppard), 2001, Chest, 120 1 Supp1:49S-53S; Стрітер (Strieter), 2001, Chest, 120 1 Supp:77S-85S; Тоті (Toti) та інші, 1997, Pediatr. Pulmonol, 24 1:22-28). Наслідком надекспресії активного TGF-1 вздовж альвеолярних поверхонь у мишей є надзвичайно сильна фіброзна реакція і пригнічення TGF-1 антитілами або рецепторами-принадами пригнічує фіброз, індукований блеомідином (Келлі (Kelly) та інші, 2003, Cur. Pharm. Des., 9:3949). Більш того, аналіз впорядкованих мікропослідовностей тотальної легеневої мРНК показує, що більшість відомих TGF-1-індуцибельних генів активується під час фіброзу, індукованого експериментальним шляхом (Камінскі (Kaminski) та інші, 2000, PNAS, 97:1778-1783)]. Захворювання серцево-судинної системи атеросклероз; [TGF- асоціюється з атеросклерозом (дивись, наприклад, Т.А. Маккафрі (ТА. McCaffrey): 2000, "TGF-s and TGF- Receptors in Atherosclerosis" Cytokine and Growth Factor Reviews 11:103-114)]; гіпертрофічним розвитком серця (Шульц (Schultz) та інші, 2002, J. Clin. Invest, 109 (6): 787-796; Бранд (Brand), Шнейдер (Schneider), 1995, J. Mol. Cell Cardiol, 27:518); прогресуючим системним склерозом [паралельно з одночасним підвищенням рівнів TGF-1 у старіючій судинній сітці відбувається явно виражене підвищення рівнів фібронектину (Лі (Li) та інші, 1999). Ці зміни, безсумнівно, сприяють зсуву еластичних судин у бік фіброзних/жорстких судин]; фіброзом капілярів, індукованим механічним шляхом; саркоїдозом; вентрикулярним фіброзом; ішемічною хворобою серця, індукованою опроміненням [повідомляли про значно вищий рівень смертельної небезпеки унаслідок ішемічної хвороби серця у хворих, яких піддають опроміненню з приводу хвороби Ходжкіна та раку молочної залози. Певні цитокіни та фактори росту, наприклад, TGF-1, можуть стимулювати проліферацію ендотелію, індуковану опроміненням, проліферацію фібробластів, відкладення колагена і фіброз, що веде до генералізованих пошкоджень у разі атеросклерозу]; пошкодженням артерій (Вулф (Wolf) та інші, 1994, J. Clin. Invest., 93, 1172-1178); хронічною венозною недостатністю (CVI); рестенозним ураженням після черезшкірної транслюмінальної ангіопластики коронарних судин (РТСА) або введення стенту; синдромом Германскі-Пудлака; поліміозитом; склеродермією; дерматоміозитом; еозинофільним фасцитом; кільцеподібною склеродермією або склеродерміями, пов'язаними із синдромом Рейно; периваскулярним фіброзом інтрамуральної коронарно-судинної сітки серцевого м'яза, який не 59 зазнав інфаркту; гіперплазією, індукованою пошкодженням, наприклад, рестенозом; атеросклеротичним фіброзом із колагеновою хворобою судин [TGF-1 може бути фактором у разі прогресуючого потовщення артеріальної стінки, що є наслідком проліферації клітин гладеньких м'язів і відкладення позаклітинного матриксу у артерії після ангіопластики із застосуванням балонного катетера. Діаметр артерії, що зазнає рестенозу, може бути зменшеним на 90% унаслідок згаданого потовщення, і оскільки більша частина зменшення діаметра обумовлюється скоріше позаклітинним матриксом, аніж тілами клітин гладеньких м'язів, може існувати можливість відкриття цих судин до 50% простим зниженням екстенсивного відкладення позаклітинного матриксу. У непошкоджених артеріях свиней, трансфікованих in vivo геном TGF-1, експресія гена TGF-1 асоціювалась як із синтезом позаклітинного матриксу, так і з гіперплазією (Набел (Nabel) та інші, 1993, PNAS, 90:1075910763)]; гістіоцитоз X (еозинофільна гранульома). Фібрози м'яких тканин - (Бордер (Border), Руослаті (Ruoslahti), 1992, J. Clin. Inv., 90:1-7; Бордер (Border), Нобл (Noble), 1994, N. Engl. J. Med., 331:1286-1291); порушення ерекційної функції (Морланд P. (Moreland R.), 1998, Int. J. Impot. Res., 10:113-120); ревматоїдний артрит (Валь (Wahl) та інші, 1993, J. Exp. Medicine, 177, 225-230). Загоювання ран - рубцювання шкіри; опік; гіпертрофічне рубцювання; утворення келоїду; рубцювання кон'юнктиви (Кордейро М.Ф. (Cordeiro M.F.), 2003, Clin. Sci. (Lond)., 104(2): 181-187) [Обробка ран плода TGF-1 з різними концентраціями викликала явно виражене рубцювання цих ран, що демонструє безпосереднє залучення TGF-1 до рубцювання шкіри (Салліван (Sullivan) та інші, 1995, J. Pediatr. Surg., 30:198-203). Було показано, що нейтралізація TGF-1 антитіл, які вводили у края ран, що загоювались, у пацюків пригнічувала рубцювання без впливу на швидкість загоювання ран або межу міцності ран на розтягування. У той самий час спостерігалось зниження швидкості ангіогенезу, знижена кількість макрофагів і моноцитів у рані і зменшена кількість невпорядкованого відкладення колагенового волокна у рубцевій тканині (Шах (Shah) та інші, 1992, Lancet, 339:213-214; Шах (Shah) та інші, 1994, J. Cell Science, 107:11371157; Шах (Shah) та інші, 1995, J. Cell Sci., 108:985-1002). Ослаблена реакція рубцювання спостерігається у ранах мишей, які піддають місцевій обробці антисмисловим TGF-1 (Чоі (Choi) та інші, 1996, Immunol. Cell Biol., 74:144-150). Місцеве застосування синтетичного антагоніста TGF1 знижувало швидкість рубцювання опіків та різаних ран у свиней, а також розрізів шкіри у кролів (Хуанг (Huang) та інші, 2002, FASEB J., 16:12691270; Вернер (Werner), Грос (Grose), 2003, Physiol. Rev., 83(3): 835-870)]. Запальне захворювання - запальна хвороба кишечнику (IBD), наприклад, хвороба Крона (CD) і виразковий коліт (UC) [запалення кишечнику залежить від балансу між активністю запальних цитокінів, зокрема, IFN-, та TGF-1 (Стробер (Strober) та інші, 1997, Immunol. Today, 18:61-64; Нурат (Neurath) та інші, 1996, J. Exp. Med., 183, 93201 60 2605-2616; Лудвікссон (Ludviksson) та інші, 1997, J. Immunol., 159; Боріван (Boirivant) та інші, 1998, J. Exp. Med., 188, 1929-1939; Поурі (Powrie) та інші, 1996, J. Exp. Med., 183, 2669-2674). Імунологічно опосередковане пошкодження тканин у кишечнику пов'язується з підвищеним продукування передзапальних цитокінів, які активують фактор транскрипції NF каппа-В у цілого ряду клітин різних типів]; ревматоїдний артрит (RA); гіперплазія синовіальної оболонки суглоба [у разі ревматоїдного артриту у людей, рівень TGF-1 у синовіальній рідини підвищений (Лоц (Lotz) та інші, 1990, J. Immunol, 144:4189-4194). Надлишок TGF-1 утворює болючі кісткові вирости на суглобах, які називають остеофітами (ван Бунинген (van Beuningen) та інші, 1994, Lab. Invest, 71:279-290), спричинює гіперплазію синовіальної оболонки суглобів і викликає запалення у разі ревматоїдного артриту (Гамільтон (Hamilton) та інші, 1991, PNAS, 88:7180-7184). Наслідком пригнічення ендогенного TGF-1 на мишачій моделі артриту було запобігання утворення остеофітів і погіршення відновлення хряща, що дозволяє припустити його роль у цих патологічних явищах (Шарстул (Scharstuhl) та інші, 2002, Immunol, 169:507-514)]. Клітинно-проліферативні захворювання - Численні дані демонструють, що TGF-1 не лише має трансформуючий потенціал, але може також стимулювати розвиток, прорастания і метастазування злоякісних пухлин як in vitro, так і in vivo (Дерінк (Derynck) та інші, 2001, Nat. Genet., 29:117-129; Ki (Cui) та інші, 1996, Cell, 86:531-542). Приклади гіперпроліферативних захворювань, розладів, синдромів та/або станів включають, наприклад, без обмеження, пухлину товстої кишки, черевної порожнини, кістки, молочної залози, травної системи, печінки, підшлункової залози, очеревини, ендокринної системи (наприклад, надниркової залози, паращитовидної залози, гіпофіза, яєчок, яєчника, вилочкової залози або щитовидної залози), ока, голови, шиї, нервової системи (центральної або периферичної), лімфатичної системи, таза, шкіри, селезінки, грудної клітини та сечо-статевої системи). Подібним же чином інші гіперпроліферативні стани включають, наприклад, без обмеження, гіпергаммаглобулінемію, лімфопроліферативні стани, парапротеїнемії, пурпуру, саркоїдози, гамартому, синдром Сезарі, макроглобулінемію Вальденстрьома, хворобу Гоше, гістіоцитоз та інші гіперпроліферативні стани. Незважаючи на пухлинопригнічувальну активність TGF-1, пухлинні клітини часто демонструють підвищене продукування цього фактора росту (Дерінк (Derynck) та інші, 1987, Cancer Res., 47:707-712; Діксон (Dickson) та інші, 1987, PNAS, 84:837-841), і значний обсяг даних документально підтверджує його пухлиностимулювальну роль завдяки його впливу на прорастания пухлинних клітин і зміни у мікрооточенні пухлини. Зараз очевидним є той факт, що TGF-1 може відігравати роль як супресора пухлини, так і суттєвого стимулятора розвитку, прорастания та метастазування пухлини. На ранніх стадіях онкогенезу, наприклад, коли пухлина все ще залишається доброякісною, TGF- впливає безпосередньо на ракову клітину